Name: facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Denna studie stöddes av Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (bidrag nr 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (bidrag nr 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Bidrag nr 31872800, 32070582, 82101937) och Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-projektet (till Bangzhu Chen).

Protokollet genomfördes efter Helsingforsdeklarationen. Godkännande beviljades av etikkommittén för det tredje anslutna sjukhuset vid Guangzhou Medical University (medicinsk och etisk granskning [2021] nr 022). Före experimentet framställdes varje medium enligt Juergen A. Knoblichs formel12 (tilläggstabellerna 1-4), eller så användes ett kommersiellt tillgängligt Cerebral Organoid Kit (se materialtabell). De iPSC som används i denna studie har tidigare ...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week.">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).</li><li>Jung, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-stop+microfluidic-based+lung+cancer+organoid+culture+platform+for+testing+drug+sensitivity.">A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity.</a> Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).</li><li>Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+three-dimensional+organoids+and+lung-on-a-chip+methods+to+study+lung+development,+regeneration+and+disease.">Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease.</a> The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).</li><li>Ye, Y., Pui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nanoparticles+suspended+in+a+light+scattering+medium.">Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).</li><li>Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Gr&#248;nlie, I., Tho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+tyndall+effect+for+enhanced+visual+detection+of+particles+in+compatibility+testing+of+intravenous+fluids:+Validity+and+reliability.">Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability.</a> PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).</li><li>Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+initial+cell+distribution+by+secondary+flow+of+medium+improves+cell+culture+efficiency.">Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency.</a> PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+deletion+of+polyglutamine+in+spinocerebellar+ataxia+type+3-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).</li><li>Xian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+effectiveness+of+genetically+corrected+iPSCs+derived+from+&#946;-thalassaemia+patients+in+nonmyeloablative+&#946;-thalassaemic+mice.">The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from &#946;-thalassaemia patients in nonmyeloablative &#946;-thalassaemic mice.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).</li><li>Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Knight, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+induction+of+singular+neural+rosette+emergence+within+hPSC-derived+tissues.">Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues.</a> eLife. 7, 37549 (2018).</li><li>Rieder, H. L., Smithwick, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPM+or+RCF.">RPM or RCF.</a> The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).</li><li>Dole, V. P., Cotzias, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomogram+for+the+calculation+of+relative+centrifugal+force.">A nomogram for the calculation of relative centrifugal force.</a> Science. 113 (2941), 552-553 (1951).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Kathuria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+and+functional+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebral+organoids+in+schizophrenia.">Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia.</a> JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Tang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSCAM/PAK1+pathway+suppression+reverses+neurogenesis+deficits+in+iPSC-derived+cerebral+organoids+from+patients+with+Down+syndrome.">DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).</li><li>Costa, M., Paulson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+understanding+Machado-Joseph+disease.">Toward understanding Machado-Joseph disease.</a> Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Klockgether, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+axonal+neuropathy+in+spinocerebellar+ataxia+type+3/Machado-Joseph+disease+(SCA3/MJD).">Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).</li><li>Khan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+polyglutamines+impair+synaptic+transmission+and+ubiquitin-proteasome+system+in+Caenorhabditis+elegans.">Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).</li><li>Teixeira-Castro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+signalling+suppresses+ataxin+3+aggregation+and+neurotoxicity+in+animal+models+of+Machado-Joseph+disease.">Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease.</a> Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).</li><li>Joers, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+abnormalities+in+premanifest+and+early+spinocerebellar+ataxias.">Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias.</a> Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).</li><li>Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+phenotypically+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).</li><li>Sivitilli, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li><li>Camp, J. G., Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+development:+Advances+in+mini-brain+technology.">Human development: Advances in mini-brain technology.</a> Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+human+cortical+organoid+generation.">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li></ol>

Cerebrala organoider öppnar nya vägar för medicinsk forskning. Många användbara tillämpningar av denna teknik börjar bara utforskas28. Denna forskning fann att transkriptomsekvenseringsresultaten av genetiskt sjuka cerebrala organoider och normala cerebrala organoider kan återspegla skillnaderna mellan sjukdom och hälsa. Till exempel överensstämmer resultaten av RNA-seq-dataanalysen (figur 3B) med många rapporterade studier på SCA3-sjukdomar<sup class="xr...

Jämfört med tvådimensionella (2D) odlingssystem har tredimensionella (3D) odlingssystem flera fördelar, inklusive äkta replikering och effektiv reproduktion av komplexa strukturer av vissa organ1. Därför är cerebrala organoider en av de viktiga hjälpmetoderna för forskningsområdena mänsklig hjärnutveckling och sjukdom2, läkemedelsscreening och cellterapi.
Odling av cerebrala organoider med den roterande suspensionsmetoden bidrar till deras utveckling och mognad3. Även om cerebrala organoidkultursystem har uppnått stor framgång, står de fortfarande inför kritiska utmaningar som begränsar deras tillämpning. Till exempel innebär manuell odling komplicerade manipulationssteg och introducerar hinder för att uppnå storskaliga applikationer. Dessutom behövs vid varje utvecklingsstadium i kulturen av cerebrala organoider förändringar i olika medier och cytokiner4. I det tidiga skedet har emellertid organoiderna eller DE små storlekarna (cirka 200 μm till 300 μm) och är nästan visuellt otillgängliga utan lämplig apparat. Oundvikligen spolas en viss mängd värdefulla organoidprover bort när mediet byts ut. Många tekniker har utforskats för att övervinna detta i andra typer av organoidkulturer, och några exempel inkluderar nedsänkning av hela organoidchips i ett odlingsmedium i 3 dagar utan intervention5; tillsätt ett nytt medium genom täckglaset efter att det gamla mediet absorberats med absorberande papper5; eller applicera komplexa mikrofluidiska rörledningar för vätskeutbyte 6,7,8. Ett annat hinder som uppstår i det tidiga skedet av organoidodling är svårigheten att uppnå direkta observationer med blotta ögat, vilket kan orsaka dåliga operationer som leder till organoidskador och förlust under organoidöverföringsstegen. Därför är det nödvändigt att upprätta ett mer genomförbart protokoll som underlättar mediumförändring och organoidöverföring för att generera organoider.
En motsvarande optimerad operation baserad på tekniska principer föreslås för att övervinna dessa problem, vilket avsevärt och bekvämt underlättar många organoidprocedurer. I naturen, när solen skiner in i ett hus genom ett fönstergap, kan blotta ögat se dammet dansa i ljusstrålen. På grund av den diffusa reflektionen av solljus på damm bryts lite ljus in i ögongloben för att producera en visuell bild. Inspirerad av principen om detta fenomen 9,10 gjorde denna studie en mjuk ljuslampa och upplyste DE EBs i sidled. Det konstaterades att de verkställande organen kunde vara visuellt tydliga utan att det påverkade tittaromfattningen. Ett sekundärt flöde som pekar mot mitten genereras i vätskan genom att rotera odlingsplattan på grund av virvelströmmar11. Ursprungligen spridda EP ackumuleras i mitten av plattan. Baserat på detta och fenomenet att organoidernas sedimenteringshastighet är snabbare än cellernas, föreslås en enkel driftsmetod för mediumförändring och organoidöverföring utan centrifugering. Organoiderna i odlingsmediet kan effektivt separeras från fria celler och döda cellfragment genom denna överföringsoperation.
Här föreslås ett protokoll som är lätt att använda för att generera cerebrala organoider från humana pluripotenta stamceller. Driftstekniken optimerades genom att tillämpa ingenjörsprincipen, vilket gjorde operationer i 3D-kultur lika enkla och genomförbara som de i 2D-kulturen. Den förbättrade vätskeutbytesmetoden och organoidöverföringsoperationen är också till hjälp för andra typer av organoidkultur och utformningen av automatiska odlingsmaskiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Filter</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>331001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8057400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well low adhesion plate</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>703011</td>
			<td>It is used for EBs suspension cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aaccute cell detachment solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07920</td>
			<td>It is used to digest iPSC into single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell800 24-well</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>34811</td>
			<td>Microporous culture plate for EBs preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07010</td>
			<td>Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-vit. A supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>GMP100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>ST025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>10212020C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-quality FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>General Electric Company, USA</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A609764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY&#160; secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150120</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>DS-H200</td>
			<td>Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel will solidify in the environment higher than 4 &#176;C, so it should be sub packed at low temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>Host: Rabbit. Dissolve with 500 &#956;L PBS. Use at 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathological frozen slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab78545</td>
			<td>Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>37350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC dissociation solution</td>
			<td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td>
			<td>CA3001500</td>
			<td>Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>A16518</td>
			<td>Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft light lamp</td>
			<td>NUT</td>
			<td>NUT</td>
			<td>A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8570</td>
			<td>Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8571</td>
			<td>Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A510146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>72302</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 &#181;L of PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weblink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw sequencing data</td>
			<td>Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics &#38; Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GSA-Human: HRA002430</td>
			<td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination

För närvarande är cerebral organoidodlingsteknik fortfarande komplicerad att använda och svår att tillämpa i stor skala. Det är nödvändigt att hitta en enkel och praktisk lösning. Därför föreslås ett mer genomförbart cerebralt organoidprotokoll i den aktuella studien. För att lösa det oundvikliga besväret vid mediumförändring och organoidöverföring i ett tidigt skede optimerar den nuvarande forskningen driftstekniken genom att tillämpa ingenjörsprincipen. En mjuk ljuslampa antogs för att i sidled belysa embryoidkroppsproverna (EB), vilket gör att DE EBs kan ses med blotta ögat genom den förbättrade diffusa reflektionseffekten. Med hjälp av principen om sekundärt flöde som genereras genom rotation samlas organoiderna mot mitten av brunnen, vilket underlättar driften av mediumförändring eller organoidöverföring. Jämfört med den dispergerade cellen sätter sig embryoidkroppen snabbare i pipetten. Med hjälp av detta fenomen kan de flesta fria celler och döda cellfragment effektivt avlägsnas på ett enkelt sätt, vilket förhindrar att EBs ådrar sig skador från centrifugering. Denna studie underlättar driften av cerebral organoidkultur och hjälper till att främja tillämpningen av hjärnorganoider.

Den aktuella studien inducerade iPSCs (figur 2B) till cerebrala organoider (figur 2C). De EBs som odlades i ett tidigt skede uttryckte OCT4-markören (figur 2A), vilket indikerade god pluripotens. I det senare skedet utvecklades de europeiska organen till mogna cerebrala organoider (figur 2D). Forskningen odlade iPSCs från normala friska individer och SCA3-patienter till cerebrala organoider (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Cerebrala organoider ger oöverträffade möjligheter att studera organutveckling och mänsklig sjukdomspatologi. Även om stor framgång har uppnåtts med cerebrala organoidkultursystem, finns det fortfarande operativa svårigheter att tillämpa denna teknik. Detta protokoll beskriver ett cerebralt organoidförfarande som underlättar mediumförändring och organoidöverföring.

Underlätta cerebral organoidkultur via lateral mjuk ljusbelysning

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

Protokollet underlättar driften av cerebral organoidkultur och hjälper till att främja tillämpningen av hjärnorganoider. Organoiden i det tidigare stadiet kan ses med blotta ögat genom att använda en lateral mjuk ljuslampa som är lämplig för många operationer. De förbättrade mediumförändringsmetoderna och organoidöverföringsoperationerna är också till hjälp för andra typer av organoidkulturer och utformningen av automatiska odlingsmaskiner.Till att börja med, odla iPSC: erna med mTeSR1-medium i en matrigel täckt 35 millimeter petriskål och byt medium varje dag. IPSC-tillväxttätheten får inte överstiga 75% Överför sedan mTeSR1-mediet från iPSC: erna och tvätta det två gånger med en millimeter PBS. Efter pipettering av PBS, tillsätt 300 mikroliter cellavskiljningslösning för att smälta iPSC: erna i enskilda celler i tre till fyra minuter vid 37 grader Celsius.Senare, återsuspendera cellerna i två millimeter EB-bildningsmedium och centrifugera provet i fem minuter vid 300 gånger g. Behandla den specialiserade 24-brunnsplattan med 500 mikroliter per brunn av sköljlösning mot vidhäftning i fem minuter. Återsuspendera nu cellerna i EB-bildningsmediet som innehåller Rho-kinashämmare Y27632.Efter avlägsnande av sköljningslösningen mot vidhäftning, skölj varje brunn med två milliliter EB-bildningsmedium. Tillsätt sedan cellerna till de specialiserade 24 brunnsplattorna med en densitet av tre gånger 10 till de sjätte cellerna per brunn och centrifugera plattan vid 100 gånger g i två minuter vid rumstemperatur. Fördela cellerna jämnt i varje kammare längst ner på plattan.Inkubera proverna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar. Om centrifugering inte användes i föregående steg, inkubera i 36 timmar och håll provet stabilt. Använd en transparent akrylplatta med en tjocklek av 0,3 till 0,5 centimeter i storleken på A5-papper och klistra in vita dynor på framsidan och baksidan av akrylplattan.Installera sedan en rad LED-vita lampor på kanten av plattan så att lamporna kan komma in från sidan av akrylplattan och sedan skjuta ut parallellt. Förbered nu en ny sexbrunnsplatta med låg vidhäftning och tillsätt två milliliter EB-bildningsmedium till varje brunn. Efter att ha avlägsnat DE ELEKTRISKA och medelstora mediet med hjälp av 1000 mikroliter bred borrpipettspets, överför cirka 100 MK per brunn till den sex brunnsplatta med låg vidhäftning.För att ersätta EB-bildningsmediet varje dag med samma volym färskt medium, inducera ett virvelflöde genom att rotera skålen längs en cirkulär bana. EP: erna eller organoiderna konvergerar till mitten av brunnen på grund av det sekundära flödet som genereras genom rotation. Aspirera det gamla mediet genom att långsamt pipa till kanten av brunnen.Sug inte för hårt, annars kommer DE ATT TAS bort tillsammans. Lägg sedan till nya medier för att återsuspendera de verkställande organen. För neural induktion, förbered en ny sexbrunnsplatta med låg vidhäftning med tre milliliter neuralt induktionsmedium per brunn.Slå på det laterala mjuka ljuset och stäng av andra inomhusljuskällor. Överför nu EBs till sexbrunnsplattan med tillsatt neuralt induktionsmedium genom att använda en bred munpipettspets för att suga både EM och odlingsmediet. Håll sedan pipetten upprätt.DE KOMMER gradvis att sjunka under tyngdkraften och konvergera mot pipettspetsens mynning. När pipettspetsens mynning vidrör vätskeytan igen, och på grund av flytande ytspänning, sjunker AB: erna snabbt in i mediet. Inkubera proverna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 24 timmar.Placera membranmatrisen i ett kylskåp med fyra grader Celsius i 60 minuter för att lösa upp. När du har slagit på det laterala mjuka ljuset, stäng av ljuskällan på toppen av konsolen och håll membranmatrisen på is för att förhindra stelning. Överför en liten mängd EBs till en 60 millimeters skål som innehåller ett nytt expansionsmedium för att göra det lättare att ta bort en enda EB. Använd en 200 mikroliter bred borrpipettspets, sug en enda EB som innehåller cirka 10 mikroliter medium varje gång och gör sedan droppar genom att lägga den i botten av den sex brunnsplattan.Använd fem droppar per brunn. Tillsätt 15 mikroliter av membranmatrisen till varje EB som innehåller droppe. Blanda snabbt och bädda in EB-bollen i mitten av droppen.Låt dropparna som innehåller EBs stelna genom att placera sexbrunnsplattan i en 37 grader Celsius inkubator i 30 minuter. Tillsätt sedan tre milliliter av expansionsmediet till varje brunn och spräng försiktigt matrisinbäddade SEB för att suspendera dem och inkubera i tre dagar. För organoidmognad, ta försiktigt bort det ursprungliga mediet och tillsätt tre milliliter mognadsmedium till varje brunn.Placera organoidplattan på en horisontell shaker i en 37 grader Celsius inkubator och fortsätt att rotera kulturen horisontellt. Byt det färska mognadsmediet varannan tre till tre dagar. På grund av tyngdkraften och relativt högre densitet än mediet kommer de återsuspenderade EBs gradvis att sjunka.Därför kan DE EBs enkelt överföras. Jämfört med EBs sjunker fria celler och döda cellfragment långsammare. De flesta av de fria cellerna och döda cellfragmenten kan därmed tas bort.De EBs som odlades i ett tidigt skede uttryckte OCT4-markören som indikerade god pluripotens. I det senare skedet utvecklades DE EBs till mogna cerebrala organoider. De mogna cerebrala organoiderna var positiva för apikala stamceller markör PAX6 och neuronspecifik markör tubulin J1. IPSC från friska individer och SCA3-patienter odlades för att växa till organoider.Genuttrycksprofilerna för den normala cerebrala organoidgruppen och SCA3-cerebrala organoidgruppen visade signifikanta skillnader i vägar såsom neurotransmittortransport, synapsbildning och reglering. Vid inbäddning av EB med källarmembranmatris bör driftstiderna inte vara för långa för att undvika att EBs torkar ut. Det rekommenderas att skydda snabbt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Ljus medierad Bildning och mönstring av Hydrogeler för cellodling Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Mjuk litografiskt förfarande för att producera plast mikroflödessystem enheter med Visa-portar Transparent för synligt och infrarött ljus

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Produktion av extracellulärmatrix fibrer via uppoffrande ihålig Fiber membran cellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Hantering och bedömning av människans primära prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer för öppen källkod Microplate-kompatibla belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Bioinspirerad mjuk robot med inbyggda mikroelektroder

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Bygga ett enkelt och mångsidigt belysningssystem för optogenetiska experiment

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Arbetsflöde för experimentell och dataanalys för nanoindragning av mjuk materia

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inaktivering av patogener via fotolys i synligt ljus av riboflavin-5′-fosfat

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Rekonstituering av cytoarkitektur och funktion hos humana epitelvävnader på ett öppet organchip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...