Name: facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

이 연구는 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2020A0505100062), 광저우시 과학 기술 핵심 주제 프로젝트 (보조금 번호 201904020025), 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 31872800, 32070582, 82101937), 광저우시 박사후 연구 보조금 프로젝트 (Bangzhu Chen)의 지원을 받았다.

이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 광저우 의과 대학 세 번째 부속 병원 윤리위원회 (의료 및 윤리 검토 [2021] No. 022)의 승인이 부여되었습니다. 실험 전에, 각 배지는 Juergen A. Knoblich사의 화학식12 (보충 표 1-4)에 따라 제조되거나, 시판되는 대뇌 오가노이드 키트를 사용하였다 ( 표 참조). 이 연구에 사용 된 iPSC는 이전에 우리 실험실에서 ?...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week.">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).</li><li>Jung, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-stop+microfluidic-based+lung+cancer+organoid+culture+platform+for+testing+drug+sensitivity.">A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity.</a> Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).</li><li>Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+three-dimensional+organoids+and+lung-on-a-chip+methods+to+study+lung+development,+regeneration+and+disease.">Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease.</a> The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).</li><li>Ye, Y., Pui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nanoparticles+suspended+in+a+light+scattering+medium.">Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).</li><li>Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Gr&#248;nlie, I., Tho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+tyndall+effect+for+enhanced+visual+detection+of+particles+in+compatibility+testing+of+intravenous+fluids:+Validity+and+reliability.">Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability.</a> PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).</li><li>Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+initial+cell+distribution+by+secondary+flow+of+medium+improves+cell+culture+efficiency.">Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency.</a> PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+deletion+of+polyglutamine+in+spinocerebellar+ataxia+type+3-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).</li><li>Xian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+effectiveness+of+genetically+corrected+iPSCs+derived+from+&#946;-thalassaemia+patients+in+nonmyeloablative+&#946;-thalassaemic+mice.">The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from &#946;-thalassaemia patients in nonmyeloablative &#946;-thalassaemic mice.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).</li><li>Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Knight, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+induction+of+singular+neural+rosette+emergence+within+hPSC-derived+tissues.">Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues.</a> eLife. 7, 37549 (2018).</li><li>Rieder, H. L., Smithwick, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPM+or+RCF.">RPM or RCF.</a> The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).</li><li>Dole, V. P., Cotzias, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomogram+for+the+calculation+of+relative+centrifugal+force.">A nomogram for the calculation of relative centrifugal force.</a> Science. 113 (2941), 552-553 (1951).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Kathuria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+and+functional+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebral+organoids+in+schizophrenia.">Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia.</a> JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Tang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSCAM/PAK1+pathway+suppression+reverses+neurogenesis+deficits+in+iPSC-derived+cerebral+organoids+from+patients+with+Down+syndrome.">DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).</li><li>Costa, M., Paulson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+understanding+Machado-Joseph+disease.">Toward understanding Machado-Joseph disease.</a> Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Klockgether, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+axonal+neuropathy+in+spinocerebellar+ataxia+type+3/Machado-Joseph+disease+(SCA3/MJD).">Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).</li><li>Khan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+polyglutamines+impair+synaptic+transmission+and+ubiquitin-proteasome+system+in+Caenorhabditis+elegans.">Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).</li><li>Teixeira-Castro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+signalling+suppresses+ataxin+3+aggregation+and+neurotoxicity+in+animal+models+of+Machado-Joseph+disease.">Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease.</a> Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).</li><li>Joers, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+abnormalities+in+premanifest+and+early+spinocerebellar+ataxias.">Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias.</a> Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).</li><li>Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+phenotypically+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).</li><li>Sivitilli, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li><li>Camp, J. G., Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+development:+Advances+in+mini-brain+technology.">Human development: Advances in mini-brain technology.</a> Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+human+cortical+organoid+generation.">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li></ol>

대뇌 오가노이드는 의학 연구를위한 새로운 길을 열어줍니다. 이 기술의 많은 유용한 응용은 단지 탐구되기 시작했다28. 이 연구는 유전적으로 병든 대뇌 오가노이드와 정상 뇌 오가노이드의 전사체 시퀀싱 결과가 질병과 건강의 차이를 반영할 수 있음을 발견했다. 예를 들어, RNA-seq 데이터 분석 결과(도 3B)는 SCA3 질환 29,30,31,32에 대한 많은 보고된 연구와 일치<s...

2차원(2D) 배양 시스템과 비교하여, 3차원(3D) 배양 시스템은 특정 장기의 복잡한 구조의 진정한 복제 및 효율적인 재생을 포함하여 몇 가지 장점을 갖는다1. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌 발달 및 질병2, 약물 스크리닝 및 세포 치료의 연구 분야에서 중요한 보조 방법 중 하나입니다.
회전 현탁액 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 배양하는 것은 그들의 발달과 성숙에 도움이됩니다3. 대뇌 오가노이드 배양 시스템은 큰 성공을 거두었지만 여전히 적용을 제한하는 중대한 도전에 직면 해 있습니다. 예를 들어, 수동 재배는 복잡한 조작 단계를 포함하며 대규모 응용 프로그램을 달성하는 데 장애물을 초래합니다. 또한, 대뇌 오가노이드 배양의 각 발달 단계에서, 상이한 배지 및 사이토카인의 변화가 필요하다4. 그러나 초기 단계에서 오가노이드 또는 EB는 작은 크기 (약 200 μm ~ 300 μm)를 가지며 적절한 장치 없이는 거의 시각적으로 접근 할 수 없습니다. 필연적으로, 일정량의 귀중한 오가노이드 샘플은 배지가 변경될 때 플러시됩니다. 다른 종류의 오가노이드 배양에서 이것을 극복하기 위해 많은 기술이 탐구되었으며, 일부 예에는 개입없이 3 일 동안 전체 오가노이드 칩을 배양 배지에 침지하는 것이 포함됩니다5; 오래된 배지가 흡수성 종이를 사용하여 흡수된 후에 커버슬립을 통해 신선한 배지를 첨가하는단계(5); 또는 유체 교환을 위해 복잡한 미세 유체 파이프 라인을 적용 6,7,8. 오가노이드 재배의 초기 단계에서 직면 한 또 다른 장애물은 육안으로 직접 관찰을 달성하기가 어렵 기 때문에 오가노이드 전달 단계 중에 오가노이드 손상 및 손실을 초래하는 불량한 작동을 유발할 수 있습니다. 따라서, 오가노이드를 생성하기 위해 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게하는보다 실현 가능한 프로토콜을 수립 할 필요가있다.
이러한 문제를 극복하기 위해 엔지니어링 원칙에 기반한 해당 최적화 된 작업이 제안되어 많은 오가노이드 절차가 상당히 편리하게 용이합니다. 자연에서 태양이 창문 틈을 통해 집에 비추면 육안으로는 광선에서 춤추는 먼지를 볼 수 있습니다. 먼지에 햇빛이 확산되어 반사되기 때문에 일부 빛은 안구로 굴절되어 시각적 이미지를 생성합니다. 이 현상 9,10의 원리에서 영감을 얻은 이 연구는 부드러운 조명 램프를 만들고 EB를 옆으로 비췄습니다. EB는 시야 범위에 영향을 미치지 않고 시각적으로 명확 할 수 있음을 발견했습니다. 중심을 가리키는 이차 흐름은 와류(11)로 인해 배양 플레이트를 회전시킴으로써 액체에서 생성된다. 원래 분산된 EB는 플레이트의 중앙에 축적됩니다. 이를 바탕으로, 오가노이드의 침강 속도가 세포의 침강 속도보다 빠르다는 현상이 있으며, 원심분리 없이 배지 변경 및 오가노이드 이송이 용이한 조작방법이 제안된다. 배양 배지 내의 오가노이드는 이러한 전달 조작을 통해 자유 세포 및 죽은 세포 단편으로부터 효과적으로 분리될 수 있다.
여기서, 조작하기 쉬운 프로토콜이 인간 다능성 줄기 세포로부터 대뇌 오가노이드를 생성하도록 제안된다. 운영 기술은 엔지니어링 원리를 적용하여 최적화되었으며, 3D 문화에서의 작업을 2D 문화에서처럼 간단하고 실현 가능하게 만들었습니다. 향상된 액체 교환 방법 및 오가노이드 전달 작동은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Filter</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>331001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8057400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well low adhesion plate</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>703011</td>
			<td>It is used for EBs suspension cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aaccute cell detachment solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07920</td>
			<td>It is used to digest iPSC into single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell800 24-well</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>34811</td>
			<td>Microporous culture plate for EBs preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07010</td>
			<td>Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-vit. A supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>GMP100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>ST025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>10212020C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-quality FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>General Electric Company, USA</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A609764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY&#160; secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150120</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>DS-H200</td>
			<td>Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel will solidify in the environment higher than 4 &#176;C, so it should be sub packed at low temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>Host: Rabbit. Dissolve with 500 &#956;L PBS. Use at 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathological frozen slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab78545</td>
			<td>Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>37350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC dissociation solution</td>
			<td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td>
			<td>CA3001500</td>
			<td>Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>A16518</td>
			<td>Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft light lamp</td>
			<td>NUT</td>
			<td>NUT</td>
			<td>A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8570</td>
			<td>Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8571</td>
			<td>Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A510146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>72302</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 &#181;L of PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weblink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw sequencing data</td>
			<td>Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics &#38; Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GSA-Human: HRA002430</td>
			<td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination

현재 대뇌 오가노이드 배양 기술은 여전히 운영이 복잡하고 대규모로 적용하기가 어렵습니다. 간단하고 실용적인 해결책을 찾아야합니다. 따라서, 본 연구에서 보다 실현 가능한 대뇌 오가노이드 프로토콜이 제안된다. 초기 단계에서 중간 변화 및 오가노이드 전달의 피할 수없는 불편 함을 해결하기 위해 현재 연구는 엔지니어링 원칙을 적용하여 운영 기술을 최적화합니다. 배아체(EB) 샘플을 측면으로 비추기 위해 소프트 라이트 램프를 채택하여 EB를 향상된 확산 반사 효과를 통해 육안으로 볼 수 있도록 했습니다. 회전에 의해 생성 된 이차 흐름의 원리를 사용하여, 오가노이드는 우물의 중심을 향해 모여 중간 변화 또는 오가노이드 전달의 작동을 용이하게합니다. 분산 된 세포와 비교할 때, 배아체는 피펫에서 더 빨리 정착합니다. 이 현상을 사용하면 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편을 간단한 방법으로 효과적으로 제거 할 수있어 EB가 원심분리로 인한 손상을 입지 않도록합니다. 이 연구는 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다.

본 연구는 iPSCs(도 2B)를 대뇌 오가노이드로 유도하였다(도 2C). 초기 단계에서 재배된 EB는 OCT4 마커(그림 2A)를 나타내었으며, 이는 양호한 다능성을 나타냈다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다 (그림 2D). 이 연구는 정상적인 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSC를 대뇌 오가노이드로 배양?...

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.

측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

이 프로토콜은 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다. 초기 단계의 오가노이드는 많은 작업에 편리한 측면 소프트 라이트 램프를 사용하여 육안으로 볼 수 있습니다. 향상된 배지 변경 방법 및 오가노이드 전달 작업은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.시작하기 위해, iPSCs를 35 밀리미터 페트리 디쉬로 덮인 마트리겔에서 mTeSR1 배지로 배양하고 매일 배지를 변경한다. iPSC 성장 밀도는 75%를 초과하지 않아야 하며, 이어서, iPSCs로부터 mTeSR1 배지를 피펫팅하고 이를 PBS 1밀리미터로 두 번 세척한다. PBS를 피펫팅한 후, 300 마이크로리터의 세포 분리 용액을 첨가하여 iPSCs를 섭씨 37도에서 3 내지 네 분 동안 단일 세포로 소화시킨다.나중에, 세포를 두 밀리미터의 EB 형성 배지에 재현탁시키고, 샘플을 300배 g에서 5분 동안 원심분리한다. 전문화 된 24 웰 플레이트를 웰 당 500 마이크로 리터의 부착 방지 헹굼 용액으로 5 분 동안 처리하십시오. 이제, 세포를 Rho 키나제 억제제 Y27632를 함유하는 EB 형성 배지에 재현탁시킨다.순응 방지 헹굼 용액을 제거한 후, 두 밀리리터의 EB 형성 매질로 각 웰을 헹구십시오. 다음으로, 세포를 웰 당 여섯 번째 세포에 세 번 10의 밀도로 전문화된 24 웰 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2분 동안 100배 g에서 원심분리한다. 플레이트의 바닥에있는 각 챔버에 세포를 균일하게 분배하십시오.샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리가 이전 단계에서 사용되지 않은 경우, 36시간 동안 인큐베이션하고 샘플을 안정적으로 유지한다. A5 용지 크기의 두께가 0.3 ~ 0.5cm인 투명 아크릴 보드를 사용하고 아크릴 판의 앞면과 뒷면에 흰색 패드를 붙여 넣으십시오.그런 다음 아크릴 판의 측면에서 조명이 들어갈 수 있도록 플레이트 가장자리에 LED 흰색 조명 행을 설치 한 다음 병렬로 쏠 수 있습니다. 이제 새로운 여섯 개의 우물 낮은 접착 플레이트를 준비하고 각 웰에 두 밀리리터의 EB 형성 배지를 추가하십시오. 1000 마이크로리터의 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 배지와 함께 EB를 제거한 후, 웰당 약 100개의 EB를 여섯 개의 웰 저 접착 플레이트로 옮깁니다.EB 형성 배지를 매일 동일한 부피의 신선한 배지로 교체하려면 접시를 원형 궤도를 따라 회전시켜 소용돌이 흐름을 유도하십시오. EB 또는 오가노이드는 회전을 통해 생성 된 이차 흐름으로 인해 우물의 중심으로 수렴합니다. 우물의 가장자리로 천천히 파이프하여 오래된 매체를 흡인하십시오.너무 열심히 빨지 말고, 그렇지 않으면 EB가 함께 제거됩니다. 그런 다음 새 미디어를 추가하여 EB를 다시 일시 중단합니다. 신경 유도를 위해, 웰 당 세 밀리리터의 신경 유도 매질로 새로운 여섯 개의 웰 낮은 접착 플레이트를 준비하십시오.측면 소프트 라이트를 켜고 다른 실내 광원을 끕니다. 이제 EB를 EBs와 배양 배지 모두를 빨아들이기 위해 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 신경 유도 배지가 첨가 된 여섯 웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 피펫을 똑바로 잡으십시오.EB는 중력 하에서 점차적으로 가라 앉고 피펫 팁의 입쪽으로 수렴합니다. 피펫 팁의 입이 액체 표면에 다시 닿으면 액체 표면 장력으로 인해 EB가 빠르게 매체에 가라 앉습니다. 샘플을 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 인큐베이션한다.멤브레인 매트릭스를 섭씨 4도 냉장고에 60분 동안 놓고 용해시킨다. 측면 소프트 라이트를 켠 후 콘솔 상단의 광원을 끄고 멤브레인 매트릭스를 얼음 위에 두어 응고를 방지하십시오. 소량의 EB를 신선한 확장 매체가 들어있는 60mm 접시로 옮겨 단일 EB를 쉽게 제거 할 수 있습니다. 200 마이크로 리터의 넓은 보어 피펫 팁을 사용하여 매번 약 10 마이크로 리터의 배지가 들어있는 단일 EB를 빨아 들인 다음 여섯 웰 플레이트의 바닥에 추가하여 물방울을 만듭니다.우물 당 다섯 방울을 사용하십시오. 15 마이크로리터의 막 매트릭스를 방울을 함유하는 각각의 EB에 첨가한다. EB 볼을 빠르게 섞어서 물방울 중앙에 끼워 넣으십시오.EB를 함유하는 액적이 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 위치시켜 응고되도록 허용한다. 그런 다음, 세 밀리리터의 팽창 배지를 각 웰에 첨가하고, 매트릭스 임베디드 EB를 부드럽게 날려 이들을 현탁시키고 사흘 동안 인큐베이션한다. 오가노이드 성숙을 위해, 원래의 배지를 부드럽게 제거하고 각 웰에 세 밀리리터의 성숙 배지를 첨가하십시오.오가노이드 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터의 수평 진탕기 위에 놓고 배양물을 수평으로 계속 회전시킨다. 신선한 성숙 배지를 이틀에서 사흘마다 바꿉니다. 중력과 매체보다 상대적으로 높은 밀도로 인해 재현탁 된 EB는 점차 가라 앉을 것입니다.따라서 EB를 편리하게 전송할 수 있습니다. EB와 비교할 때, 자유 세포와 죽은 세포 조각은 더 천천히 가라 앉습니다. 따라서 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편은 제거될 수 있다.초기 단계에서 재배 된 EB는 좋은 다능성을 나타내는 OCT4 마커를 표현했습니다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다. 성숙한 대뇌 오가노이드는 정점 전구 세포 마커 PAX6 및 뉴런 특이적 마커 튜불린 J1에 대해 양성이었다. 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSCs를 오가노이드로 성장시키기 위해 배양하였다.정상 뇌 오가노이드 그룹과 SCA3 대뇌 오가노이드 그룹의 유전자 발현 프로필은 신경 전달 물질 수송, 시냅스 형성 및 조절과 같은 경로에서 유의한 차이를 보였다. EB를 기저막 매트릭스에 내장할 때 EB가 건조되는 것을 피하기 위해 작동 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 신속하게 보호하는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

연구

생체공학

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

뷰-포트 표시 하 고 적외선 빛에 투명 한 플라스틱 미세 소자를 제작 하기 위한 소프트 리소 절차

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

오픈 소스 마이크로플레이트 호환 조명 패널용 애플리케이션

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

통합 된 마이크로 전극을 가진 바이오 영감 소프트 로봇

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

광유전학 실험을 위한 간단하고 다양한 조명 시스템 구축

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

연질 물질 나노인덴테이션을 위한 실험 및 데이터 분석 워크플로우

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 불활성화

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Reconspartuting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip (개방형 장기 칩에서 인간 상피 조직의 세포 구조 및 기능 재구성)

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...