Name: facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Это исследование было поддержано Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2020A0505100062), Проектом по ключевым темам науки и техники города Гуанчжоу (грант No 201904020025), Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31872800, 32070582, 82101937) и проектом постдокторских исследований города Гуанчжоу (Бангчжу Чену).

Протокол был составлен после Хельсинкской декларации. Одобрение было предоставлено Комитетом по этике Третьей аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (Медицинский и этический обзор [2021] No 022). Перед экспериментом каждую среду готовили по формуле12 Юрге?...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week.">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).</li><li>Jung, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-stop+microfluidic-based+lung+cancer+organoid+culture+platform+for+testing+drug+sensitivity.">A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity.</a> Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).</li><li>Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+three-dimensional+organoids+and+lung-on-a-chip+methods+to+study+lung+development,+regeneration+and+disease.">Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease.</a> The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).</li><li>Ye, Y., Pui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nanoparticles+suspended+in+a+light+scattering+medium.">Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).</li><li>Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Gr&#248;nlie, I., Tho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+tyndall+effect+for+enhanced+visual+detection+of+particles+in+compatibility+testing+of+intravenous+fluids:+Validity+and+reliability.">Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability.</a> PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).</li><li>Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+initial+cell+distribution+by+secondary+flow+of+medium+improves+cell+culture+efficiency.">Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency.</a> PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+deletion+of+polyglutamine+in+spinocerebellar+ataxia+type+3-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).</li><li>Xian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+effectiveness+of+genetically+corrected+iPSCs+derived+from+&#946;-thalassaemia+patients+in+nonmyeloablative+&#946;-thalassaemic+mice.">The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from &#946;-thalassaemia patients in nonmyeloablative &#946;-thalassaemic mice.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).</li><li>Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Knight, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+induction+of+singular+neural+rosette+emergence+within+hPSC-derived+tissues.">Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues.</a> eLife. 7, 37549 (2018).</li><li>Rieder, H. L., Smithwick, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPM+or+RCF.">RPM or RCF.</a> The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).</li><li>Dole, V. P., Cotzias, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomogram+for+the+calculation+of+relative+centrifugal+force.">A nomogram for the calculation of relative centrifugal force.</a> Science. 113 (2941), 552-553 (1951).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Kathuria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+and+functional+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebral+organoids+in+schizophrenia.">Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia.</a> JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Tang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSCAM/PAK1+pathway+suppression+reverses+neurogenesis+deficits+in+iPSC-derived+cerebral+organoids+from+patients+with+Down+syndrome.">DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).</li><li>Costa, M., Paulson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+understanding+Machado-Joseph+disease.">Toward understanding Machado-Joseph disease.</a> Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Klockgether, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+axonal+neuropathy+in+spinocerebellar+ataxia+type+3/Machado-Joseph+disease+(SCA3/MJD).">Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).</li><li>Khan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+polyglutamines+impair+synaptic+transmission+and+ubiquitin-proteasome+system+in+Caenorhabditis+elegans.">Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).</li><li>Teixeira-Castro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+signalling+suppresses+ataxin+3+aggregation+and+neurotoxicity+in+animal+models+of+Machado-Joseph+disease.">Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease.</a> Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).</li><li>Joers, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+abnormalities+in+premanifest+and+early+spinocerebellar+ataxias.">Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias.</a> Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).</li><li>Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+phenotypically+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).</li><li>Sivitilli, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li><li>Camp, J. G., Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+development:+Advances+in+mini-brain+technology.">Human development: Advances in mini-brain technology.</a> Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+human+cortical+organoid+generation.">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li></ol>

Церебральные органоиды открывают новые возможности для медицинских исследований. Многие полезные применения этой технологии только начинают изучаться28. Это исследование показало, что результаты секвенирования транскриптома генетически больных церебральных органоидо?...

По сравнению с двумерными (2D) системами культур, трехмерные (3D) системы культур имеют ряд преимуществ, включая подлинную репликацию и эффективное воспроизведение сложных структур определенных органов1. Поэтому церебральные органоиды являются одним из важных вспомогательных методов для исследований в области развития мозга человека и болезни2, скрининга лекарств и клеточной терапии.
Культивирование церебральных органоидов методом вращающейся суспензии способствует их развитию и созреванию3. Хотя системы церебральных органоидных культур достигли больших успехов, они по-прежнему сталкиваются с критическими проблемами, которые ограничивают их применение. Например, ручное выращивание включает в себя сложные этапы манипуляции и создает препятствия для достижения крупномасштабных применений. Дополнительно на каждом этапе развития в культуре церебральных органоидов необходимы изменения в различных средах и цитокинах4. Однако на ранней стадии органоиды или ЭБ имеют крошечные размеры (примерно от 200 мкм до 300 мкм) и почти визуально недоступны без соответствующего аппарата. Неизбежно, определенное количество драгоценных образцов органоидов вымывается при изменении среды. Было изучено много методов преодоления этого в других видах органоидных культур, и некоторые примеры включают погружение целых органоидных чипов в культуральную среду в течение 3 дней без вмешательства5; добавление свежей среды через крышку после поглощения старой среды с использованием абсорбирующей бумаги5; или применение сложных микрофлюидных трубопроводов для жидкостообмена 6,7,8. Другим препятствием, встречающимся на ранней стадии культивирования органоидов, является трудность достижения прямых наблюдений невооруженным глазом, что может привести к плохим операциям, которые приводят к повреждению и потере органоидов во время этапов переноса органоидов. Поэтому необходимо установить более осуществимый протокол, который облегчает изменение среды и перенос органоидов для генерации органоидов.
Для преодоления этих проблем предлагается соответствующая оптимизированная операция, основанная на инженерных принципах, что значительно и удобно облегчает многие органоидные процедуры. В природе, когда солнце светит в дом через оконную щель, невооруженным глазом можно увидеть пыль, танцующую в луче света. Из-за диффузного отражения солнечного света на пыли часть света преломляется в глазное яблоко для получения визуального изображения. Вдохновленный принципом этого явления 9,10, это исследование сделало лампу мягкого света и осветило ЭБ сбоку. Было обнаружено, что ЭБ могут быть визуально чистыми, не влияя на область просмотра. Вторичный поток, указывающий на центр, генерируется в жидкости путем вращения культуральной пластины за счет вихревых токов11. Первоначально дисперсные ЭБ накапливаются в центре пластины. Исходя из этого, а также явления, что скорость осаждения органоидов быстрее, чем у клеток, предложен простой в эксплуатации метод изменения среды и переноса органоидов без центрифугирования. Органоиды в культуральной среде могут быть эффективно отделены от свободных клеток и фрагментов мертвых клеток с помощью этой операции переноса.
Здесь предлагается протокол, который прост в эксплуатации, для генерации церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Технология работы была оптимизирована за счет применения инженерного принципа, что делает операции в 3D-культуре такими же простыми и осуществимыми, как и в 2D-культуре. Улучшенный метод обмена жидкости и операция переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и конструкции автоматических культуральных машин.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Filter</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>331001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8057400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well low adhesion plate</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>703011</td>
			<td>It is used for EBs suspension cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aaccute cell detachment solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07920</td>
			<td>It is used to digest iPSC into single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell800 24-well</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>34811</td>
			<td>Microporous culture plate for EBs preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07010</td>
			<td>Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-vit. A supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>GMP100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>ST025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>10212020C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-quality FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>General Electric Company, USA</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A609764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY&#160; secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150120</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>DS-H200</td>
			<td>Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel will solidify in the environment higher than 4 &#176;C, so it should be sub packed at low temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>Host: Rabbit. Dissolve with 500 &#956;L PBS. Use at 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathological frozen slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab78545</td>
			<td>Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>37350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC dissociation solution</td>
			<td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td>
			<td>CA3001500</td>
			<td>Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>A16518</td>
			<td>Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft light lamp</td>
			<td>NUT</td>
			<td>NUT</td>
			<td>A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8570</td>
			<td>Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8571</td>
			<td>Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A510146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>72302</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 &#181;L of PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weblink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw sequencing data</td>
			<td>Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics &#38; Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GSA-Human: HRA002430</td>
			<td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination

В настоящее время технология церебральной органоидной культуры все еще сложна в эксплуатации и трудна для применения в больших масштабах. Необходимо найти простое и практичное решение. Поэтому в настоящем исследовании предлагается более осуществимый церебральный органоидный протокол. Чтобы решить неизбежные неудобства в изменении среды и переносе органоидов на ранней стадии, текущие исследования оптимизируют технологию работы, применяя инженерный принцип. Для бокового освещения образцов эмбриоидного тела (EB) была принята лампа мягкого света, позволяющая ЭБ быть видимыми невооруженным глазом через усиленный эффект диффузного отражения. Используя принцип вторичного потока, генерируемого вращением, органоиды собираются к центру скважины, что облегчает операцию изменения среды или переноса органоидов. По сравнению с дисперсной клеткой, эмбриональное тело быстрее оседает в пипетке. Используя это явление, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть эффективно удалены простым способом, предотвращая повреждение ЭБ от центрифугирования. Это исследование облегчает работу мозговой органоидной культуры и способствует применению органоидов головного мозга.

Настоящее исследование индуцировало ИПСК (Рисунок 2В) в церебральные органоиды (Рисунок 2С). ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4 (рисунок 2A), который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ разви...

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Церебральные органоиды предоставляют беспрецедентные возможности для изучения развития органов и патологии заболеваний человека. Хотя большие успехи были достигнуты с системами церебральных органоидных культур, все еще существуют операционные трудности в применении этой технологии. Настоящий протокол описывает церебральную органоидную процедуру, которая облегчает изменение среды и перенос органоидов.

Облегчение церебральной органоидной культуры с помощью бокового мягкого светового освещения

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

Протокол облегчает работу культуры церебральных органоидов и способствует применению органоидов головного мозга. Органоид более ранней стадии можно увидеть невооруженным глазом с помощью боковой лампы мягкого света, которая удобна для многих операций. Улучшенные методы изменения среды и операции переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и проектирования автоматических машин для культур.Для начала культивируйте иПСК со средой mTeSR1 в матригеле, покрытом 35-миллиметровой чашкой Петри, и меняйте среду каждый день. Плотность роста iPSC не должна превышать 75% Затем вынимайте среду mTeSR1 из iPSCs и дважды промывайте ее одним миллиметром PBS. После пипетирования PBS добавьте 300 микролитров раствора для отсоединения клеток, чтобы переварить iPSCs в отдельные клетки в течение трех-четырех минут при 37 градусах Цельсия.Позже повторно суспендируют клетки в двух миллиметрах ЭБ-пластовой среды и центрифугируют образец в течение пяти минут при 300 раз больше г. Обработайте специализированную пластину из 24 лунок 500 микролитрами на лунку антиадгезивного промывочного раствора в течение пяти минут. Теперь повторно суспендируют клетки в среде формирования EB, содержащей ингибитор Rho-киназы Y27632.После удаления антиадгезивного промывочного раствора промыть каждую лунку двумя миллилитрами ЭБ-пластовой среды. Далее добавляют ячейки к специализированным 24 пластинам скважины с плотностью от трех раз 10 до шестой ячейки на лунку и центрифугируют пластину в 100 раз г в течение двух минут при комнатной температуре. Равномерно распределите ячейки в каждой камере в нижней части пластины.Инкубируйте образцы при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Если центрифугирование не использовалось на предыдущей стадии, инкубируйте в течение 36 часов и держите образец стабильным. Используйте прозрачную акриловую доску толщиной от 0,3 до 0,5 сантиметра размером с бумагу формата А5 и наклейте белые прокладки на лицевую и заднюю части акриловой пластины.Затем установите ряд светодиодных белых огней на краю пластины, чтобы огни могли входить со стороны акриловой пластины, а затем выстреливать параллельно. Теперь подготовьте новую пластину с низкой адгезией из шести лунок и добавьте в каждую скважину по два миллилитра ЭБ-пластовой среды. После удаления ЭБ вместе со средой с использованием наконечника пипетки шириной 1000 микролитров перенесите приблизительно 100 ЭБ на скважину на шестилуночную пластину с низкой адгезией.Чтобы каждый день заменять среду формирования EB одним и тем же объемом свежей среды, индуцируйте поток вихря, вращая тарелку по круговой орбите. ЭБ или органоиды сходятся к центру скважины из-за вторичного потока, генерируемого вращением. Аспирируйте старую среду, медленно направляя ее к краю колодца.Не сосите слишком сильно, иначе ЭБ будут удалены вместе. Затем добавьте свежие носители, чтобы повторно использовать ЭБ. Для нейронной индукции подготовьте новую пластину с шестью лунками с низкой адгезией с тремя миллилитрами среды нейронной индукции на лунку.Включите боковой мягкий свет и выключите другие внутренние источники света. Теперь перенесите ЭБ на пластину с шестью лунками с добавлением нейронной индукционной среды, используя широкий наконечник пипетки для всасывания как ЭБ, так и питательной среды. Затем держите пипетку в вертикальном положении.ЭБ будут постепенно погружаться под действием силы тяжести и сходиться к устью кончика пипетки. Когда горлышко кончика пипетки снова касается поверхности жидкости, и из-за поверхностного натяжения жидкости ЭБ быстро погружаются в среду. Инкубируйте образцы при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.Поместите мембранную матрицу в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 60 минут, чтобы раствориться. После включения бокового мягкого света выключите источник света в верхней части консоли и держите мембранную матрицу на льду, чтобы предотвратить затвердевание. Переложите небольшое количество ЭБ в 60-миллиметровую посуду, содержащую свежую расширительную среду, чтобы было легче удалить один ЭБ. Используя наконечник пипетки шириной 200 микролитров, всасывайте один ЭБ, содержащий примерно 10 микролитров среды каждый раз, а затем делайте капли, добавляя его к нижней части пластины из шести скважин.Используйте по пять капель на лунку. Добавьте 15 микролитров мембранной матрицы к каждой капле, содержащей ЭБ. Быстро перемешайте и вставьте шарик EB в центр капли.Дайте каплям, содержащим ЭБ, затвердеть, поместив пластину из шести лунок в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте три миллилитра расширительной среды к каждой скважине и осторожно взорвите матрицу встроенных ЭБ, чтобы приостановить их и инкубировать в течение трех дней. Для созревания органоидов аккуратно удалите исходную среду и добавьте три миллилитра среды созревания в каждую лунку.Поместите органоидную пластину на горизонтальный шейкер в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и продолжайте вращать культуру горизонтально. Меняйте свежую среду созревания каждые два-три дня. Из-за гравитации и относительно более высокой плотности, чем среда, повторно суспендированные ЭБ будут постепенно опускаться.Следовательно, ЭБ могут быть удобно переданы. По сравнению с ЭБ, свободные клетки и фрагменты мертвых клеток тонут медленнее. Таким образом, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть удалены.ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4, который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ развились в зрелые церебральные органоиды. Зрелые церебральные органоиды были положительными для маркера клеток-предшественников Апикальных клеток PAX6 и нейрон-специфического маркера тубулина J1. ИПСК от здоровых людей и пациентов с SCA3 культивировались для роста в органоиды.Профили экспрессии генов нормальной церебральной органоидной группы и церебральной органоидной группы SCA3 показали значительные различия в путях, таких как транспорт нейротрансмиттеров, образование синапсов и регуляция. При встраивании ЭБ с базальной мембранной матрицей время работы не должно быть слишком длительным, чтобы избежать высыхания ЭБ. Рекомендуется быстро защищать.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Мягкие литографических процедура для производства пластиковых Microfluidic устройства с видом портами прозрачно для видимого и инфракрасного света

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Производство волокон внеклеточного матрикса через жертвенную полые волокна мембраны клеточной культуры

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Обработка и оценка человека первичной простаты органоид культуры

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Приложения для microplate-совместимых панелей для освещения с открытым исходным кодом

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Биовдохновленный мягкий робот с инкорпорированными микроэлектродами

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Создание простой и универсальной системы освещения для оптогенетических экспериментов

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Экспериментальный рабочий процесс и анализ данных для наноиндентации мягкого вещества

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Инактивация патогенов посредством фотолиза рибофлавина-5'-фосфата в видимом свете

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Восстановление цитоархитектии и функции эпителиальных тканей человека на органе-чипе с открытым верхом

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...