Name: facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2020A0505100062), Guangzhou Şehri Bilim ve Teknoloji Anahtar Konular Projesi (Hibe No. 201904020025), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 31872800, 32070582, 82101937) ve Guangzhou Şehri Doktora Sonrası Araştırma Hibe projesi (Bangzhu Chen'e) tarafından desteklenmiştir.

Protokol, Helsinki Deklarasyonu'nun ardından gerçekleştirildi. Guangzhou Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onay verilmiştir (Tıbbi ve etik inceleme [2021] No. 022). Deneyden önce, her ortam Juergen A. Knoblich'in formülü12'ye (Ek Tablolar 1-4) göre hazırlandı veya ticari olarak temin edilebilen bir Serebral Organoid Kit kullanıldı (bkz. Bu çalışmada kullanılan iPSC'ler daha önce laboratuvarımız tarafında...

<ol>
	<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week.">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).</li><li>Jung, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-stop+microfluidic-based+lung+cancer+organoid+culture+platform+for+testing+drug+sensitivity.">A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity.</a> Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).</li><li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip.">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).</li><li>Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+three-dimensional+organoids+and+lung-on-a-chip+methods+to+study+lung+development,+regeneration+and+disease.">Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease.</a> The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).</li><li>Ye, Y., Pui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nanoparticles+suspended+in+a+light+scattering+medium.">Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium.</a> Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).</li><li>Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Gr&#248;nlie, I., Tho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+the+tyndall+effect+for+enhanced+visual+detection+of+particles+in+compatibility+testing+of+intravenous+fluids:+Validity+and+reliability.">Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability.</a> PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).</li><li>Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenization+of+initial+cell+distribution+by+secondary+flow+of+medium+improves+cell+culture+efficiency.">Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency.</a> PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+deletion+of+polyglutamine+in+spinocerebellar+ataxia+type+3-derived+induced+pluripotent+stem+cells.">CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).</li><li>Xian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+and+effectiveness+of+genetically+corrected+iPSCs+derived+from+&#946;-thalassaemia+patients+in+nonmyeloablative+&#946;-thalassaemic+mice.">The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from &#946;-thalassaemia patients in nonmyeloablative &#946;-thalassaemic mice.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).</li><li>Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Knight, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+induction+of+singular+neural+rosette+emergence+within+hPSC-derived+tissues.">Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues.</a> eLife. 7, 37549 (2018).</li><li>Rieder, H. L., Smithwick, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPM+or+RCF.">RPM or RCF.</a> The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).</li><li>Dole, V. P., Cotzias, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomogram+for+the+calculation+of+relative+centrifugal+force.">A nomogram for the calculation of relative centrifugal force.</a> Science. 113 (2941), 552-553 (1951).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium.">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li><li>Kathuria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+and+functional+characterization+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebral+organoids+in+schizophrenia.">Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia.</a> JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency.">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li><li>Tang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSCAM/PAK1+pathway+suppression+reverses+neurogenesis+deficits+in+iPSC-derived+cerebral+organoids+from+patients+with+Down+syndrome.">DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).</li><li>Costa, M., Paulson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+understanding+Machado-Joseph+disease.">Toward understanding Machado-Joseph disease.</a> Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Klockgether, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+related+axonal+neuropathy+in+spinocerebellar+ataxia+type+3/Machado-Joseph+disease+(SCA3/MJD).">Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD).</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).</li><li>Khan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+polyglutamines+impair+synaptic+transmission+and+ubiquitin-proteasome+system+in+Caenorhabditis+elegans.">Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).</li><li>Teixeira-Castro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonergic+signalling+suppresses+ataxin+3+aggregation+and+neurotoxicity+in+animal+models+of+Machado-Joseph+disease.">Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease.</a> Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).</li><li>Joers, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+abnormalities+in+premanifest+and+early+spinocerebellar+ataxias.">Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias.</a> Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).</li><li>Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+phenotypically+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).</li><li>Sivitilli, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+uniform+human+cerebral+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells.</a> Life Science Alliance. 3 (5), (2020).</li><li>Camp, J. G., Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+development:+Advances+in+mini-brain+technology.">Human development: Advances in mini-brain technology.</a> Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).</li><li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development.">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).</li><li>Yoon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+human+cortical+organoid+generation.">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li></ol>

Serebral organoidler tıbbi araştırmalar için yeni yollar açar. Bu teknolojinin birçok yararlı uygulaması henüz keşfedilmeye başlanmıştır28. Bu araştırma, genetik olarak hastalıklı serebral organoidlerin ve normal serebral organoidlerin transkriptom dizileme sonuçlarının hastalık ve sağlık arasındaki farkları yansıtabileceğini bulmuştur. Örneğin, RNA-seq veri analizi sonuçları (Şekil 3B), SCA3 hastalıkları<sup class="xref...

İki boyutlu (2B) kültür sistemleriyle karşılaştırıldığında, üç boyutlu (3B) kültür sistemlerinin, gerçek replikasyon ve belirli organların karmaşık yapılarının verimli bir şekilde çoğaltılması gibi çeşitli avantajları vardır1. Bu nedenle, serebral organoidler, insan beyni gelişimi ve hastalığı2, ilaç taraması ve hücre tedavisi araştırma alanları için önemli yardımcı yöntemlerden biridir.
Serebral organoidlerin döner süspansiyon yöntemiyle kültürlenmesi, gelişimlerine ve olgunlaşmalarına elverişlidir3. Serebral organoid kültür sistemleri büyük başarılar elde etmiş olsalar da, uygulamalarını sınırlayan kritik zorluklarla karşı karşıyadırlar. Örneğin, manuel yetiştirme karmaşık manipülasyon adımlarını içerir ve büyük ölçekli uygulamalara ulaşmanın önünde engeller getirir. Ek olarak, serebral organoidlerin kültüründeki her gelişim aşamasında, farklı ortam ve sitokinlerde değişikliklere ihtiyaçvardır4. Bununla birlikte, erken aşamada, organoidler veya EB'ler küçük boyutlara (yaklaşık 200 μm ila 300 μm) sahiptir ve uygun aparatlar olmadan neredeyse görsel olarak erişilemez. Kaçınılmaz olarak, ortam değiştirildiğinde belirli miktarda değerli organoid numune temizlenir. Diğer organoid kültürlerde bunun üstesinden gelmek için birçok teknik araştırılmıştır ve bazı örnekler arasında tüm organoid cipslerin müdahale edilmeden 3 gün boyunca bir kültür ortamına daldırılması5; eski ortam emici kağıt5 kullanılarak emildikten sonra kapak kapağından taze bir ortam eklenmesi; veya sıvı değişimi için karmaşık mikroakışkan boru hatları uygulamak 6,7,8. Organoid yetiştiriciliğinin erken evresinde karşılaşılan bir diğer engel, çıplak gözle doğrudan gözlemler elde etmenin zorluğudur ve bu da organoid transfer adımları sırasında organoid hasarına ve kaybına yol açan zayıf operasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, organoidler üretmek için ortam değişimini ve organoid transferini kolaylaştıran daha uygulanabilir bir protokol oluşturmak gerekir.
Birçok organoid prosedürü önemli ölçüde ve uygun bir şekilde kolaylaştıran bu sorunların üstesinden gelmek için mühendislik ilkelerine dayanan karşılık gelen optimize edilmiş bir çalışma önerilmektedir. Doğada, güneş bir pencere boşluğundan bir eve parladığında, çıplak gözle ışık huzmesinde dans eden tozu görebilir. Güneş ışığının toz üzerindeki dağınık yansıması nedeniyle, görsel bir görüntü üretmek için bir miktar ışık göz küresine kırılır. Bu fenomenin 9,10 prensibinden esinlenen bu çalışma, yumuşak bir ışık lambası yaptı ve EB'leri yanal olarak aydınlattı. EB'lerin görüntüleme kapsamını etkilemeden görsel olarak net olabileceği bulunmuştur. Girdap akımları nedeniyle kültür plakası döndürülerek sıvıda merkeze işaret eden ikincil bir akış üretilir11. Başlangıçta dağılmış EB'ler plakanın merkezinde birikir. Buna ve organoidlerin çökelme hızının hücrelerinkinden daha hızlı olduğu olgusuna dayanarak, santrifüjleme olmadan orta değişim ve organoid transferinin kolay bir çalışma yöntemi önerilmektedir. Kültür ortamındaki organoidler, bu transfer işlemi ile serbest hücrelerden ve ölü hücre parçalarından etkili bir şekilde ayrılabilir.
Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden serebral organoidler üretmek için kullanımı kolay bir protokol önerilmektedir. Operasyon teknolojisi, mühendislik ilkesi uygulanarak, 3D kültürdeki işlemleri 2D kültüründekiler kadar basit ve uygulanabilir hale getirerek optimize edildi. Geliştirilmiş sıvı değişim yöntemi ve organoid transfer işlemi, diğer organoid kültür türleri ve otomatik kültür makinelerinin tasarımı için de yararlıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m Filter</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>331001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L wide-bore pipette tip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>9405020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>8057400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well low adhesion plate</td>
			<td>NEST Biotechnology, China</td>
			<td>703011</td>
			<td>It is used for EBs suspension cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aaccute cell detachment solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07920</td>
			<td>It is used to digest iPSC into single cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell800 24-well</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>34811</td>
			<td>Microporous culture plate for EBs preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>07010</td>
			<td>Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-vit. A supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>GMP100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>ST025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>10212020C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology, China</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-quality FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque</td>
			<td>General Electric Company, USA</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td>Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A609764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY&#160; secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150120</td>
			<td>Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal shaker</td>
			<td>Servicebio, China</td>
			<td>DS-H200</td>
			<td>Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel will solidify in the environment higher than 4 &#176;C, so it should be sub packed at low temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>Host: Rabbit. Dissolve with 500 &#956;L PBS. Use at 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathological frozen slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab78545</td>
			<td>Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>37350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC dissociation solution</td>
			<td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td>
			<td>CA3001500</td>
			<td>Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>A16518</td>
			<td>Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Shitai Laboratory Equipment, China</td>
			<td>188105W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft light lamp</td>
			<td>NUT</td>
			<td>NUT</td>
			<td>A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8570</td>
			<td>Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>8571</td>
			<td>Maturation Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A502792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 primary antibody</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab41489</td>
			<td>Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td>Sangon Bioteach, China</td>
			<td>A510146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Canada</td>
			<td>72302</td>
			<td>Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 &#181;L of PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weblink</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raw sequencing data</td>
			<td>Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics &#38; Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GSA-Human: HRA002430</td>
			<td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facilitating cerebral organoid culture via lateral soft light illumination

Şu anda, serebral organoid kültür teknolojisinin işletilmesi hala karmaşıktır ve büyük ölçekte uygulanması zordur. Basit ve pratik bir çözüm bulmak gerekiyor. Bu nedenle, bu çalışmada daha uygulanabilir bir serebral organoid protokol önerilmiştir. Orta değişim ve organoid transferindeki kaçınılmaz rahatsızlığı erken aşamada çözmek için, mevcut araştırma mühendislik ilkesini uygulayarak işletme teknolojisini optimize etmektedir. Embriyoid cisim (EB) örneklerini yanal olarak aydınlatmak için yumuşak bir ışık lambası benimsendi ve EB'lerin gelişmiş dağınık yansıma etkisi ile çıplak gözle görülmesini sağladı. Rotasyonla üretilen ikincil akış prensibini kullanarak, organoidler kuyunun merkezine doğru toplanır ve bu da orta değişimin veya organoid transferin çalışmasını kolaylaştırır. Dağılmış hücreye kıyasla, embriyoid vücut pipete daha hızlı yerleşir. Bu fenomeni kullanarak, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu, EB'lerin santrifüjlemeden zarar görmesini önleyerek basit bir şekilde etkili bir şekilde çıkarılabilir. Bu çalışma, serebral organoid kültürünün çalışmasını kolaylaştırır ve beyin organoidlerinin uygulanmasını teşvik etmeye yardımcı olur.

Bu çalışmada iPSC'ler (Şekil 2B) serebral organoidlere indüklenmiştir (Şekil 2C). Erken aşamada yetiştirilen EB'ler, iyi pluripotensi gösteren OCT4 belirtecini (Şekil 2A) ifade etti. Daha sonraki aşamada, EB'ler olgun serebral organoidlere dönüştü (Şekil 2D). Araştırma, normal sağlıklı bireylerden ve SCA3 hastalarından serebral organoidlere iPSC'ler yetiştirdi (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination at JoVE.com

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Serebral organoidler, organ gelişimini ve insan hastalığı patolojisini incelemek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Serebral organoid kültür sistemleri ile büyük başarılar elde edilmiş olsa da, bu teknolojinin uygulanmasında hala operasyonel zorluklar yaşanmaktadır. Mevcut protokol, orta değişim ve organoid transferini kolaylaştıran serebral organoid bir prosedürü tanımlamaktadır.

Yanal Yumuşak Işık Aydınlatması ile Serebral Organoid Kültürün Kolaylaştırılması

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

Protokol, serebral organoidlerin kültürünün çalışmasını kolaylaştırır ve beyin organoidlerinin uygulanmasını teşvik etmeye yardımcı olur. Daha erken aşamadaki organoid, birçok işlem için uygun olan yanal yumuşak ışık lambası kullanılarak çıplak gözle görülebilir. Geliştirilmiş ortam değiştirme yöntemleri ve organoid transfer işlemleri, diğer organoid kültür türleri ve otomatik kültür makinelerinin tasarımı için de yararlıdır.Başlamak için, bir matrijel içinde mTeSR1 ortamına sahip iPSC'leri kültürleyin, 35 milimetre Petri kabını kapladı ve ortamı her gün değiştirdi. iPSC büyüme yoğunluğu% 75'i geçmemelidirDaha sonra, mTeSR1 ortamını iPSC'lerden pipetle çıkarın ve bir milimetre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi pipetledikten sonra, iPSC'leri 37 santigrat derecede üç ila dört dakika boyunca tek hücrelere sindirmek için 300 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin.Daha sonra, hücreleri iki milimetre EB oluşum ortamında yeniden askıya alın ve numuneyi 300 kez g'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Özel 24 kuyucuklu plakayı, beş dakika boyunca yapışma önleyici durulama çözeltisinin kuyusu başına 500 mikrolitre ile tedavi edin. Şimdi, Rho kinaz inhibitörü Y27632 içeren EB oluşum ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.Yapışma önleyici durulama çözeltisini çıkardıktan sonra, her bir oyuğa iki mililitre EB oluşum ortamı ile durulayın. Daha sonra, hücreleri özel 24 kuyu plakasına, kuyu başına altıncı hücrelere üç kez 10 yoğunlukta ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 100 kez g'de santrifüj edin. Hücreleri, plakanın altındaki her odaya eşit olarak dağıtın.Numuneleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Önceki adımda santrifüjleme kullanılmadıysa, 36 saat boyunca inkübe edin ve numuneyi sabit tutun. A5 kağıt boyutunda 0,3 ila 0,5 santimetre kalınlığında şeffaf bir akrilik levha kullanın ve akrilik plakanın önüne ve arkasına beyaz pedler yapıştırın.Ardından, plakanın kenarına bir sıra LED beyaz ışık takın, böylece ışıklar akrilik plakanın yanından girebilir ve ardından paralel olarak dışarı fırlayabilir. Şimdi, yeni bir altı kuyu düşük yapışma plakası hazırlayın ve her bir oyuğa iki mililitre EB oluşum ortamı ekleyin. 1000 mikrolitre genişliğinde delikli pipet ucu kullanarak EB'leri ortamla birlikte çıkardıktan sonra, kuyu başına yaklaşık 100 EB'yi altı kuyu alçak yapışma plakasına aktarın.EB oluşum ortamını her gün aynı hacimde taze ortamla değiştirmek için, çanağı dairesel bir yörünge boyunca döndürerek bir girdap akışı indükleyin. EB'ler veya organoidler, dönme yoluyla üretilen ikincil akış nedeniyle kuyunun merkezine yaklaşır. Kuyunun kenarına yavaşça boru çekerek eski ortamı aspire edin.Çok sert emmeyin, aksi takdirde EB'ler birlikte çıkarılacaktır. Ardından, EB'leri yeniden askıya almak için yeni medya ekleyin. Nöral indüksiyon için, kuyu başına üç mililitre nöral indüksiyon ortamı içeren yeni bir altı kuyu düşük yapışma plakası hazırlayın.Yanal yumuşak ışığı açın ve diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın. Şimdi EB'leri, hem EB'leri hem de kültür ortamını emmek için geniş ağızlı pipet ucu kullanarak nöral indüksiyon ortamı eklenmiş altı kuyucuklu plakaya aktarın. Ardından pipeti dik tutun.EB'ler yavaş yavaş yerçekimi altında batacak ve pipet ucunun ağzına doğru birleşecektir. Pipet ucunun ağzı sıvı yüzeye tekrar dokunduğunda ve sıvı yüzey gerilimi nedeniyle, EB'ler hızla ortama batar. Numuneleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Membran matrisini çözülmesi için 60 dakika boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına yerleştirin. Yanal yumuşak ışığı açtıktan sonra, konsolun üstündeki ışık kaynağını kapatın ve katılaşmasını önlemek için membran matrisini buz üzerinde tutun. Tek EB'nin çıkarılmasını kolaylaştırmak için az miktarda EB'yi yeni bir genleşme ortamı içeren 60 milimetrelik bir kaba aktarın. 200 mikrolitre genişliğinde bir delikli pipet ucu kullanarak, her seferinde yaklaşık 10 mikrolitre ortam içeren tek bir EB'yi emin ve ardından altı kuyucuklu plakanın dibine ekleyerek damlacıklar yapın.Kuyu başına beş damlacık kullanın. Damla içeren her EB'ye 15 mikrolitre membran matrisi ekleyin. EB topunu hızlıca karıştırın ve damlacığın ortasına yerleştirin.EB'leri içeren damlacıkların, altı kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirerek katılaşmasına izin verin. Daha sonra, her bir kuyucuğa üç mililitre genleşme ortamı ekleyin ve matris gömülü EB'leri askıya almak ve üç gün boyunca kuluçkaya yatırmak için yavaşça havaya uçurun. Organoid olgunlaşma için, orijinal ortamı yavaşça çıkarın ve her bir oyuğa üç mililitre olgunlaşma ortamı ekleyin.Organoid plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatörde yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin ve kültürü yatay olarak döndürmeye devam edin. Taze olgunlaşma ortamını her iki ila üç günde bir değiştirin. Yerçekimi ve ortamdan nispeten daha yüksek yoğunluk nedeniyle, yeniden askıya alınan EB'ler yavaş yavaş batacaktır.Bu nedenle, EB'ler rahatça aktarılabilir. EB'lerle karşılaştırıldığında, serbest hücreler ve ölü hücre parçaları daha yavaş batar. Böylece serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu çıkarılabilir.Erken aşamada yetiştirilen EB'ler, iyi pluripotensi gösteren OCT4 belirtecini ifade etti. Daha sonraki aşamada, EB'ler olgun serebral organoidlere dönüştü. Matür serebral organoidler apikal progenitör hücre markörü PAX6 ve nörona özgü marker tübülin J1 için pozitifti. Sağlıklı bireylerden ve SCA3 hastalarından gelen iPSC'ler, organoidlere dönüşmek üzere yetiştirildi.Normal serebral organoid grubunun ve SCA3 serebral organoid grubunun gen ekspresyon profilleri, nörotransmitter transportu, sinaps oluşumu ve regülasyon gibi yollarda anlamlı farklılıklar gösterdi. EB'yi bazal membran matrisi ile gömerken, EB'lerin kurumasını önlemek için çalışma süreleri çok uzun olmamalıdır. Hızlı bir şekilde korunması tavsiye edilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Biyomühendislik

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Görünüm-bağlantı noktaları görünür ve kızılötesi ışık şeffaf plastik mikrosıvısal cihazlar üretmek için yumuşak tekniğinde yordamı

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Açık Kaynak Mikroplaka Uyumlu Aydınlatma Panelleri Uygulamaları

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Anonim Mikroelektrotlu Bioinspired Yumuşak Robot

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Yumuşak Madde Nanoindentasyonu için Deneysel ve Veri Analizi İş Akışı

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...