Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

تشكر D.K.V و A.R أكاديمية مانيبال للتعليم العالي على زمالة TMA Pai. نشكر مجلس أبحاث العلوم والهندسة في الهند على SERB-SRG (#SRG/2021/001315) ، وكذلك المجلس الهندي للبحوث الطبية في الهند (# 5 / 4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216/2020-NCD-I) والصندوق الداخلي لأكاديمية مانيبال للتعليم العالي ، مانيبال ، الهند. نشكر مرفق JNCASR (مركز جواهر لال نهرو للبحوث العلمية المتقدمة ، الهند) و B. Suma على الفحص المجهري متحد البؤر في JNCASR.

ملاحظة: تم تمييز خلايا SH-SY5Y المستزرعة في وسائط DMEM / F-12 بحمض الريتينويك 10 ميكرومتر لمدة 7 أيام وعولجت ب 1 ميكرومتر oAβ oligomers لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2). بعد العلاج ، تم تثبيت الخلايا بمحلول Karnovsky المثبت وملطخة بالمناعة المزدوجة بجسم مضاد phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) و fhalloidin المرتبط ب F-actin. في...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

يحاول العديد من الباحثين في العقدين الماضيين فهم وتوصيف بنية TNTs18. إن عدم وجود علامات محددة يعيق التقدم ، وهناك طلب متزايد على طريقة ملائمة وموحدة يمكن استخدامها لتحديد وتوصيف وقياس TNTs. تعرف TNTs بأنها قنوات غشائية قائمة على F-actin تحوم بين خليتين. أظهرت الدراسات أن الخلايا العصبي?...

الأنابيب النانوية النفقية (TNTs) هي قنوات غشائية مفتوحة تعتمد على F-actin وتلعب دورا حيويا في النقل بين الخلايا للبضائع والعضيات1. السمة الفريدة ل TNTs هي أنها تربط الخلايا المجاورة دون أي اتصال مع الطبقة التحتية. يزيد طولها عن 10-300 ميكرومتر وتتراوح أقطارها بين 50 نانومتر إلى 1 ميكرومتر 2,3. TNTs هي هياكل عابرة ، ويستمر عمرها ما بين بضع دقائق إلى عدة ساعات. تم عرض TNTs لأول مرة في الخلايا العصبية PC121 ؛ في وقت لاحق ، أظهرت العديد من الدراسات وجودها في عدة أنواع من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي 4,5. كشفت العديد من الدراسات عن الأهمية المرضية ل TNTs في نماذج الأمراض المختلفة ، مثل الأمراض التنكسية العصبية والسرطان والالتهابات الفيروسية6،7،8.
تم إثبات عدم التجانس الهيكلي ل TNTs من خلال العديد من الدراسات في الأنظمة الخلوية المختلفة9. وتستند الاختلافات على تكوين الهيكل الخلوي ، وآلية التكوين ، وأنواع البضائع المنقولة10. في المقام الأول ، تعتبر استمرارية الغشاء المفتوح الموجب للأكتين F التي تحوم بين خليتين متجاورتين وتنقل العضيات تتكون من TNTs11. ومع ذلك ، فإن عدم الوضوح أو التنوع الذي لوحظ في تكوين TNTs يضيف إلى صعوبة تطوير علامات خاصة بمادة TNT. وبالتالي ، من الصعب تحديد هياكل TNT بطرق الكشف التقليدية والتمييز بين الأنابيب النانوية الغشائية من حيث النتوءات المفتوحة والمغلقة12. ومع ذلك ، فإن خاصية TNTs التي تحوم كنتوءات غشاء F-actin بين خليتين أسهل نسبيا وأكثر جدوى في التعرف عليها باستخدام تقنيات التصوير التقليدية. لا يمكن للنتوءات الخلوية الأخرى القائمة على الأكتين مثل الفيلوبوديا والفيلوبوديا الظهرية أن تحوم بين خليتين بعيدتين ، خاصة عندما تكون الخلايا ثابتة. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية النامية ذات النهاية المغلقة والمقترنة كهربائيا غالبا ما تسمى الهياكل الشبيهة بمادة تي إن تي13.
من المعروف أن F-actin يلعب دورا مهما في تكوين مادة TNT ، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن مثبط F-actin cytochalasin D يمنع تكوين TNTs14,15. في المقابل ، مثبطات الأنابيب الدقيقة ليس لها أي تأثير على تكوين مادة تي إن تي16. شهدت العقود الماضية 2 العديد من التقارير حول الدور الهام الذي تلعبه TNTs في انتشار علم الأمراض ومقاومة الورم والعلاج17. لذلك ، هناك طلب لا ينتهي على تقنيات أفضل لتوصيف مادة تي إن تي.
إن عدم وجود علامات محددة ل TNTs والتنوع في التشكل والتكوين الخلوي الهيكلي يجعل من الصعب تطوير طريقة فريدة للتوصيف. استخدمت بعض الدراسات الكشف الآلي عن الصور وتقنيات القياس الكمي TNT18,19. ومع ذلك ، هناك العديد من المزايا لطريقة التحليل اليدوي لحجم 3D الحالية على تحليل الصور التلقائي للكشف عن مادة تي إن تي وقياسها. في كثير من الأحيان ، يمكن للعيون البشرية المدربة اكتشاف هذه الهياكل النانوية التي تحوم بسهولة أكبر من طريقة الكشف الآلي عن الصور. علاوة على ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ طرق الكشف التلقائي في المختبرات التي تفتقر إلى خبرة الخوارزميات. يمكن اعتماد الطريقة الحالية على نطاق واسع من قبل الباحثين بسبب دقتها وقابليتها للتكاثر.
في دراسة حديثة ، أظهرنا أن oAβ يعزز التكوين الحيوي ل TNTs في الخلايا العصبية عبر آلية التداخل الخلوي بوساطة PAK1 ، المعتمدة على الأكتين ،12. oتعبر TNTs المستحثة ب Aβ أيضا عن PAK1 المنشط (أو phospho-PAK1). قمنا بتطوير طريقة إعادة بناء صورة عرض حجم 3D للتمييز بين مادة TNTs الملطخة بالمناعة من oAβ و F-actin و phospho-PAK1. غالبا ما تشبه الخلايا العصبية النامية الإيجابية للتوبولين β-III هياكل تحوم تشبه مادة تي إن تي20. ومن ثم ، قمنا بتمييز TNTs القائمة على F-actin عن الخلايا العصبية الإيجابية للتوبولين β-III وغيرها من النتوءات الشبيهة بمادة TNT. تم استخدام صور عرض حجم 3D لتحديد TNTs على أساس خصائصها في التحليق فوق الطبقة التحتية والبقاء على اتصال بين خليتين متجاورتين. يصف هذا البحث تحديد واكتشاف القنوات الغشائية المحتوية على الأكتين أو TNTs باستخدام صور z-stack متحدة البؤر ، وأخيرا ، القياس الكمي اليدوي للهياكل المحددة من صور إعادة بناء عرض حجم 3D. لا يمكن للطريقة المقدمة التمييز بين TNTs الصحيحة المفتوحة النهاية والهياكل الشبيهة بمادة TNT المغلقة. تساعد هذه الطريقة في تحديد TNTs في ثقافة الخلايا 2D في المختبر على طبقة تحتية مسطحة. ومع ذلك ، فإن الطريقة سهلة التنفيذ والتكاثر ويمكن استخدامها على نطاق واسع للقياس الكمي الدقيق ل TNTs القائمة على الأكتين فقط ولتمييزها عن الخلايا العصبية والهياكل الشبيهة بمادة TNT الإيجابية β tubulin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

كشفت الاكتشافات الحديثة أن الخلايا تقوم بنقل مباشر وطويل المدى بين الخلايا عبر قنوات غشاء الأكتين على نطاق النانو ، وهي "الأنابيب النانوية النفقية" (TNTs). تعرف TNTs بأنها امتدادات غشائية مفتوحة وثنائية الطبقة دهنية تتوسط في الاستمرارية بين الخلايا المجاورة بأقطار تتراوح بين 50 نانومتر و 1 ميكرومتر. تم إثبات TNTs في البداية في الخلايا العصبية ، لكن الدراسات المتتالية كشفت عن وجود TNTs في العديد من أنواع الخلايا والأمراض ، مثل الأمراض التنكسية العصبية والالتهابات الفيروسية والسرطان. أشارت العديد من الدراسات إلى الهياكل النانوية الغشائية المغلقة والمقترنة كهربائيا بين الخلايا المجاورة على أنها TNTs أو هياكل تشبه TNT.
إن توضيح البنية التحتية من حيث استمرارية الغشاء عند نقطة النهاية يمثل تحديا تقنيا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات حول الاتصال بين الخلية والخلية تمثل تحديا من حيث توصيف TNTs باستخدام الطرق التقليدية بسبب عدم وجود علامات محددة. يتم تعريف TNTs في المقام الأول على أنها نتوءات غشائية مفتوحة النهاية قائمة على F-actin. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية هو أن F-actin موجود في جميع أنواع النتوءات ، مما يجعل من الصعب التمييز بين TNTs والنتوءات الأخرى. واحدة من الخصائص البارزة ل TNTs القائمة على F-actin هي أن هذه الهياكل تحوم بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية. لذلك ، يمكن تمييز TNTs المميزة الملطخة ب F-actin بسهولة عن النتوءات الأخرى مثل filopodia والخلايا العصبية بناء على تحليقها بين الخلايا.
لقد أظهرنا مؤخرا أن استيعاب الأميلويد قليل القسيمات β 1-42 (oAβ) عبر الإندوثرويد المعتمد على الأكتين يحفز كيناز -1 المنشط p21 (PAK1) ، والذي يتوسط في تكوين TNTs المحتوية على F-actin المعبر عنها مع phospho-PAK1 بين الخلايا العصبيةSH-SY5Y. يحدد هذا البروتوكول طريقة تحليل حجم 3D لتحديد وتوصيف TNTs من صور z-stack الملتقطة لنتوءات الغشاء المناعي F-actin- و phospho-PAK1 في الخلايا العصبية المعالجة ب oAβ. علاوة على ذلك ، تتميز TNTs عن تطوير الخلايا العصبية والنواتج العصبية القائمة على قنوات الغشاء الملطخ بالمناعة من الفوبولين F-actin و β-III.

هنا ، نحدد ونوصيف TNTs التي يسببها oAβ في الخلايا العصبية SH-SY5Y من خلال إنشاء طرق عرض حجم 3D من صور z-stack متحدة البؤر (الشكل 1). كانت الخلايا ملطخة بمناعة مزدوجة مع F-actin و phospho-PAK1. تم تحليل صور z-stack متحدة البؤر للخلايا المناعية لتحديد TNTs (الشكل 2). علاوة على ذلك ، تم تحلي?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

الأنابيب النانوية النفقية (TNTs) هي في المقام الأول أنابيب نانوية ذات غشاء F-actin مفتوحة النهاية تربط الخلايا المجاورة ، مما يسهل الاتصال بين الخلايا. السمة البارزة التي تميز TNTs عن نتوءات الخلايا الأخرى هي الطبيعة التي تحوم للأنابيب النانوية بين الخلايا. هنا ، نقوم بتمييز TNTs من خلال إنشاء عرض حجم 3D لصور z-stack متحدة البؤر.

الكشف والقياس الكمي للأنابيب النانوية النفقية باستخدام 3D حجم عرض الصور

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

إن عدم وجود علامات محددة للأنابيب النانوية النفقية يحد من التقدم في هذا المجال وهناك طلب متزايد على طريقة لتحديد وتوصيف وقياس الأنابيب النانوية النفقية. من الصعب تنفيذ طرق الكشف التلقائي بدون الخبرة اللازمة لتطوير خوارزمية و / أو تغيير الخوارزمية الحالية ، ولكن طريقتنا اليدوية سهلة التنفيذ بدقة أفضل. يتم تنفيذ النقل بعيد المدى بين الخلايا عبر الأنابيب النانوية النفقية بعدة طرق في نماذج الأمراض المختلفة ، بما في ذلك علم الأمراض التنكسية العصبية والانتشار الفيروسي والسرطان.وبالتالي ، فإن الدراسات على الأنابيب النانوية النفقية لفهم دورها في التسبب في المرض مهمة. من الممكن أن تنكسر الأنابيب النانوية النفقية أثناء عملية التلطيخ. تجنب استخدام زلات الغطاء والتركيب على الشرائح ، باستخدام أطباق التصوير ذات القاع الزجاجي بدلا من ذلك.يساعد بروتوكول التثبيت المعدل في الحفاظ على الأنابيب النانوية النفقية سليمة. سيوضح الإجراء ديباك كيه في ، طالب دكتوراه من مختبر سانجيتا ناف. للبدء ، اغسل الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة بقليل القسيمات A-beta مرتين باستخدام PBS لمدة دقيقتين قبل التثبيت.تحضير محلول كارنوفسكي المثبت باستخدام 2٪ مثبت فورمالين و 2.5٪ جلوتارالدهيد مذاب في محلول فوسفات مولاري 0.1 من الأس الهيدروجيني 7.2. ثم قم بإصلاح الخلايا في طبق التصوير عن طريق إضافة محلول Karnovsky المثبت لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحضير المخزن المؤقت الحضانة عن طريق إذابة 0.1 غرام من الصابونين في خمسة ملليلتر من FBS وتخفيفه بإضافة 95 ملليلتر من PBS.ثم اغسل الخلايا الثابتة مرتين باستخدام مخزن الحضانة لمدة دقيقتين. بعد التثبيت ، أضف أول جسم مضاد ضد phospho-PAK1 ، وأضف تخفيفا من واحد إلى 250 في مخزن الحضانة واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية في غرفة مظلمة ورطبة. في اليوم التالي بعد 24 ساعة من الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن الحضانة لمدة دقيقتين.ثم أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق إلى Alexa Fluor 488 و Phalloidin 555. احتضان الخلايا في غرفة مظلمة رطبة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام عازل الحضانة لمدة دقيقتين.قم بتلطيخ النواة عن طريق إضافة DAPI في تخفيف واحد إلى 2000 واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تحضير وسط تركيب دابكو باستخدام 25 ملليغرام من دابكو في 90٪ جلسرين و 10٪ PBS. للذوبان بشكل صحيح ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف من الدرجة الطيفية واحتفظ بالمحلول على هزاز للخلط.كعامل مضاد للتبييض، أضف وسيط تركيب دابكو مباشرة إلى طبق التصوير الذي يحتوي على زلة الغطاء في الأسفل. انتظر لمدة ساعة إلى ساعتين على الأقل وتابع مباشرة إجراء التصوير البؤري. لتحديد الأنابيب النانوية النفقية ، التقط صور Z-stack للخلايا الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر عن طريق تحديد القنوات أولا والنقر فوق أشعة الليزر المطلوبة بالتتابع في النوافذ المسار الأول والمسار الثاني والمسار الثالث في برنامج متحد البؤر.انقر فوق الخيار TPMT أسفل نافذة المسار الأولى لالتقاط صور تباين التداخل التفاضلي مع قنوات التألق. حدد علامة التبويب الاستحواذ الخاصة بالبرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب Z-stack ، وانتظر حتى تفتح نافذة. ثم انقر فوق Live Scan لتركيز الخلايا الموجودة أسفل الطبق.حدد تلك الصورة المركزة كأول مكدس، ثم ركز لأعلى لرؤية الجزء العلوي من الخلية، وحدده كآخر مكدس. أوقف المسح المباشر وانقر فوق الرقم الموجود بجوار علامة التبويب الأمثل لإصلاح حجم خطوة المداخن التي تحدد عدد الشرائح والفواصل الزمنية بناء على سمك الخلايا. التقط صورا متسلسلة لثلاث قنوات من DAPI و FITC و TRITC باستخدام ليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر والتقطها بوقت سكون بكسل يبلغ 1.02 ميكروثانية.التقط الصور في قناة DIC باستخدام قنوات مضان لمراقبة حدود الخلية. افتح الصور البؤرية المحفوظة بتنسيق بيانات czi في برنامج فيجي للتحليل. حدد خيار Hyperstack لرؤية كل مكدس Z وقناة الصورة.قم بتمرير القناة وأشرطة تمرير Z-stack لتحديد المكدس الدقيق لقناة معينة ذات أهمية. ثم حدد القناة الملطخة ب F-actin أولا عن طريق التمرير على شريط القناة والتمرير يدويا على Z-stacks لرؤية كل مكدس واحدا تلو الآخر. حدد الهياكل الملطخة ب F-actin التي يبدو أنها تربط الخلايا المرئية في الأجزاء السفلية من مداخن Z والقريبة من سطح طبق التصوير مع Z يساوي اثنين كعصبيين.حدد الأنابيب النانوية النفقية ، خلية F-actin الإيجابية التي تحوم إلى قنوات الخلية عن طريق تمرير مداخن Z نحو الأعلى من Z يساوي أربعة. ابحث عن الخلايا العصبية بالقرب من الأجزاء السفلية من مداخن Z باتجاه السطح ولاحظ أنها تبدأ في الاختفاء مع تمرير مداخن Z نحو الأعلى عند Z يساوي ستة. تحديد الأنابيب النانوية النفقية الإيجابية phospho-PAK1 بشكل مشابه للأنابيب النانوية النفقية النفقية الإيجابية F-actin من خلال تحليل طبيعة تحوم القنوات من مداخن Z.نظرا لأن تلطيخ الفوسفو-PAK1 أضعف من تلطيخ F-actin ، فابحث عن الأنابيب النانوية النفقية الملطخة بالفوسفو-PAK1 عند Z تساوي أربعة وعند Z تساوي ستة. علاوة على ذلك ، راقب صور DIC للتحقق من أن هياكل الأنابيب النانوية النفقية الملطخة بالفوسفات F-actin و phospho-PAK1 هي قنوات غشائية بين الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، قم بدمج قنوات F-actin و phospho-PAK1 للتحقق من أن الأنابيب النانوية النفقية المحددة هي هياكل ملطخة بالمشاركة F-actin و phospho-PAK1.لتحديد كمية الأنابيب النانوية النفقية ، قم بحساب إجمالي أرقام الخلايا والأنابيب النانوية النفقية المحددة يدويا وتمثيل الأرقام كنسب مئوية. للتمييز بين الأنابيب النانوية النفقية الأنبوبية الإيجابية F-actin و beta III مثل القنوات التي تحوم من صور Z-stack ، قم بدمج قنوات F-actin و beta III tubulin ، ثم قم بتحليل مداخن Z للصور المدمجة. ابحث عن الأنابيب النانوية النفقية الملطخة ب F-actin حصريا والتي يمكن رؤيتها بشكل خافت عند Z تساوي ثلاثة وبارزة عند Z تساوي ستة و Z تساوي تسعة.وبالمثل ، حدد F-actin و beta III tubulin. الأنابيب النانوية النفقية المزدوجة الإيجابية مثل قنوات التحليق عند Z تساوي ستة و Z تساوي تسعة. حدد نتوءات أخرى غير ملطخة بالفوبولين F-actin و beta III من الأجزاء السفلية من مداخن Z.قم بقياس قطر الأنابيب النانوية النفقية باستخدام أداة Line في فيجي. تحقق من مقياس القياس بالنقر فوق تحليل ثم قم بتعيين المقياس بحيث يتم تعيين المسافة بالبكسل تلقائيا من صور czi. قم بقياس أقطار الأنابيب النانوية النفقية في المستوى XY.باستخدام المكون الإضافي Volume Viewer في فيجي والذي يسمح بإعادة التقطيع ثلاثي الأبعاد والتصور ثلاثي الأبعاد الممكن للعتبة ، قم بتقسيم صور Z-stack إلى قنوات فردية. ثم قم بقص صور Z-stack أحادية القناة لاستخدام عرض إعادة الإعمار 3D لتسليط الضوء على واحد أو اثنين من الأنابيب النانوية النفقية أو الخلايا العصبية في وقت واحد. قم بتثبيت أنابيب نانوية نفقية واحدة أو عصبية في المستوى XY وحدد المقاطع العرضية للوصول XZ و YZ.راقب الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى XZ ، في المستويين XZ و YZ ، والأنابيب النانوية النفقية في مداخن Z العلوية. حدد الأنابيب النانوية النفقية الفردية أو neurite لإعادة بناء عرض حجم 3D في المستوى XZ. في إعادة البناء 3D ، لاحظ الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى Z والأنابيب النانوية النفقية التي تظهر كهياكل تحوم تربط خليتين دون لمس المستوى Z السفلي.تم تحليل صور Z-stack متحدة البؤر للخلايا المناعية مع F-actin و phospho-PAK1 لتحديد الأنابيب النانوية النفقية. علاوة على ذلك ، تم تحليل صور DIC للتحقق من أن هياكل الأنابيب النانوية النفقية الملطخة ب F-actin و phospho-PAK1 كانت قنوات غشائية بين الخلايا. كانت الخلايا ملطخة بمناعة مزدوجة مع توبولين F-actin و beta III وتم تمييز قنوات الغشاء الإيجابي المزدوج F-actin الأنبوبية الأنبوبية الأنبوبية الأنبوبية الإيجابية.تم تمييز الأنابيب النانوية النفقية المعبر عنها بالاشتراك مع phospho-PAK1 و F-actin عن نتوءات الخلايا العصبية الأخرى من خلال بناء صور عرض حجم 3D بناء على خصائصها المتمثلة في التحليق بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية. يعد استخدام العامل المثبت الأيمن أمرا مهما لأن التثبيت غير الكامل للعينة قد يؤدي إلى تدهور سريع للبروتين للبروتينات المستهدفة وتقليل النشاط المناعي المحدد.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

القلب حجم الضغط تحليل حلقة عن طريق القسطرة المواصلة في الفئران

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

كشف اللونية من البكتيريا عن طريق محك الاختبار

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

الآلي الكمي وتحليل إجراءات الفرز الخلية باستخدام يماغيج الإضافات

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

حجم تجزئة وتحليل المواد البيولوجية باستخدام منضدة سورفوس (منطقة عظمى تجزئة وحدة التخزين)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

القياس الكمي للمنافسة بين البكتيريا باستخدام التصوير الفلوري أحادي الخلية

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...