Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V og A.R takker Manipal Academy of Higher Education for TMA Pai-stipendiet. Vi takker Science and Engineering Research Board of India for SERB-SRG (#SRG/2021/001315) samt Indian Council of Medical Research of India (# 5/4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216/2020-NCD-I) og Intramural Fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Vi takker JNCASR's (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, Indien) konfokal facilitet og B. Suma for den konfokale mikroskopi i JNCASR.

BEMÆRK: SH-SY5Y-celler dyrket i DMEM/F-12-medier blev differentieret med 10 μM retinsyre i 7 dage og behandlet med 1 μM oAβ-oligomerer i 2 timer ved 37 °C (5 % CO2). Efter behandling blev cellerne fikseret med Karnovskys fikseringsopløsning og dobbeltimmunfarvet med phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistof og F-actinbindende phalloidin. Senere blev konfokale z-stack-billeder taget ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop. TNT'erne blev kvantificeret ved manuel tælling og skelnet fra andre n...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Flere forskere i de sidste 2 årtier har forsøgt at forstå og karakterisere strukturen af TNTs18. Manglen på specifikke markører hindrer fremskridt, og der er en stigende efterspørgsel efter en praktisk, standardiseret metode, der kan bruges til at identificere, karakterisere og kvantificere TNT'er. TNT'er defineres som F-actinbaserede membranledninger, der svæver mellem to celler. Undersøgelser har vist, at β-tubulin-positive, tætslutte, udviklende neuritter svæver mellem to fjerne cell...

Tunneling nanorør (TNT'er) er F-actin-baserede, primært åbne membranledninger og spiller en afgørende rolle i den intercellulære overførsel af last og organeller1. Det unikke kendetegn ved TNT'er er, at de forbinder naboceller uden kontakt med undergrunden; De er over 10-300 μm lange, og deres diametre varierer mellem 50 nm og 1 μm 2,3. TNT'er er forbigående strukturer, og deres levetid varer mellem et par minutter til flere timer. TNT'er blev først demonstreret i PC12 neuronale celler1; Senere viste talrige undersøgelser deres eksistens i flere celletyper in vitro og in vivo 4,5. Flere undersøgelser har afsløret den patologiske betydning af TNT'er i forskellige sygdomsmodeller, såsom neurodegenerative sygdomme, kræft og virusinfektioner 6,7,8.
De strukturelle heterogeniteter af TNT'er er blevet påvist ved flere undersøgelser i forskellige cellulære systemer9. Forskellene er baseret på cytoskeletsammensætning, dannelsesmekanismen og de overførte lasttyper10. Primært anses den åbne, F-actin-positive membrankontinuitet, der svæver mellem to naboceller og overfører organeller, for at bestå af TNT'er11. Den manglende klarhed eller mangfoldighed, der observeres i dannelsen af TNT'er, øger imidlertid vanskeligheden ved at udvikle TNT-specifikke markører. Det er således vanskeligt at identificere TNT-strukturer ved konventionelle detektionsmetoder og skelne membrannanorør med hensyn til åbne og tætte fremspring12. Imidlertid er karakteristikken ved TNT'er at svæve som F-actinmembranfremspring mellem to celler relativt lettere og mere gennemførlig at identificere ved hjælp af konventionelle billeddannelsesteknikker. Andre actinbaserede cellulære fremspring såsom filopodia og dorsal filopodia kan ikke svæve mellem to fjerne celler, især når celler er fastgjort. Bemærk, at tætte, elektrisk koblede, udviklende neuritter ofte kaldes TNT-lignende strukturer13.
Det er kendt, at F-actin spiller en vigtig rolle i TNT-dannelse, og flere undersøgelser har vist, at F-actinhæmmeren cytochalasin D hæmmer dannelsen af TNT'er14,15. I modsætning hertil har hæmmere af mikrotubuli ingen effekt på TNT-dannelse16. De sidste 2 årtier har set flere rapporter om den betydelige rolle, som TNT'er spiller i spredningen af patologi og tumorresistens og terapi17. Derfor er der en uendelig efterspørgsel efter bedre teknikker til TNT-karakterisering.
Manglen på specifikke markører for TNT'er og mangfoldigheden i morfologi og cytoskeletal sammensætning gør det vanskeligt at udvikle en unik karakteriseringsmetode. Nogle undersøgelser har brugt automatiseret billeddetektion og TNT-kvantificeringsteknikker18,19. Der er dog flere fordele ved den nuværende manuelle 3D-volumenanalysemetode i forhold til automatisk billedanalyse til påvisning og kvantificering af TNT'er. Desuden kan automatiske detektionsmetoder være vanskelige at implementere i laboratorier, der mangler algoritmeekspertise. Den nuværende metode kunne i vid udstrækning vedtages af forskere på grund af dens præcision og reproducerbarhed.
I en nylig undersøgelse viste vi, at oAβ fremmer biogenesen af TNT'er i neuronale celler via en PAK1-medieret, actinafhængig endocytosemekanisme12. oAβ-inducerede TNT'er udtrykker også aktiveret PAK1 (eller phospho-PAK1). Vi udviklede en 3D-volumenvisningsbilledrekonstruktionsmetode til at skelne mellem oAβ-inducerede, F-actin- og phospho-PAK1-immunostainerede TNT'er. β-III tubulin-positive, udviklende neuritter ligner ofte TNT-lignende svævende strukturer20. Derfor skelnede vi yderligere F-actin-baserede TNT'er fra β-III tubulin-positive neuritter og andre TNT-lignende fremspring. 3D-volumenvisningsbilleder er blevet brugt til at identificere TNT'er på grundlag af deres egenskaber ved at svæve over undergrunden og forblive forbundet mellem to naboceller. Dette papir beskriver identifikation og detektion af actinholdige membranledninger eller TNT'er ved hjælp af konfokale z-stack-billeder og endelig manuel kvantificering af de identificerede strukturer fra 3D-volumenvisningsrekonstruktionsbilleder. Den præsenterede metode kan ikke skelne åbne egentlige TNT'er fra tætte TNT-lignende strukturer; denne metode hjælper med at identificere TNT'er i in vitro 2D-cellekultur på et fladt underlag. Metoden er imidlertid let at implementere og reproducere og kan i vid udstrækning anvendes til præcis kvantificering af kun actinbaserede TNT'er og til at skelne dem fra neuritter og β-tubulinpositive TNT-lignende strukturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Nylige opdagelser har afsløret, at celler udfører direkte, langtrækkende, intercellulær overførsel via nanoskala, actin-membranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNT'er). TNT'er defineres som åbne, lipid dobbeltlagsomkransede membranforlængelser, der formidler kontinuitet mellem naboceller med diametre på mellem 50 nm og 1 μm. TNT'er blev oprindeligt demonstreret i neuronale celler, men successive undersøgelser har afsløret eksistensen af TNT'er i flere celletyper og sygdomme, såsom neurodegenerative sygdomme, virusinfektioner og kræft. Flere undersøgelser har henvist til tætte, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellem naboceller som TNT'er eller TNT-lignende strukturer.
Belysningen af ultrastruktur med hensyn til membrankontinuitet ved slutpunktet er teknisk udfordrende. Derudover er undersøgelser af cellecellekommunikation udfordrende med hensyn til karakterisering af TNT'er ved hjælp af konventionelle metoder på grund af manglen på specifikke markører. TNT'er defineres primært som F-actinbaserede, åbne membranfremspring. En væsentlig begrænsning er imidlertid, at F-actin er til stede i alle typer fremspring, hvilket gør det udfordrende at skelne TNT'er fra andre fremspring. Et af de bemærkelsesværdige kendetegn ved F-actinbaserede TNT'er er, at disse strukturer svæver mellem to celler uden at røre undergrunden. Derfor kan forskellige F-actinfarvede TNT'er bekvemt skelnes fra andre fremspring såsom filopodia og neuritter baseret på deres svævende mellem celler.
Vi har for nylig vist, at internaliseringen af oligomere amyloid-β1-42 (oAβ) via actinafhængig endocytose stimulerer aktiveret p21-aktiveret kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen af F-actinholdige TNT'er, der udtrykkes sammen med phospho-PAK1 mellem SH-SY5Y neuronale celler. Denne protokol skitserer en 3D-volumenanalysemetode til at identificere og karakterisere TNT'er fra de fangede z-stack-billeder af F-actin- og phospho-PAK1-immunostained membranfremspring i oAβ-behandlede neuronale celler. Endvidere skelnes TNT'er fra udvikling af neuritter og neuronale udvækst baseret på F-actin- og β-III tubulin-immunostained membranledninger.

Her identificerer og karakteriserer vi oAβ-inducerede TNT'er i SH-SY5Y neuronale celler ved at konstruere 3D-volumenvisninger fra konfokale z-stack-billeder (figur 1). Cellerne blev dobbeltimmunfarvet med F-actin og phospho-PAK1. Konfokale z-stack-billeder af immunfarvede celler blev analyseret for at identificere TNT'er (figur 2). Endvidere blev DIC-billeder analyseret for at verificere, at de F-actin- og phospho-PAK1-farvede TNT-strukturer var membranledninge...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tunneling nanorør (TNT'er) er primært åbne F-actin membran nanorør, der forbinder naboceller, hvilket letter intercellulær kommunikation. Den bemærkelsesværdige egenskab, der adskiller TNT'er fra andre cellefremspring, er nanorørenes svævende natur mellem celler. Her karakteriserer vi TNT'er ved at konstruere en 3D-volumenvisning af konfokale z-stack-billeder.

Detektion og kvantificering af tunnelnanorør ved hjælp af 3D-volumenvisningsbilleder

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Manglen på tunneling nanorør specifikke markører begrænser fremskridt på området, og der er en stigende efterspørgsel efter en metode til at identificere, karakterisere og kvantificere tunneling nanorør. Automatiske detektionsmetoder er vanskelige at implementere uden ekspertise til at udvikle en algoritme og/eller ændre den eksisterende algoritme, men vores manuelle metode er let at implementere med bedre præcision. Langtrækkende intercellulær overførsel via tunneling nanorør implementeres på flere måder i forskellige sygdomsmodeller, herunder neurodegenerativ patologi, viral spredning og kræft.Således er undersøgelser af tunneling nanorør for at forstå deres rolle i patogenese vigtige. Det er muligt, at tunnelnanorørene kan gå i stykker under farvningsprocessen. Undgå at bruge dækslips og montering på diasene, brug i stedet glasbundsbilledskåle.Modificeret fikseringsprotokol hjælper med at holde tunneling nanorør intakte. Deepak KV, en ph.d.-studerende fra Sangeeta NAF's laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med vaskes de kontrol- og oligomere A-beta-behandlede celler to gange med PBS i to minutter før fiksering.Karnovskys fikseringsopløsning fremstilles ved anvendelse af 2% formalinfikseringsmiddel og 2,5% glutaraldehyd opløst i 0,1 molær phosphatbuffer af pH 7,2. Fastgør derefter cellerne i billeddannelsesskålen ved at tilføje Karnovskys fikseringsopløsning i 45 minutter ved stuetemperatur. Inkubationsbufferen forbered ved at opløse 0,1 gram saponin i fem milliliter FBS og fortyndes ved tilsætning af 95 ml PBS.Vask derefter de faste celler to gange ved hjælp af inkubationsbuffer i to minutter. Efter fiksering tilsættes det første antistof mod phospho-PAK1, tilsæt en fortynding på en til 250 i inkubationsbufferen og inkuberes natten over ved fire grader Celsius i et mørkt, fugtigt kammer. Den næste dag efter 24 timers inkubation vaskes cellerne to gange med inkubationsbufferen i to minutter.Derefter tilsættes sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 og Phalloidin 555. Inkuber cellerne i det mørke, fugtige kammer i 1,5 timer ved stuetemperatur. Efter inkubationen vaskes cellerne to gange med inkubationsbuffer i to minutter.Plet kernen ved at tilsætte DAPI i en fortynding på en til 2000 og inkuberes i fem til 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Forbered DABCO monteringsmedium ved hjælp af 25 milligram DABCO i 90% glycerol og 10% PBS. For at opløses korrekt justeres pH til 8,6 ved hjælp af spektrofotometrisk kvalitet fortyndet saltsyre og holder opløsningen på en vipper til blanding.Som et antiblegemiddel tilsættes DABCO-monteringsmediet direkte på billeddannelsesskålen, der indeholder dækselslippet i bunden. Vent i mindst en til to timer, og fortsæt direkte med at udføre konfokal billeddannelse. For at identificere tunneling nanorør skal du fange Z-stack-billeder af immunfarvede celler ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop ved først at vælge kanalerne og klikke på de nødvendige lasere sekventielt i vinduerne spor et, spor to og spor tre i konfokalsoftwaren.Klik på indstillingen TPMT under vinduet spor et for at tage kontrastbillederne for differentiel interferens med fluorescenskanaler. Vælg fanen Anskaffelse af softwaren, klik på fanen Z-stack, og vent på, at et vindue åbnes. Klik derefter på Live Scan for at fokusere cellerne i bunden af skålen.Vælg det fokuserede billede som den første stak, og fokuser derefter op for at se den øverste del af cellen, og vælg det som den sidste stak. Stop live scanning, og klik på nummeret ved siden af fanen Optimal for at rette trinstørrelsen på stablerne, der bestemmer antallet af udsnit og intervallerne baseret på cellernes tykkelse. Tag sekventielle billeder af tre kanaler med DAPI, FITC og TRITC med 405 nanometer, 488 nanometer og 561 nanometer lasere og tag med en pixelopholdstid på 1,02 mikrosekund.Tag billeder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler for at observere cellegrænsen. Åbn de konfokale billeder, der er gemt i czi-dataformat i Fiji-software til analyse. Vælg indstillingen Hyperstack for at se hver Z-stak og kanal i billedet.Rul i kanalen og Z-stack-rullepanelerne for at vælge den nøjagtige stak for en bestemt kanal af interesse. Vælg derefter den F-actin farvede kanal først ved at rulle kanallinjen og manuelt rulle Z-stacks for at se hver stak en efter en. Identificer de F-actinfarvede strukturer, der ser ud til at forbinde celler, der er synlige i de nederste dele af Z-stakke og er tæt på overfladen af billeddannelsesskålen med Z lig med to som neuritter.Identificer tunnelnanorørene, den F-actin-positive svævende celle til celleledninger ved at rulle Z-stakke mod toppen fra Z er lig med fire. Se efter neuritter nær de nederste dele af Z-stablerne mod overfladen og observer, at de begynder at forsvinde med rulning af Z-stakke mod toppen ved Z svarende til seks. Identificer phospho-PAK1 positive tunneling nanorør på samme måde som F-actin positive tunneling nanorør ved at analysere den svævende karakter af ledningerne fra Z-stacks.Da phospho-PAK1-farvning er svagere end F-actinfarvning, skal du kigge efter fosfo-PAK1-farvede tunnelnanorør ved Z svarende til fire og ved Z lig med seks. Observer endvidere DIC-billederne for at kontrollere, at F-actin og phospho-PAK1 farvede tunneling nanorørstrukturer er membranledninger mellem celler. Derudover fusioneres F-actin- og phospho-PAK1-kanaler for at verificere, at de identificerede tunnelnanorør er F-actin og phospho-PAK1 co-farvede strukturer.For at kvantificere tunnelnanorørene skal du tælle de samlede cellenumre og de identificerede tunnelnanorør manuelt og repræsentere tallene som procentdele. For at skelne F-actin og beta III tubulin positive tunneling nanorør som svævende ledninger fra Z-stack billeder, fusionere F-actin og beta III tubulin kanaler og derefter analysere Z-stacks af de fusionerede billeder. Se udelukkende efter F-actin farvede tunneling nanorør, der er svagt synlige ved Z lig med tre og fremtrædende ved Z lig med seks og Z lig med ni.På samme måde identificeres F-actin og beta III tubulin. dobbeltpositive tunnelnanorør som svævende ledninger ved Z lig med seks og Z lig med ni. Identificer andre F-actin og beta III tubulin farvede ikke-svævende fremspring fra de nederste dele af Z-stakke.Mål diameteren af tunnelnanorørene ved hjælp af Line-værktøjet i Fiji. Kontrollér måleskalaen ved at klikke på Analysér, og indstil derefter skalaen, så afstanden i pixel indstilles automatisk fra czi-billederne. Mål diametrene på tunnelnanorørene ved XY-planet.Brug Volume Viewer-pluginet i Fiji, som tillader 3D-udskæring og tærskelaktiveret 3D-visualisering, opdel Z-stack-billederne i individuelle kanaler. Beskær derefter enkeltkanals Z-stack-billeder for at bruge 3D-rekonstruktionsvisning til at fremhæve et eller to tunnelerende nanorør eller neuritter ad gangen. Fastgør et enkelt tunnelnanorør eller neurit i XY-planet, og markér XZ- og YZ-adgangstværsnit.Overhold neuritterne i bunden af XZ-planet, i XZ- og YZ-flyene og tunnelnanorørene i de øverste Z-stakke. Vælg de enkelte tunnelnanorør eller neurit for at rekonstruere 3D-volumenvisningen i XZ-planet. I 3D-rekonstruktionen observeres neuritterne i bunden af Z-planet og tunnelnanorørene, der fremstår som svævende strukturer, der forbinder to celler uden at røre det nederste Z-plan.Konfokale Z-stack-billeder af immunfarvede celler med F-actin og phospho-PAK1 blev analyseret for at identificere tunneling nanorør. Endvidere blev DIC-billeder analyseret for at verificere, at F-actin og phospho-PAK1 farvede tunneling nanorørstrukturer var membranledninger mellem celler. Cellerne blev dobbelt immunstained med F-actin og beta III tubulin og tunneling nanotube-lignende F-actin og tunneling nanotube-lignende F-actin og beta III tubulin dobbelt positive membran ledninger blev skelnet fra kun F-actin positive tunneling nanorør.Tunnelnanorørene udtrykt sammen med phospho-PAK1 og F-actin blev adskilt fra andre neuritters cellefremspring ved at konstruere 3D-volumenvisningsbilleder baseret på deres karakteristika ved at svæve mellem to celler uden at røre undergrunden. Brug af det rigtige fikseringsmiddel er vigtigt, da ufuldkommen fiksering af prøven kan føre til hurtig proteolytisk nedbrydning af målproteinerne og en reduktion i den specifikke immunreaktivitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac Pressure-Volume Loop Analyse Brug Ledningsevne Katetre i mus

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolorimetrisk påvisning af bakterier Brug lakmusprøve

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Automatiseret Kvantificering og analyse af celletælling Procedurer Brug ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Trække membran nanorør fra Giant Unilamellar blærer

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volumen segmentering og analyse af biologiske materialer ved hjælp af SuRVoS (Super-regionen volumen segmentering) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantificering af cellulære tætheder og antigene egenskaber ved hjælp af magnetisk levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantificering af interbakteriel konkurrence ved hjælp af enkeltcellet fluorescens imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...