Name: facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Subvención No. 2020A0505100062), el Proyecto de Temas Clave de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou (Subvención No. 201904020025), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nos. 31872800, 32070582, 82101937) y el proyecto de Beca de Investigación Postdoctoral de la Ciudad de Guangzhou (a Bangzhu Chen).

El protocolo se llevó a cabo después de la Declaración de Helsinki. La aprobación fue otorgada por el Comité de Ética del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou (Revisión médica y ética [2021] No. 022). Antes del experimento, cada medio se preparaba de acuerdo con la fórmula12 de Juergen A. Knoblich (Tablas suplementarias 1-4), o se utilizó un kit de organoides cerebrales disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Las ...

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	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Lancaster, M. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSCAM/PAK1+pathway+suppression+reverses+neurogenesis+deficits+in+iPSC-derived+cerebral+organoids+from+patients+with+Down+syndrome.">DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).</li><li>Costa, M., Paulson, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li><li>Camp, J. G., Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+development:+Advances+in+mini-brain+technology.">Human development: Advances in mini-brain technology.</a> Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+human+cortical+organoid+generation.">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. 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Los organoides cerebrales abren nuevas vías para la investigación médica. Muchas aplicaciones útiles de esta tecnología apenas están comenzando a ser exploradas28. Esta investigación encontró que los resultados de la secuenciación del transcriptoma de los organoides cerebrales genéticamente enfermos y los organoides cerebrales normales pueden reflejar las diferencias entre la enfermedad y la salud. Por ejemplo, los resultados del análisis de datos de ARN-seq (Figura...

En comparación con los sistemas de cultivo bidimensionales (2D), los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) tienen varias ventajas, incluida la replicación genuina y la reproducción eficiente de estructuras complejas de ciertos órganos1. Por lo tanto, los organoides cerebrales son uno de los métodos auxiliares importantes para los campos de investigación del desarrollo del cerebro humano y la enfermedad2, la detección de drogas y la terapia celular.
El cultivo de organoides cerebrales por el método de suspensión rotativa es propicio para su desarrollo y maduración3. Aunque los sistemas de cultivo de organoides cerebrales han logrado un gran éxito, todavía se enfrentan a desafíos críticos que limitan su aplicación. Por ejemplo, el cultivo manual implica pasos de manipulación complicados e introduce obstáculos para lograr aplicaciones a gran escala. Además, en cada etapa del desarrollo en el cultivo de organoides cerebrales, se necesitan cambios en diferentes medios y citoquinas4. Sin embargo, en la etapa temprana, los organoides o EB tienen tamaños pequeños (aproximadamente 200 μm a 300 μm) y son casi visualmente inaccesibles sin el aparato adecuado. Inevitablemente, una cierta cantidad de preciosas muestras de organoides se eliminan cuando se cambia el medio. Se han explorado muchas técnicas para superar esto en otros tipos de cultivos de organoides, y algunos ejemplos incluyen sumergir chips organoides enteros en un medio de cultivo durante 3 días sin intervención5; agregar un medio fresco a través de la cubierta después de que el medio viejo se absorba con papel absorbente5; o la aplicación de tuberías microfluídicas complejas para el intercambio de fluidos 6,7,8. Otro obstáculo encontrado en la etapa temprana del cultivo de organoides es la dificultad de lograr observaciones directas a simple vista, lo que puede causar operaciones deficientes que conducen a daños y pérdidas de organoides durante los pasos de transferencia de organoides. Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo más factible que facilite el cambio medio y la transferencia de organoides para generar organoides.
Se propone una operación optimizada correspondiente basada en principios de ingeniería para superar estos problemas, lo que facilita de manera significativa y conveniente muchos procedimientos organoides. En la naturaleza, cuando el sol brilla en una casa a través de un hueco en la ventana, el ojo desnudo puede ver el polvo bailando en el haz de luz. Debido al reflejo difuso de la luz solar sobre el polvo, parte de la luz se refracta en el globo ocular para producir una imagen visual. Inspirado en el principio de este fenómeno 9,10, este estudio hizo una lámpara de luz suave e iluminó los EB lateralmente. Se encontró que los EB podían ser visualmente claros sin afectar el alcance de visualización. Se genera un flujo secundario que apunta al centro en el líquido girando la placa de cultivo debido a las corrientes de Foucault11. Los EB originalmente dispersos se acumulan en el centro de la placa. En base a esto, y al fenómeno de que la velocidad de sedimentación de los organoides es más rápida que la de las células, se propone un método de fácil operación de cambio de medio y transferencia de organoides sin centrifugación. Los organoides en el medio de cultivo se pueden separar eficazmente de las células libres y los fragmentos de células muertas a través de esta operación de transferencia.
Aquí, se propone un protocolo que es fácil de operar para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes humanas. La tecnología de operación se optimizó aplicando el principio de ingeniería, haciendo que las operaciones en la cultura 3D sean tan simples y factibles como las de la cultura 2D. El método mejorado de intercambio de líquidos y la operación de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivo de organoides y el diseño de máquinas de cultivo automático.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Filter</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>331001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8057400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well low adhesion plate</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>703011</td>
			<td>It is used for EBs suspension cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aaccute cell detachment solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07920</td>
			<td>It is used to digest iPSC into single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell800 24-well</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>34811</td>
			<td>Microporous culture plate for EBs preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07010</td>
			<td>Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-vit. A supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>GMP100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>ST025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>10212020C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-quality FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>General Electric Company, USA</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A609764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY&#160; secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150120</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>DS-H200</td>
			<td>Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel will solidify in the environment higher than 4 &#176;C, so it should be sub packed at low temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>Host: Rabbit. Dissolve with 500 &#956;L PBS. Use at 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathological frozen slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab78545</td>
			<td>Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>37350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC dissociation solution</td>
			<td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td>
			<td>CA3001500</td>
			<td>Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>A16518</td>
			<td>Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft light lamp</td>
			<td>NUT</td>
			<td>NUT</td>
			<td>A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8570</td>
			<td>Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8571</td>
			<td>Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A510146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>72302</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 &#181;L of PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weblink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw sequencing data</td>
			<td>Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics &#38; Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GSA-Human: HRA002430</td>
			<td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination

En la actualidad, la tecnología de cultivo de organoides cerebrales sigue siendo complicada de operar y difícil de aplicar a gran escala. Es necesario encontrar una solución simple y práctica. Por lo tanto, en el presente estudio se propone un protocolo organoide cerebral más factible. Para resolver los inconvenientes inevitables en el cambio medio y la transferencia de organoides en la etapa inicial, la investigación actual optimiza la tecnología de operación mediante la aplicación del principio de ingeniería. Se adoptó una lámpara de luz suave para iluminar lateralmente las muestras del cuerpo embrionario (EB), lo que permite que los EB se vean a simple vista a través del efecto de reflexión difusa mejorado. Utilizando el principio de flujo secundario generado por rotación, los organoides se reúnen hacia el centro del pozo, lo que facilita la operación de cambio de medio o transferencia de organoides. En comparación con la célula dispersa, el cuerpo embrionario se asienta más rápido en la pipeta. Usando este fenómeno, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar de manera efectiva de una manera simple, evitando que los EB incurran en daños por centrifugación. Este estudio facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales.

El presente estudio indujo iPSC (Figura 2B) en organoides cerebrales (Figura 2C). Los EB cultivados en la etapa temprana expresaron el marcador OCT4 (Figura 2A), que indicó una buena pluripotencia. En la etapa posterior, los EB se convirtieron en organoides cerebrales maduros (Figura 2D). La investigación cultivó iPSCs de individuos sanos normales y pacientes con SCA3 en organoides cerebrales (<stron...

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Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Los organoides cerebrales proporcionan oportunidades sin precedentes para estudiar el desarrollo de órganos y la patología de enfermedades humanas. Aunque se ha logrado un gran éxito con los sistemas de cultivo de organoides cerebrales, todavía existen dificultades operativas en la aplicación de esta tecnología. El presente protocolo describe un procedimiento organoide cerebral que facilita el cambio medio y la transferencia de organoides.

Facilitar el cultivo de organoides cerebrales a través de la iluminación lateral de luz suave

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

El protocolo facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales. El organoide en etapa anterior se puede ver a simple vista mediante el uso de una lámpara lateral de luz suave que es conveniente para muchas operaciones. Los métodos mejorados de cambio de medio y las operaciones de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivos de organoides y el diseño de máquinas de cultivos automáticos.Para empezar, cultiva las iPSCs con medio mTeSR1 en una placa de Petri de 35 milímetros cubierta de matrigel y cambia el medio todos los días. La densidad de crecimiento de iPSC no debe exceder el 75%Luego, pipetee el medio mTeSR1 de los iPSC y lávelo dos veces con un milímetro de PBS. Después de pipetear el PBS, agregue 300 microlitros de solución de desprendimiento celular para digerir las iPSC en células individuales durante tres o cuatro minutos a 37 grados centígrados.Más tarde, resuspend las células en dos milímetros de medio de formación EB y centrifugar la muestra durante cinco minutos a 300 veces g. Trate la placa especializada de 24 pocillos con 500 microlitros por pocillo de solución de enjuague anti adherencia durante cinco minutos. Ahora, resuspend las células en el medio de formación de EB que contiene el inhibidor de la Rho quinasa Y27632.Después de retirar la solución de enjuague anti adherencia, enjuague cada pozo con dos mililitros de medio de formación EB. A continuación, agregue las células a las placas especializadas de 24 pocillos a una densidad de tres veces 10 a la sexta celda por pozo y centrifugue la placa a 100 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. Distribuya uniformemente las celdas en cada cámara en la parte inferior de la placa.Incubar las muestras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Si no se utilizó la centrifugación en el paso anterior, incube durante 36 horas y mantenga la muestra estable. Use una placa acrílica transparente con un grosor de 0.3 a 0.5 centímetros en el tamaño de papel A5 y pegue almohadillas blancas en la parte frontal y posterior de la placa acrílica.A continuación, instale una fila de luces blancas LED en el borde de la placa para que las luces puedan ingresar desde el lado de la placa acrílica y luego disparar en paralelo. Ahora, prepare una nueva placa de baja adherencia de seis pozos y agregue dos mililitros de medio de formación EB a cada pozo. Después de retirar los EB junto con el medio utilizando la punta de pipeta de diámetro ancho de 1000 microlitros, transfiera aproximadamente 100 EB por pozo a la placa de baja adherencia de seis pozos.Para reemplazar el medio de formación EB todos los días con el mismo volumen de medio fresco, induzca un flujo de remolino girando el plato a lo largo de una órbita circular. Los EB u organoides convergen al centro del pozo debido al flujo secundario generado a través de la rotación. Aspire el medio viejo canalizando hacia el borde del pozo lentamente.No chupe demasiado fuerte, de lo contrario los EB se eliminarán juntos. Luego, agregue medios nuevos para volver a suspender los EB. Para la inducción neural, prepare una nueva placa de adhesión baja de seis pocillos con tres mililitros de medio de inducción neural por pozo.Encienda la luz suave lateral y apague otras fuentes de luz interiores. Ahora transfiera los EB a la placa de seis pocillos con medio de inducción neural agregado mediante el uso de una punta de pipeta de boca ancha para succionar tanto los EB como el medio de cultivo. Luego, sostenga la pipeta en posición vertical.Los EB se hundirán gradualmente bajo la gravedad y convergerán hacia la boca de la punta de la pipeta. A medida que la boca de la punta de la pipeta toca la superficie líquida nuevamente, y debido a la tensión de la superficie del líquido, los EB se hunden rápidamente en el medio. Incubar las muestras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.Coloque la matriz de membrana en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante 60 minutos para disolverla. Después de encender la luz suave lateral, apague la fuente de luz en la parte superior de la consola y mantenga la matriz de membrana sobre hielo para evitar la solidificación. Transfiera una pequeña cantidad de EB a un plato de 60 milímetros que contenga un medio de expansión fresco para facilitar la eliminación de un solo EB. Usando una punta de pipeta de diámetro ancho de 200 microlitros, succione un solo EB que contenga aproximadamente 10 microlitros de medio cada vez, y luego haga gotas agregándolo a la parte inferior de la placa de seis pozos.Use cinco gotas por pozo. Agregue 15 microlitros de la matriz de membrana a cada gota que contenga EB. Mezcle e incruste rápidamente la bola EB en el centro de la gota.Permita que las gotas que contienen EB se solidifiquen colocando la placa de seis pocillos en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, agregue tres mililitros del medio de expansión a cada pozo y explote suavemente los EB incrustados en la matriz para suspenderlos e incubarlos durante tres días. Para la maduración organoide, retire suavemente el medio original y agregue tres mililitros de medio de maduración a cada pozo.Coloque la placa organoide en un agitador horizontal en una incubadora de 37 grados Celsius y continúe girando el cultivo horizontalmente. Cambie el medio de maduración fresco cada dos o tres días. Debido a la gravedad y a una densidad relativamente mayor que el medio, los EB resuspendidos se hundirán gradualmente.Por lo tanto, los EB se pueden transferir convenientemente. En comparación con los EB, las células libres y los fragmentos de células muertas se hunden más lentamente. Por lo tanto, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar.Los EB cultivados en la etapa inicial expresaron el marcador OCT4 que indicaba una buena pluripotencia. En la etapa posterior, los EB se convirtieron en organoides cerebrales maduros. Los organoides cerebrales maduros fueron positivos para el marcador de células progenitoras apicales PAX6 y el marcador específico de neuronas tubulina J1. Las iPSC de individuos sanos y pacientes con SCA3 se cultivaron para convertirse en organoides.Los perfiles de expresión génica del grupo organoide cerebral normal y del grupo organoide cerebral SCA3 mostraron diferencias significativas en vías como el transporte de neurotransmisores, la formación de sinapsis y la regulación. Al incrustar el EB con matriz de membrana basal, los tiempos de operación no deben ser demasiado largos para evitar que los EB se sequen. Se recomienda proteger rápidamente.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Investigación

Bioingeniería

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Procedimiento suave litográfica para la producción de dispositivos microfluídicos plástico con puertos de vista transparentes a luz Visible e infrarroja

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Manejo y evaluación de la cultura humana organoide de próstata primario

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Aplicaciones para paneles de iluminación compatibles con microplacas de código abierto

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

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Construyendo un sistema de iluminación simple y versátil para experimentos optogenéticos

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Inactivación de patógenos mediante fotólisis con luz visible de riboflavina-5′-fosfato

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

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Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...