Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V en A.R bedanken de Manipal Academy of Higher Education voor de TMA Pai fellowship. We bedanken de Science and Engineering Research Board of India voor SERB-SRG (#SRG/2021/001315), evenals de Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) en het Intramurale fonds van de Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. We bedanken JNCASR's (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, India) confocale faciliteit en B. Suma voor de confocale microscopie in JNCASR.

OPMERKING: SH-SY5Y-cellen gekweekt in DMEM/F-12-media werden gedifferentieerd met 10 μM retinoïnezuur gedurende 7 dagen en behandeld met 1 μM oAβ-oligomeren gedurende 2 uur bij 37 °C (5% CO2). Na de behandeling werden de cellen gefixeerd met Karnovsky's fixatieve oplossing en dubbel-immunos gekleurd met fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antilichaam en F-actine-bindende falloïdine. Later werden confocale z-stack beelden gemaakt met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. De TNT's werden gekwantifi...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Verschillende onderzoekers in de afgelopen 2 decennia hebben geprobeerd de structuur van TNT's18 te begrijpen en te karakteriseren. Het ontbreken van specifieke markers belemmert de vooruitgang en er is een toenemende vraag naar een handige, gestandaardiseerde methode die kan worden gebruikt om TNT's te identificeren, karakteriseren en kwantificeren. TNT's worden gedefinieerd als op F-actine gebaseerde membraankanalen die tussen twee cellen zweven. Studies hebben aangetoond dat β-tubuline-positie...

Tunneling nanobuizen (TNT's) zijn op F-actine gebaseerde, voornamelijk open membraankanalen en spelen een vitale rol bij de intercellulaire overdracht van lading en organellen1. Het unieke kenmerk van TNT's is dat ze naburige cellen verbinden zonder enig contact met het substraat; ze zijn meer dan 10-300 μm lang en hun diameters variëren tussen 50 nm en 1 μm 2,3. TNT's zijn voorbijgaande structuren en hun levensduur duurt tussen enkele minuten tot enkele uren. TNT's werden voor het eerst aangetoond in PC12 neuronale cellen1; later toonden talrijke studies hun bestaan aan in verschillende celtypen in vitro en in vivo 4,5. Verschillende studies hebben de pathologische betekenis van TNT's in verschillende ziektemodellen aangetoond, zoals neurodegeneratieve ziekten, kanker en virale infecties 6,7,8.
De structurele heterogeniteiten van TNT's zijn aangetoond door verschillende studies in verschillende cellulaire systemen9. De verschillen zijn gebaseerd op de samenstelling van het cytoskelet, het vormingsmechanisme en de overgedragen ladingtypen10. In de eerste plaats wordt de open, F-actine-positieve membraancontinuïteit die zweeft tussen twee naburige cellen en organellen overdraagt, beschouwd als bestaande uit TNT's11. Het gebrek aan duidelijkheid of diversiteit dat wordt waargenomen bij de vorming van TNT's draagt echter bij aan de moeilijkheid om TNT-specifieke markers te ontwikkelen. Het is dus moeilijk om TNT-structuren te identificeren met conventionele detectiemethoden en membraannanobuisjes te onderscheiden in termen van open en close-ended uitsteeksels12. Het kenmerk van TNT's om te zweven als F-actine membraanuitsteeksels tussen twee cellen is echter relatief gemakkelijker en haalbaarder om te identificeren met behulp van conventionele beeldvormingstechnieken. Andere op actine gebaseerde cellulaire uitsteeksels zoals filopodia en dorsale filopodia kunnen niet zweven tussen twee verre cellen, vooral wanneer cellen vast zijn. Van belang is dat close-end, elektrisch gekoppelde, ontwikkelende neurieten vaak TNT-achtige structuren13 worden genoemd.
Het is bekend dat F-actine een belangrijke rol speelt bij de vorming van TNT en verschillende studies hebben aangetoond dat de F-actineremmer cytochalasine D de vorming van TNT's14,15 remt. Daarentegen hebben remmers van microtubuli geen effect op TNT-vorming16. De afgelopen 2 decennia hebben verschillende rapporten gezien over de belangrijke rol die TNT's spelen bij de verspreiding van pathologie en tumorresistentie en therapie17. Daarom is er een nooit eindigende vraag naar betere technieken voor TNT-karakterisering.
Het ontbreken van specifieke markers van TNT's en de diversiteit in morfologie en cytoskeletsamenstelling maken het moeilijk om een unieke methode van karakterisering te ontwikkelen. Sommige studies hebben geautomatiseerde beelddetectie en TNT-kwantificeringstechnieken gebruikt18,19. Er zijn echter verschillende voordelen van de huidige 3D-volume handmatige analysemethode ten opzichte van automatische beeldanalyse voor de detectie en kwantificering van TNT's. Vaak kunnen getrainde menselijke ogen deze zwevende nanostructuren gemakkelijker herkennen dan een geautomatiseerde beelddetectiemethode. Bovendien kunnen automatische detectiemethoden moeilijk te implementeren zijn in laboratoria zonder algoritme-expertise. De huidige methode kan op grote schaal worden toegepast door onderzoekers vanwege de precisie en reproduceerbaarheid.
In een recente studie toonden we aan dat oAβ de biogenese van TNT's in neuronale cellen bevordert via een PAK1-gemedieerd, actine-afhankelijk, endocytosemechanisme12. oAβ-geïnduceerde TNT's drukken ook geactiveerd PAK1 (of fosfo-PAK1) uit. We ontwikkelden een 3D volume view beeldreconstructiemethode om oAβ-geïnduceerde, F-actine- en fosfo-PAK1-immunostained TNT's te onderscheiden. β-III tubuline-positieve, ontwikkelende neurieten lijken vaak op TNT-achtige zwevende structuren20. Daarom onderscheidden we verder op F-actine gebaseerde TNT's van β-III tubuline-positieve neurieten en andere TNT-achtige uitsteeksels. 3D-volumeweergavebeelden zijn gebruikt om TNT's te identificeren op basis van hun kenmerken van zweven over het substraat en verbonden blijven tussen twee naburige cellen. Dit artikel beschrijft de identificatie en detectie van actine-bevattende membraankanalen of TNT's met behulp van confocale z-stack-afbeeldingen en, ten slotte, handmatige kwantificering van de geïdentificeerde structuren uit 3D-volumeweergavereconstructiebeelden. De gepresenteerde methode kan geen onderscheid maken tussen open-ended juiste TNT's en close-ended TNT-achtige structuren; deze methode helpt bij het identificeren van TNT's in in vitro 2D-celcultuur op een platte ondergrond. De methode is echter eenvoudig te implementeren en te reproduceren en kan op grote schaal worden gebruikt voor de nauwkeurige kwantificering van alleen op actine gebaseerde TNT's en om ze te onderscheiden van neurieten en β-tubulinepositieve TNT-achtige structuren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat cellen directe, intercellulaire overdracht op lange afstand uitvoeren via nanoschaal, actine-membraankanalen, namelijk "tunneling nanobuisjes" (TNT's). TNT's worden gedefinieerd als open einde, lipide bilayer-omcirkelde membraanuitbreidingen die de continuïteit bemiddelen tussen naburige cellen met diameters variërend tussen 50 nm en 1 μm. TNT's werden aanvankelijk aangetoond in neuronale cellen, maar opeenvolgende studies hebben het bestaan van TNT's aangetoond in verschillende celtypen en ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten, virale infecties en kanker. Verschillende studies hebben verwezen naar close-ended, elektrisch gekoppelde membraan nanostructuren tussen naburige cellen als TNT's of TNT-achtige structuren.
De opheldering van ultrastructuur in termen van membraancontinuïteit op het eindpunt is technisch uitdagend. Bovendien zijn studies over cel-celcommunicatie een uitdaging in termen van de karakterisering van TNT's met behulp van conventionele methoden vanwege het ontbreken van specifieke markers. TNT's worden voornamelijk gedefinieerd als op F-actine gebaseerde, open membraanuitsteeksels. Een belangrijke beperking is echter dat F-actine aanwezig is in alle soorten uitsteeksels, waardoor het een uitdaging is om TNT's van andere uitsteeksels te onderscheiden. Een van de opmerkelijke kenmerken van op F-actine gebaseerde TNT's is dat deze structuren tussen twee cellen zweven zonder het substraat aan te raken. Daarom kunnen verschillende F-actine-gekleurde TNT's gemakkelijk worden onderscheiden van andere uitsteeksels zoals filopodia en neurieten op basis van hun zweven tussen cellen.
We hebben onlangs aangetoond dat de internalisatie van oligomere amyloïde-β1-42 (oAβ) via actine-afhankelijke endocytose geactiveerde p21-geactiveerde kinase-1 (PAK1) stimuleert, wat de vorming van F-actine-bevattende TNT's bemiddelt die gecoexpresseerd zijn met fosfo-PAK1 tussen SH-SY5Y neuronale cellen. Dit protocol schetst een 3D-volumeanalysemethode om TNT's te identificeren en te karakteriseren uit de vastgelegde z-stackbeelden van F-actine- en fosfo-PAK1-immunogekleurde membraanuitsteeksels in met oAβ behandelde neuronale cellen. Verder onderscheiden TNT's zich van het ontwikkelen van neurieten en neuronale uitwassen op basis van F-actine- en β-III tubuline-immunostained membraankanalen.

Hier identificeren en karakteriseren we oAβ-geïnduceerde TNT's in SH-SY5Y neuronale cellen door 3D-volumeweergaven te construeren uit confocale z-stack-afbeeldingen (figuur 1). De cellen waren dubbel-immunostained met F-actine en fosfo-PAK1. Confocale z-stack beelden van immunogekleurde cellen werden geanalyseerd om TNT's te identificeren (figuur 2). Verder werden DIC-beelden geanalyseerd om te verifiëren dat de F-actine- en fosfo-PAK1-gekleurde TNT-structure...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tunneling nanobuisjes (TNT's) zijn voornamelijk open-end F-actine membraan nanobuizen die naburige cellen verbinden, waardoor intercellulaire communicatie wordt vergemakkelijkt. Het opvallende kenmerk dat TNT's onderscheidt van andere celuitsteeksels is de zwevende aard van de nanobuisjes tussen cellen. Hier karakteriseren we TNT's door een 3D-volumeweergave van confocale z-stack-afbeeldingen te construeren.

Detectie en kwantificering van tunnelende nanobuizen met behulp van 3D-volumeweergaveafbeeldingen

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Het ontbreken van tunnelende nanobuisjes specifieke markers beperkt de vooruitgang in het veld en er is een toenemende vraag naar een methode om tunnelende nanobuizen te identificeren, karakteriseren en kwantificeren. Automatische detectiemethoden zijn moeilijk te implementeren zonder de expertise om een algoritme te ontwikkelen en/of het bestaande algoritme te wijzigen, maar onze handmatige methode is eenvoudig met meer precisie te implementeren. Intercellulaire overdracht over lange afstand via tunnelende nanobuisjes wordt op verschillende manieren geïmplementeerd in verschillende ziektemodellen, waaronder neurodegeneratieve pathologie, virale verspreiding en kanker.Studies over het tunnelen van nanobuisjes om hun rol in pathogenese te begrijpen, zijn dus belangrijk. Het is mogelijk dat de tunnelende nanobuisjes breken tijdens het kleuringsproces. Vermijd het gebruik van afdekslips en montage op de dia's, gebruik in plaats daarvan beeldschalen met een glazen bodem.Aangepast fixatieprotocol helpt om tunnelende nanobuisjes intact te houden. De procedure wordt gedemonstreerd door Deepak KV, een promovendus van het laboratorium van Sangeeta NAF. Om te beginnen, was de controle en oligomere A-bèta behandelde cellen tweemaal met PBS gedurende twee minuten vóór fixatie.Bereid Karnovsky's fixatieve oplossing met behulp van 2% formaline fixatief en 2,5% glutaaraldehyde opgelost in 0,1 molaire fosfaatbuffer van pH 7,2. Bevestig vervolgens de cellen in de beeldvormingsschaal door de fixatieve oplossing van Karnovsky gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen. Bereid de incubatiebuffer voor door 0,1 gram saponine op te lossen in vijf milliliter FBS en verdund door toevoeging van 95 milliliter PBS.Was vervolgens de vaste cellen twee keer met behulp van incubatiebuffer gedurende twee minuten. Voeg na fixatie het eerste antilichaam tegen fosfo-PAK1 toe, voeg een verdunning van één tot 250 toe aan de incubatiebuffer en incubeer een nacht bij vier graden Celsius in een donkere, vochtige kamer. Was de volgende dag na 24 uur incubatie de cellen twee keer met de incubatiebuffer gedurende twee minuten.Voeg vervolgens secundair antilichaam geconjugeerd toe aan Alexa Fluor 488 en Phalloidin 555. Incubeer de cellen in de donkere, vochtige kamer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen na de incubatie twee keer met incubatiebuffer gedurende twee minuten.Kleur de kern door DAPI toe te voegen in een verdunning van één tot 2000 en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid DABCO-montagemedium met 25 milligram DABCO in 90% glycerol en 10% PBS. Om goed op te lossen, stelt u de pH in op 8,6 met behulp van spectrofotometrisch verdund zoutzuur en houdt u de oplossing op een rocker om te mengen.Voeg als antibleekmiddel het DABCO-montagemedium rechtstreeks toe aan de beeldvormende schotel met de afdekslip aan de onderkant. Wacht minstens één tot twee uur en ga direct verder met het uitvoeren van confocale beeldvorming. Om tunnelende nanobuisjes te identificeren, legt u Z-stack-afbeeldingen van immunogekleurde cellen vast met behulp van een confocale laserscanmicroscoop door eerst de kanalen te selecteren en de vereiste lasers sequentieel in de vensters te klikken, track één, track twee en track drie in de confocale software.Klik op de optie TPMT onder het track één venster om de differentiële interferentiecontrastbeelden met fluorescentiekanalen te maken. Selecteer het tabblad Acquisitie van de software, klik op het tabblad Z-stack en wacht tot er een venster wordt geopend. Klik vervolgens op Live scan om de cellen onder aan het gerecht scherp te stellen.Selecteer die gefocuste afbeelding als de eerste stapel en stel vervolgens scherp om het bovenste deel van de cel weer te geven en selecteer dat als de laatste stapel. Stop live scannen en klik op het getal naast het tabblad Optimaal om de stapgrootte van de stapels vast te stellen, die het aantal segmenten en de intervallen bepaalt op basis van de dikte van de cellen. Maak sequentiële beelden van drie kanalen van DAPI, FITC en TRITC met 405 nanometer, 488 nanometer en 561 nanometer lasers en leg vast met een pixel dwell tijd van 1,02 microseconde.Leg beelden vast in het DIC-kanaal met fluorescentiekanalen om de celgrens te observeren. Open de confocale afbeeldingen die zijn opgeslagen in czi-gegevensformaat in Fiji-software voor analyse. Selecteer de Hyperstack optie om elke Z-stack en kanaal van de image te zien.Blader door het kanaal en de Z-stack schuifbalken om de exacte stapel van een bepaald interessant kanaal te selecteren. Selecteer vervolgens eerst het F-actin-gekleurde kanaal door door de kanaalbalk te scrollen en handmatig door de Z-stacks te scrollen om elke stapel één voor één te zien. Identificeer de F-actine gekleurde structuren die cellen lijken te verbinden die zichtbaar zijn in de onderste delen van de Z-stacks en zich dicht bij het oppervlak van de beeldvormingsschaal bevinden met Z gelijk aan twee als neurieten.Identificeer de tunnelende nanobuisjes, de F-actine positieve zwevende cel naar celkanalen door de Z-stapels naar boven te scrollen van Z is gelijk aan vier. Zoek naar neurieten in de buurt van de onderste delen van de Z-stapels naar het oppervlak en merk op dat ze beginnen te verdwijnen met het scrollen van Z-stapels naar boven bij Z gelijk aan zes. Identificeer fosfo-PAK1 positieve tunneling nanobuisjes op dezelfde manier als F-actine positieve tunneling nanobuisjes door de zwevende aard van de leidingen van de Z-stacks te analyseren.Omdat fosfo-PAK1-kleuring zwakker is dan F-actinekleuring, zoekt u naar fosfo-PAK1-gekleurde tunneling nanobuisjes bij Z gelijk aan vier en bij Z gelijk aan zes. Observeer verder de DIC-afbeeldingen om te verifiëren dat de F-actine en fosfo-PAK1-gekleurde tunnelvormige nanobuisstructuren membraankanalen tussen cellen zijn. Voeg bovendien F-actine- en fosfo-PAK1-kanalen samen om te controleren of de geïdentificeerde tunnelende nanobuisjes F-actine en fosfo-PAK1 co-gekleurde structuren zijn.Om de tunnelende nanobuisjes te kwantificeren, telt u de totale celaantallen en de geïdentificeerde tunnelnanobuisjes handmatig en geeft u de getallen weer als percentages. Om F-actine en bèta III tubuline positieve tunneling nanobuisjes zoals zwevende buizen van Z-stack afbeeldingen te onderscheiden, voegt u F-actine en beta III tubulinekanalen samen en analyseert u vervolgens de Z-stacks van de samengevoegde afbeeldingen. Zoek naar uitsluitend F-actine gekleurde tunnelvormige nanobuisjes die vaag zichtbaar zijn bij Z gelijk aan drie en prominent bij Z gelijk aan zes en Z gelijk aan negen.Identificeer op dezelfde manier F-actine en bèta III-tubuline. dubbel-positieve tunnelende nanobuisjes zoals zwevende leidingen op Z gelijk aan zes en Z gelijk aan negen. Identificeer andere F-actine en beta III tubuline gekleurde niet-zwevende uitsteeksels van de onderste delen van de Z-stacks.Meet de diameter van de tunnelende nanobuisjes met behulp van de Line-tool in Fiji. Controleer de meetschaal door op Analyseren te klikken en stel vervolgens schaal in zodat de afstand in pixels automatisch wordt ingesteld op basis van de czi-afbeeldingen. Meet de diameters van de tunnelende nanobuisjes op het XY-vlak.Met behulp van de Volume Viewer-plug-in in Fiji, die 3D-re-slicing en drempelgestuurde 3D-visualisatie mogelijk maakt, splitst u de Z-stack-afbeeldingen in afzonderlijke kanalen. Snijd vervolgens de Z-stack-afbeeldingen met één kanaal bij om de 3D-reconstructieweergave te gebruiken om een of twee tunnelende nanobuisjes of neurieten tegelijk te markeren. Pin een enkele tunneling nanobuisjes of neuriet in het XY-vlak en markeer XZ- en YZ-toegangsdoorsneden.Observeer de neurieten aan de onderkant van het XZ-vlak, in de XZ- en YZ-vlakken, en de tunnelende nanobuisjes in de bovenste Z-stacks. Selecteer de afzonderlijke tunneling nanobuisjes of neuriet om de 3D-volumeweergave in het XZ-vlak te reconstrueren. Observeer in de 3D-reconstructie de neurieten aan de onderkant van het Z-vlak en de tunnelende nanobuisjes die verschijnen als zwevende structuren die twee cellen verbinden zonder het onderste Z-vlak aan te raken.Confocale Z-stack beelden van immunogekleurde cellen met F-actine en fosfo-PAK1 werden geanalyseerd om tunnelende nanobuisjes te identificeren. Verder werden DIC-beelden geanalyseerd om te verifiëren dat de F-actine en fosfo-PAK1 gekleurde tunnelvormige nanobuisjesstructuren membraankanalen tussen cellen waren. De cellen waren dubbel immunostained met F-actine en beta III tubuline en de tunneling nanobuisachtige F-actine en de tunneling nanobuisachtige F-actine en beta III tubuline dubbele positieve membraankanalen werden onderscheiden van alleen F-actine positieve tunneling nanobuisjes.De tunnelende nanobuisjes die samen tot expressie komen met fosfo-PAK1 en F-actine werden onderscheiden van de celuitsteeksels van andere neurieten door 3D-volumeweergavebeelden te construeren op basis van hun kenmerk van zweven tussen twee cellen zonder het substraat aan te raken. Het gebruik van het juiste fixatiemiddel is belangrijk omdat onvolmaakte fixatie van het monster kan leiden tot snelle proteolytische afbraak van de doeleiwitten en een vermindering van de specifieke immunoreactiviteit.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiale druk-volume curve analyse met behulp Conductance katheters in Muizen

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Geautomatiseerde kwantificering en analyse van Cell Counting Procedures Met behulp van ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volume segmentatie en analyse van biologische materialen met behulp van de SuRVoS (Super regio Volume segmentatie) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...