Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V und A.R danken der Manipal Academy of Higher Education für das TMA Pai-Stipendium. Wir danken dem Science and Engineering Research Board of India für SERB-SRG (#SRG/2021/001315) sowie dem Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) und dem Intramural Fund der Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Wir danken der konfokalen Einrichtung des JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indien) und B. Suma für die konfokale Mikroskopie in JNCASR.

HINWEIS: SH-SY5Y-Zellen, die in DMEM/F-12-Medien kultiviert wurden, wurden 7 Tage lang mit 10 μM Retinsäure differenziert und 2 h lang bei 37 °C (5%CO2) mit 1 μM oAβ-Oligomeren behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit Karnovskys Fixierlösung fixiert und mit Phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) Antikörper und F-Aktin-bindendem Phalloidin doppelt immungefärbt. Später wurden konfokale Z-Stack-Bilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Die TNTs wurden durch manuelle Zähl...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Mehrere Forscher haben in den letzten 2 Jahrzehnten versucht, die Struktur von TNTs18 zu verstehen und zu charakterisieren. Das Fehlen spezifischer Marker behindert den Fortschritt, und es besteht eine zunehmende Nachfrage nach einer praktischen, standardisierten Methode, mit der TNTs identifiziert, charakterisiert und quantifiziert werden können. TNTs sind definiert als F-Aktin-basierte Membranleitungen, die zwischen zwei Zellen schweben. Studien haben gezeigt, dass β-Tubulin-positive, geschlos...

Tunneling Nanotubes (TNTs) sind F-Aktin-basierte, hauptsächlich offene Membrankanäle und spielen eine wichtige Rolle beim interzellulären Transfer von Fracht und Organellen1. Das einzigartige Merkmal von TNTs ist, dass sie benachbarte Zellen ohne Kontakt mit dem Substrat verbinden; Sie sind über 10-300 μm lang und ihre Durchmesser variieren zwischen 50 nm und 1 μm 2,3. TNTs sind vorübergehende Strukturen, und ihre Lebensdauer dauert zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden. TNTs wurden erstmals in PC12-Nervenzellen nachgewiesen1; Später zeigten zahlreiche Studien ihre Existenz in mehreren Zelltypen in vitro und in vivo 4,5. Mehrere Studien haben die pathologische Bedeutung von TNTs in verschiedenen Krankheitsmodellen wie neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen gezeigt 6,7,8.
Die strukturellen Heterogenitäten von TNTs wurden durch mehrere Studien in verschiedenen zellulären Systemen nachgewiesen9. Die Unterschiede beruhen auf der Zusammensetzung des Zytoskeletts, dem Mechanismus der Bildung und den übertragenen Frachttypen10. In erster Linie wird angenommen, dass die offene, F-Aktin-positive Membrankontinuität, die zwischen zwei benachbarten Zellen schwebt und Organellen überträgt, aus TNTs11 besteht. Der Mangel an Klarheit oder Vielfalt, der bei der Bildung von TNTs beobachtet wird, trägt jedoch zur Schwierigkeit bei der Entwicklung von TNT-spezifischen Markern bei. Daher ist es schwierig, TNT-Strukturen mit herkömmlichen Detektionsmethoden zu identifizieren und Membrannanoröhren in Bezug auf offene und geschlossene Vorsprünge zu unterscheiden12. Die Eigenschaft von TNTs, als F-Aktin-Membranvorsprünge zwischen zwei Zellen zu schweben, ist jedoch mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren relativ einfacher und praktikabler zu identifizieren. Andere Aktin-basierte zelluläre Vorsprünge wie Filopodien und dorsale Filopodien können nicht zwischen zwei entfernten Zellen schweben, insbesondere wenn Zellen fixiert sind. Bemerkenswert ist, dass geschlossene, elektrisch gekoppelte, sich entwickelnde Neuriten oft als TNT-ähnliche Strukturen bezeichnetwerden 13.
Es ist bekannt, dass F-Aktin eine wichtige Rolle bei der TNT-Bildung spielt, und mehrere Studien haben gezeigt, dass der F-Aktin-Inhibitor Cytochalasin D die Bildung von TNTs14,15 hemmt. Im Gegensatz dazu haben Inhibitoren von Mikrotubuli keinen Einfluss auf die TNT-Bildung16. In den letzten 2 Jahrzehnten gab es mehrere Berichte über die bedeutende Rolle, die TNTs bei der Ausbreitung von Pathologie und Tumorresistenz und Therapie spielen17. Daher gibt es eine nie endende Nachfrage nach besseren Techniken zur TNT-Charakterisierung.
Das Fehlen spezifischer TNT-Marker und die Vielfalt in Morphologie und Zusammensetzung des Zytoskeletts erschweren die Entwicklung einer einzigartigen Charakterisierungsmethode. Einige Studien haben automatisierte Bilderkennungs- und TNT-Quantifizierungstechniken verwendet18,19. Es gibt jedoch mehrere Vorteile der derzeitigen manuellen 3D-Volumenanalysemethode gegenüber der automatischen Bildanalyse zur Detektion und Quantifizierung von TNTs. Oft können geschulte menschliche Augen diese schwebenden Nanostrukturen leichter erkennen als eine automatisierte Bilddetektionsmethode. Darüber hinaus könnten automatische Nachweismethoden in Laboratorien ohne Algorithmus-Know-how schwierig zu implementieren sein. Die vorliegende Methode könnte aufgrund ihrer Präzision und Reproduzierbarkeit von Forschern weitgehend übernommen werden.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass oAβ die Biogenese von TNTs in neuronalen Zellen über einen PAK1-vermittelten, Aktin-abhängigen Endozytose-Mechanismus fördert12. oAβ-induzierte TNTs exprimieren auch aktiviertes PAK1 (oder Phospho-PAK1). Wir entwickelten eine 3D-Volumenansichts-Bildrekonstruktionsmethode zur Unterscheidung von oAβ-induzierten, F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten TNTs. β-III-Tubulin-positive, sich entwickelnde Neuriten ähneln oft TNT-ähnlichen schwebenden Strukturen20. Daher unterschieden wir F-Actin-basierte TNTs weiter von β-III-Tubulin-positiven Neuriten und anderen TNT-ähnlichen Vorsprüngen. 3D-Volumenansichtsbilder wurden verwendet, um TNTs anhand ihrer Eigenschaften zu identifizieren, über dem Substrat zu schweben und zwischen zwei benachbarten Zellen verbunden zu bleiben. Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung und Detektion von Aktin-haltigen Membrankanälen oder TNTs unter Verwendung konfokaler Z-Stack-Bilder und schließlich die manuelle Quantifizierung der identifizierten Strukturen aus 3D-Volumenansichtsrekonstruktionsbildern. Das vorgestellte Verfahren kann keine offenen TNTs von geschlossenen TNT-ähnlichen Strukturen unterscheiden; Diese Methode hilft, TNTs in In-vitro-2D-Zellkultur auf einem flachen Substrat zu identifizieren. Die Methode ist jedoch einfach zu implementieren und zu reproduzieren und kann weit verbreitet sein, um nur Aktin-basierte TNTs genau zu quantifizieren und sie von Neuriten und β-Tubulin-positiven TNT-ähnlichen Strukturen zu unterscheiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass Zellen einen direkten, langreichweitigen interzellulären Transfer über Aktinmembrankanäle im Nanobereich durchführen, nämlich "tunnelnde Nanoröhren" (TNTs). TNTs sind definiert als offene, lipid-doppelschichtige Membranverlängerungen, die die Kontinuität zwischen benachbarten Zellen mit Durchmessern zwischen 50 nm und 1 μm vermitteln. TNTs wurden zunächst in neuronalen Zellen nachgewiesen, aber aufeinanderfolgende Studien haben die Existenz von TNTs in verschiedenen Zelltypen und Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, Virusinfektionen und Krebs gezeigt. Mehrere Studien haben sich auf geschlossene, elektrisch gekoppelte Membran-Nanostrukturen zwischen benachbarten Zellen als TNTs oder TNT-ähnliche Strukturen bezogen.
Die Aufklärung der Ultrastruktur in Bezug auf die Membrankontinuität am Endpunkt ist technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus sind Studien zur Zell-Zell-Kommunikation aufgrund des Fehlens spezifischer Marker eine Herausforderung hinsichtlich der Charakterisierung von TNTs mit herkömmlichen Methoden. TNTs werden in erster Linie als F-Aktin-basierte, offene Membranvorsprünge definiert. Eine wesentliche Einschränkung ist jedoch, dass F-Aktin in allen Arten von Vorsprüngen vorhanden ist, was es schwierig macht, TNTs von anderen Vorsprüngen zu unterscheiden. Eine der bemerkenswerten Eigenschaften von F-Aktin-basierten TNTs ist, dass diese Strukturen zwischen zwei Zellen schweben, ohne das Substrat zu berühren. Daher können unterschiedliche F-Aktin-gefärbte TNTs bequem von anderen Vorsprüngen wie Filopodien und Neuriten unterschieden werden, basierend auf ihrem Schweben zwischen den Zellen.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Internalisierung von oligomerem Amyloid-β1-42 (oAβ) über Aktin-abhängige Endozytose die aktivierte p21-aktivierte Kinase-1 (PAK1) stimuliert, die die Bildung von F-Aktin-haltigen TNTs vermittelt, die mit Phospho-PAK1 zwischen SH-SY5Y-neuronalen Zellen koexprimiert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Volumenanalysemethode zur Identifizierung und Charakterisierung von TNTs aus den aufgenommenen z-Stack-Bildern von F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten Membranvorsprüngen in oAβ-behandelten neuronalen Zellen. Darüber hinaus unterscheiden sich TNTs von der Entwicklung von Neuriten und neuronalen Auswüchsen auf Basis von F-Aktin- und β-III-Tubulin-immungefärbten Membranleitungen.

Hier identifizieren und charakterisieren wir oAβ-induzierte TNTs in SH-SY5Y-neuronalen Zellen, indem wir 3D-Volumenansichten aus konfokalen z-Stack-Bildern konstruieren (Abbildung 1). Die Zellen wurden mit F-Aktin und Phospho-PAK1 doppelt immungefärbt. Konfokale Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen wurden analysiert, um TNTs zu identifizieren (Abbildung 2). Darüber hinaus wurden DIC-Bilder analysiert, um zu verifizieren, dass die F-Aktin- und Phospho-PAK...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) sind in erster Linie offene F-Aktin-Membran-Nanoröhren, die benachbarte Zellen verbinden und die interzelluläre Kommunikation erleichtern. Das bemerkenswerte Merkmal, das TNTs von anderen Zellvorsprüngen unterscheidet, ist die schwebende Natur der Nanoröhrchen zwischen den Zellen. Hier charakterisieren wir TNTs, indem wir eine 3D-Volumenansicht von konfokalen Z-Stack-Bildern erstellen.

Detektion und Quantifizierung von tunnelnden Nanoröhren mittels 3D-Volumenansichtsbildern

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Der Mangel an tunnelnden Nanoröhren-spezifischen Markern schränkt den Fortschritt auf diesem Gebiet ein und es besteht eine zunehmende Nachfrage nach einer Methode zur Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung von Tunnelnanoröhren. Automatische Erkennungsmethoden sind ohne das Know-how, einen Algorithmus zu entwickeln und / oder den bestehenden Algorithmus zu ändern, schwierig zu implementieren, aber unsere manuelle Methode ist einfach und präziser zu implementieren. Der interzelluläre Langstreckentransfer über tunnelnde Nanoröhrchen wird auf verschiedene Arten in verschiedenen Krankheitsmodellen implementiert, darunter neurodegenerative Pathologie, virale Ausbreitung und Krebs.Daher sind Studien zum Tunneln von Nanoröhren wichtig, um ihre Rolle in der Pathogenese zu verstehen. Es ist möglich, dass die tunnelnden Nanoröhren während des Färbevorgangs brechen. Vermeiden Sie die Verwendung von Abdeckscheiben und die Montage auf den Objektträgern, sondern verwenden Sie stattdessen Glasbodenschalen.Ein modifiziertes Fixierungsprotokoll hilft, Nanoröhren intakt zu halten. Deepak KV, Doktorand aus dem Labor von Sangeeta NAF, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, waschen Sie die Kontroll- und oligomeren A-beta-behandelten Zellen zweimal mit PBS für zwei Minuten vor der Fixierung.Die Fixierlösung von Karnovsky wird unter Verwendung von 2% Formalinfixiermittel und 2,5% Glutaraldehyd, gelöst in 0,1 molaren Phosphatpuffer von pH 7,2, hergestellt. Dann fixieren Sie die Zellen in der Bildgebungsschale, indem Sie Karnovskys Fixierlösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Bereiten Sie den Inkubationspuffer vor, indem Sie 0,1 Gramm Saponin in fünf Milliliter FBS auflösen und durch Zugabe von 95 Milliliter PBS verdünnen.Dann waschen Sie die fixierten Zellen zweimal mit Inkubationspuffer für zwei Minuten. Nach der Fixierung den ersten Antikörper gegen Phospho-PAK1 zugeben, eine Verdünnung von eins auf 250 in den Inkubationspuffer geben und über Nacht bei vier Grad Celsius in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren. Am nächsten Tag nach 24 Stunden Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Inkubationspuffer für zwei Minuten.Fügen Sie dann sekundäre Antikörper hinzu, die an Alexa Fluor 488 und Phalloidin 555 konjugiert sind. Inkubieren Sie die Zellen in der dunklen, feuchten Kammer für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit Inkubationspuffer für zwei Minuten.Färben Sie den Kern, indem Sie DAPI in einer Verdünnung von eins bis 2000 hinzufügen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Bereiten Sie das DABCO-Montagemedium mit 25 Milligramm DABCO in 90 % Glycerin und 10 % PBS vor. Um sich richtig aufzulösen, stellen Sie den pH-Wert mit spektrophotometrischer verdünnter Salzsäure auf 8,6 ein und halten Sie die Lösung zum Mischen auf einer Wippe.Als Anti-Bleichmittel geben Sie das DABCO-Montagemedium direkt auf die Bildschale mit dem Abdeckglas an der Unterseite. Warten Sie mindestens ein bis zwei Stunden und fahren Sie direkt mit der konfokalen Bildgebung fort. Um tunnelnde Nanoröhren zu identifizieren, erfassen Sie Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, indem Sie zuerst die Kanäle auswählen und die erforderlichen Laser nacheinander in die Fenster Spur eins, Spur zwei und Spur drei in der konfokalen Software klicken.Klicken Sie auf die Option TPMT unter dem Track-One-Fenster, um die differentiellen Interferenzkontrastbilder mit Fluoreszenzkanälen aufzunehmen. Wählen Sie die Registerkarte Akquisition der Software, klicken Sie auf die Registerkarte Z-Stack und warten Sie, bis sich ein Fenster öffnet. Klicken Sie dann auf Live Scan, um die Zellen am unteren Rand der Schale zu fokussieren.Wählen Sie dieses fokussierte Bild als ersten Stapel aus, und fokussieren Sie sich dann, um den obersten Teil der Zelle zu sehen, und wählen Sie diesen als letzten Stapel aus. Stoppen Sie den Live-Scan und klicken Sie auf die Zahl neben der Registerkarte Optimal, um die Schrittweite der Stapel festzulegen, die die Anzahl der Slices und die Intervalle basierend auf der Dicke der Zellen bestimmt. Nehmen Sie sequenzielle Bilder von drei Kanälen von DAPI, FITC und TRITC mit 405-Nanometer-, 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Lasern auf und erfassen Sie sie mit einer Pixelverweilzeit von 1,02 Mikrosekunden.Nehmen Sie Bilder im DIC-Kanal mit Fluoreszenzkanälen auf, um die Zellgrenze zu beobachten. Öffnen Sie die im czi-Datenformat gespeicherten konfokalen Bilder in der Fidschi-Software zur Analyse. Wählen Sie die Option Hyperstack, um jeden Z-Stack und Kanal des Bildes anzuzeigen.Scrollen Sie durch den Kanal und die Z-Stack-Bildlaufleisten, um den genauen Stapel eines bestimmten Kanals von Interesse auszuwählen. Wählen Sie dann zuerst den F-Aktin-gefärbten Kanal aus, indem Sie die Kanalleiste scrollen und manuell die Z-Stapel scrollen, um jeden Stapel einzeln zu sehen. Identifizieren Sie die F-Aktin-gefärbten Strukturen, die Zellen zu verbinden scheinen, die in den unteren Teilen der Z-Stapel sichtbar sind und sich nahe der Oberfläche der Bildgebungsschale befinden, wobei Z gleich zwei als Neuriten ist.Identifizieren Sie die tunnelnden Nanoröhren, die F-Aktin-positiven schwebenden Zell-zu-Zell-Leitungen, indem Sie die Z-Stapel von Z gleich bis vier nach oben scrollen. Suchen Sie nach Neuriten in der Nähe der unteren Teile der Z-Stapel zur Oberfläche hin und beobachten Sie, dass sie mit dem Scrollen von Z-Stapeln nach oben bei Z gleich sechs zu verschwinden beginnen. Identifizieren Sie Phospho-PAK1-positive Tunnelnanoröhren ähnlich wie F-Aktin-positive Tunnelnanoröhren, indem Sie die schwebende Natur der Leitungen aus den Z-Stacks analysieren.Da die Phospho-PAK1-Färbung schwächer ist als die F-Aktin-Färbung, suchen Sie nach Phospho-PAK1-gefärbten Tunnelnanoröhren bei Z gleich vier und bei Z gleich sechs. Beobachten Sie außerdem die DIC-Bilder, um zu überprüfen, ob die F-Aktin- und Phospho-PAK1-gefärbten Tunnel-Nanoröhrenstrukturen Membrankanäle zwischen Zellen sind. Darüber hinaus verschmelzen F-Aktin- und Phospho-PAK1-Kanäle, um zu überprüfen, ob die identifizierten Tunnelnanoröhren F-Aktin- und Phospho-PAK1-co-gefärbte Strukturen sind.Um die tunnelnden Nanoröhren zu quantifizieren, zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die identifizierten Tunnelnanoröhren manuell und stellen Sie die Zahlen als Prozentsätze dar. Um F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-positive Tunnel-Nanoröhren wie schwebende Leitungen von Z-Stack-Bildern zu unterscheiden, verschmelzen Sie F-Aktin- und Beta-III-Tubulinkanäle und analysieren Sie dann die Z-Stapel der zusammengeführten Bilder. Suchen Sie nach ausschließlich F-Aktin-gefärbten Tunnel-Nanoröhren, die bei Z gleich drei schwach sichtbar und bei Z gleich sechs und Z gleich neun prominent sind.In ähnlicher Weise identifizieren Sie F-Aktin und Beta-III-Tubulin. doppelt positive tunnelnde Nanoröhren wie schwebende Leitungen bei Z gleich sechs und Z gleich neun. Identifizieren Sie andere F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-gefärbte, nicht schwebende Vorsprünge aus den unteren Teilen der Z-Stacks.Messen Sie den Durchmesser der Tunnel-Nanoröhren mit dem Line-Tool in Fidschi. Überprüfen Sie die Maßskala, indem Sie auf Analysieren klicken, und legen Sie dann den Maßstab so fest, dass der Abstand in Pixel automatisch aus den czi-Bildern festgelegt wird. Messen Sie die Durchmesser der tunnelnden Nanoröhren in der XY-Ebene.Mit dem Volume Viewer-Plugin in Fidschi, das 3D-Re-Slicing und Schwellenwert-fähige 3D-Visualisierung ermöglicht, teilen Sie die Z-Stack-Bilder in einzelne Kanäle auf. Schneiden Sie dann die Einkanal-Z-Stack-Bilder zu, um die 3D-Rekonstruktionsansicht zu verwenden, um ein oder zwei tunnelnde Nanoröhren oder Neuriten gleichzeitig hervorzuheben. Stecken Sie eine einzelne tunnelnde Nanoröhre oder ein Neurit in die XY-Ebene und markieren Sie XZ- und YZ-Zugangsquerschnitte.Beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der XZ-Ebene, in der XZ- und YZ-Ebene und die tunnelnden Nanoröhren in den oberen Z-Stacks. Wählen Sie die einzelnen tunnelnden Nanoröhren oder Neuriten aus, um die 3D-Volumenansicht in der XZ-Ebene zu rekonstruieren. In der 3D-Rekonstruktion beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der Z-Ebene und die tunnelnden Nanoröhren, die als schwebende Strukturen erscheinen, die zwei Zellen verbinden, ohne die untere Z-Ebene zu berühren.Konfokale Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen mit F-Aktin und Phospho-PAK1 wurden analysiert, um tunnelnde Nanoröhren zu identifizieren. Darüber hinaus wurden DIC-Bilder analysiert, um zu bestätigen, dass die F-Aktin- und Phospho-PAK1-gefärbten Tunnel-Nanoröhrenstrukturen Membrankanäle zwischen Zellen waren. Die Zellen wurden doppelt mit F-Aktin und Beta-III-Tubulin immungefärbt und die tunnelnden nanoröhrenartigen F-Aktin- und Beta-III-Tubulin-Doppelpositivmembranleitungen wurden nur von F-Aktin-positiven Tunnel-Nanoröhren unterschieden.Die tunnelnden Nanoröhren, die zusammen mit Phospho-PAK1 und F-Aktin exprimiert wurden, wurden von den Zellvorsprüngen anderer Neuriten unterschieden, indem sie 3D-Volumenansichtsbilder basierend auf ihrer Eigenschaft konstruierten, zwischen zwei Zellen zu schweben, ohne das Substrat zu berühren. Die Verwendung des richtigen Fixiermittels ist wichtig, da eine unvollkommene Fixierung der Probe zu einem schnellen proteolytischen Abbau der Zielproteine und einer Verringerung der spezifischen Immunreaktivität führen kann.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Forschung

Biologie

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac Druck-Volumen-Loop-Analyse mit Conductance-Katheter bei Mäusen

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volumen-Segmentierung und Analyse von biologischen Materialien mit SuRVoS (Super-Region Volumen Segmentierung)-Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...