Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V ו- A.R מודים לאקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל על מלגת TMA Pai. אנו מודים למועצת המחקר המדעית וההנדסית של הודו עבור SERB-SRG (#SRG/2021/001315), כמו גם למועצה ההודית למחקר רפואי של הודו (#5/4-5/אד-הוק/נוירו/216/2020-NCD-I) ולקרן התוך-מורלית של האקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל, מניפל, הודו. אנו מודים למתקן הקונפוקלי של JNCASR (מרכז ג'ווהרלל נהרו למחקר מדעי מתקדם, הודו) ול- B. Suma על המיקרוסקופיה הקונפוקלית ב- JNCASR.

הערה: תאי SH-SY5Y שגודלו בתרבית במדיית DMEM/F-12 התמינו בחומצה רטינואית של 10 μM במשך 7 ימים וטופלו באוליגומרים של 1 μM oAβ במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2). לאחר הטיפול, התאים תוקנו עם התמיסה המקובעת של קרנובסקי והוכתמו פעמיים בנוגדן פוספו-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלואידין קושר F-אקטין. מאוח?...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

מספר חוקרים בשני העשורים האחרונים ניסו להבין ולאפיין את המבנה של TNTs18. היעדר סמנים ספציפיים מעכב את ההתקדמות, ויש דרישה גוברת לשיטה נוחה וסטנדרטית שניתן להשתמש בה כדי לזהות, לאפיין ולכמת TNTs. TNTs מוגדרים כצינורות ממברנה מבוססי F-actin המרחפים בין שני תאים. מחקרים הראו כי נויריטים β-?...

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן צינורות ממברנה פתוחים מבוססי F-actin, וממלאים תפקיד חיוני בהעברה בין-תאית של מטען ואברונים1. המאפיין הייחודי של TNTs הוא שהם מחברים תאים שכנים ללא כל מגע עם הסובסטרטום; אורכם מעל 10-300 מיקרומטר וקוטרם נע בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר 2,3. TNTs הם מבנים חולפים, ואורך חייהם נמשך בין מספר דקות למספר שעות. TNTs הודגמו לראשונה בתאי עצב PC121; מאוחר יותר, מחקרים רבים הראו את קיומם במספר סוגי תאים במבחנה וב- in vivo 4,5. מספר מחקרים חשפו את המשמעות הפתולוגית של TNTs במודלים שונים של מחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, סרטן וזיהומים נגיפיים 6,7,8.
ההטרוגניות המבנית של TNTs הודגמה על ידי מספר מחקרים במערכות תאיות שונות9. ההבדלים מבוססים על הרכב השלד, מנגנון היווצרותו וסוגי המטעניםשהועברו 10. בראש ובראשונה, המשכיות הממברנה הפתוחה, החיובית ל-F-actin, המרחפת בין שני תאים שכנים ומעבירה אברונים, נחשבת למורכבת מ-TNTs11. עם זאת, חוסר הבהירות או המגוון שנצפה בהיווצרות TNTs מוסיף לקושי בפיתוח סמנים ספציפיים ל- TNT. לפיכך, קשה לזהות מבני TNT בשיטות גילוי קונבנציונליות ולהבחין בננו-צינוריות ממברנה במונחים של בליטות פתוחות וסגורות12. עם זאת, המאפיין של TNTs לרחף כמו בליטות ממברנת F-actin בין שני תאים הוא יחסית קל יותר וניתן יותר לזיהוי באמצעות טכניקות הדמיה קונבנציונליות. בליטות תאיות אחרות המבוססות על אקטין, כגון פילופודיה ופילופודיה גבית, אינן יכולות לרחף בין שני תאים מרוחקים, במיוחד כאשר התאים מקובעים. יש לציין כי נויריטים קרובים, מצומדים חשמלית ומתפתחים מכונים לעתים קרובות מבנים דמויי TNT13.
ידוע כי F-אקטין ממלא תפקיד חשוב בהיווצרות TNT, ומספר מחקרים הראו כי מעכב F-אקטין ציטוכלזין D מעכב את היווצרותם של TNTs14,15. לעומת זאת, למעכבי מיקרוטובולים אין כל השפעה על היווצרות TNT16. בשני העשורים האחרונים ראינו מספר דיווחים על התפקיד המשמעותי ש- TNTs ממלאים בהתפשטות הפתולוגיה והעמידות לגידולים וטיפול17. לכן, יש דרישה בלתי נגמרת לטכניקות טובות יותר לאפיון TNT.
היעדר סמנים ספציפיים של TNTs והגיוון במורפולוגיה ובהרכב הציטוסקטלי מקשים על פיתוח שיטת אפיון ייחודית. מחקרים מסוימים השתמשו בזיהוי תמונה אוטומטי ובטכניקות כימות TNT18,19. עם זאת, ישנם מספר יתרונות של שיטת הניתוח הידנית הנוכחית בנפח תלת-ממדי על פני ניתוח תמונה אוטומטי לזיהוי וכימות של TNTs. לעתים קרובות, עיניים אנושיות מאומנות יכולות לזהות את הננו-מבנים המרחפים האלה בקלות רבה יותר מאשר שיטת זיהוי תמונה אוטומטית. יתר על כן, שיטות זיהוי אוטומטיות עשויות להיות קשות ליישום במעבדות חסרות מומחיות באלגוריתם. השיטה הנוכחית יכולה להיות מאומצת באופן נרחב על ידי חוקרים בשל הדיוק והשכפול שלה.
במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי oAβ מקדם את הביוגנזה של TNTs בתאי עצב באמצעות מנגנון אנדוציטוזה בתיווך PAK1, תלוי אקטין,12. TNTs הנגרמים על-ידי oAβ מבטאים גם PAK1 מופעל (או phospho-PAK1). פיתחנו שיטת שחזור תמונה בתצוגת נפח תלת-ממדית כדי להבחין בין TNTs המושרים על-ידי oAβ, F-actin- ו-phospho-PAK1-immunostained. β-III טובולין חיובי, נוירויטים מתפתחים לעתים קרובות דומים למבנים מרחפים דמויי TNT20. לפיכך, הבחנו עוד יותר בין TNTs מבוססי F-actin לבין נויריטים חיוביים לטובולין β-III ובליטות דמויות TNT אחרות. תמונות תצוגת נפח תלת-ממדיות שימשו לזיהוי TNTs על בסיס המאפיינים שלהם של ריחוף מעל המצע ושמירה על קשר בין שני תאים שכנים. מאמר זה מתאר זיהוי וזיהוי של צינורות ממברנה המכילים אקטין או TNTs באמצעות תמונות z-stack קונפוקליות, ולבסוף, כימות ידני של המבנים שזוהו מתמונות שחזור של תצוגת נפח תלת-ממדית. השיטה המוצגת אינה יכולה להבחין בין TNTs פתוחים תקינים לבין מבנים דמויי TNT קרובים; שיטה זו מסייעת לזהות TNTs בתרבית תאים דו-ממדית במבחנה על מצע שטוח. עם זאת, השיטה קלה ליישום ולהתרבות וניתן להשתמש בה באופן נרחב לכימות מדויק של TNTs מבוססי אקטין בלבד ולהבדילם מנויריטים ומבנים דמויי TNT חיוביים β-טובולין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

תגליות אחרונות גילו כי תאים מבצעים העברה בין-תאית ישירה, ארוכת טווח, באמצעות צינורות אקטין-ממברנה בקנה מידה ננומטרי, כלומר "מנהור ננו-צינוריות" (TNTs). TNTs מוגדרים כהרחבות ממברנה דו-שכבתיות פתוחות ומקיפות שומנים, המתווכות המשכיות בין תאים שכנים בקטרים הנעים בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר. TNTs הודגמו בתחילה בתאי עצב, אך מחקרים עוקבים חשפו את קיומם של TNTs במספר סוגי תאים ומחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, זיהומים ויראליים וסרטן. מספר מחקרים התייחסו לננו-מבנים של ממברנות מצומדות חשמלית בין תאים שכנים כאל מבנים דמויי TNT או TNT.
ההבהרה של אולטרה-מבנה במונחים של המשכיות הממברנה בנקודת הקצה היא מאתגרת מבחינה טכנית. בנוסף, מחקרים על תקשורת בין תאים מאתגרים מבחינת אפיון TNTs בשיטות קונבנציונליות בשל היעדר סמנים ספציפיים. TNTs מוגדרים בעיקר כבליטות ממברנה פתוחות מבוססות F-actin. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת היא ש-F-אקטין קיים בכל סוגי הבליטות, מה שמקשה על הבחנה בין TNTs לבליטות אחרות. אחד המאפיינים הבולטים של TNTs מבוססי F-actin הוא שמבנים אלה מרחפים בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. לכן, ניתן להבחין בנוחות בין TNTs מוכתמים ב-F-actin לבין בליטות אחרות כגון פילופודיה ונויריטים בהתבסס על ריחופין בין תאים.
לאחרונה הראינו כי הפנמה של עמילואיד-β אוליגומרי 1-42 (oAβ) באמצעות אנדוציטוזה תלוית אקטין מעוררת קינאז-1 מופעל p21 (PAK1), אשר מתווך את היווצרותם של TNTs המכילים F-אקטין יחד עם phospho-PAK1 בין תאי עצבSH-SY5Y. פרוטוקול זה מתווה שיטת ניתוח נפח תלת-ממדית לזיהוי ואפיון TNTs מתמונות z-stack שנלכדו של בליטות ממברנה מוכתמות ב-F-actin ו-phospho-PAK1-immunostained בתאי עצב שטופלו ב-oAβ. יתר על כן, TNTs נבדלים מפיתוח נויריטים וצמיחה עצבית המבוססת על צינורות ממברנה עם F-אקטין ו-β-III טובולין-אימונוסטי.

כאן, אנו מזהים ומאפיינים TNTs המושרים על-ידי oAβ בתאי עצב SH-SY5Y על-ידי בניית תצוגות נפח תלת-ממדיות מתמונות z-stack קונפוקליות (איור 1). התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטין ופוספו-PAK1. תמונות z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון נותחו כדי לזהות TNTs (איור 2). יתר על כן, תמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן בעיקר ננו-צינוריות ממברנת F-actin פתוחות המחברות בין תאים שכנים, ומקלות על תקשורת בין-תאית. המאפיין הבולט המבדיל בין TNTs לבין בליטות תאים אחרות הוא האופי המרחף של הננו-צינוריות בין התאים. כאן, אנו מאפיינים TNTs על ידי בניית תצוגת נפח תלת-ממדית של תמונות z-stack קונפוקליות.

איתור וכימות של ננו-צינוריות מנהור באמצעות תמונות תצוגת נפח תלת-ממדית

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

המחסור בסמנים ספציפיים של ננו-צינוריות מנהור מגביל את ההתקדמות בתחום ויש דרישה גוברת לשיטה לזיהוי, אפיון וכימות של ננו-צינוריות מנהור. שיטות זיהוי אוטומטיות קשות ליישום ללא המומחיות לפתח אלגוריתם ו/או לשנות את האלגוריתם הקיים, אך השיטה הידנית שלנו קלה ליישום בדיוק רב יותר. העברה בין-תאית ארוכת טווח באמצעות ננו-צינוריות מנהור מיושמת במספר דרכים במודלים שונים של מחלות, כולל פתולוגיה נוירודגנרטיבית, התפשטות נגיפית וסרטן.לכן, מחקרים על מנהור ננו-צינוריות כדי להבין את תפקידם בפתוגנזה הם חשובים. ייתכן שננו-צינוריות המנהור עלולות להישבר במהלך תהליך הצביעה. הימנע משימוש בכיסויי כיסוי ובהרכבה על השקופיות, והשתמש במקום זאת בכלי הדמיה עם תחתית זכוכית.פרוטוקול קיבוע שונה מסייע לשמור על ננו-צינוריות מנהור שלמות. מי שידגים את ההליך יהיה דיפאק KV, דוקטורנט מהמעבדה של סנג'יטה NAF. כדי להתחיל, יש לשטוף את תאי הבקרה וה-A-beta האוליגומריים פעמיים עם PBS במשך שתי דקות לפני הקיבוע.הכן את הפתרון המקבע של קרנובסקי באמצעות 2% פורמלין מקובע ו-2.5% גלוטרלדהיד מומס בחיץ פוספט טוחן 0.1 של pH 7.2. לאחר מכן תקן את התאים בצלחת ההדמיה על ידי הוספת הפתרון המקבע של קרנובסקי למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הכן את מאגר הדגירה על ידי המסת 0.1 גרם של saponin בחמישה מיליליטר של FBS ומדולל על ידי הוספת 95 מיליליטר של PBS.לאחר מכן לשטוף את התאים הקבועים פעמיים באמצעות מאגר הדגירה במשך שתי דקות. לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן הראשון נגד phospho-PAK1, מוסיפים דילול של אחד עד 250 במאגר הדגירה ודוגרים לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. למחרת לאחר 24 שעות של דגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ הדגירה במשך שתי דקות.לאחר מכן הוסיפו נוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 ופלוידין 555. לדגור על התאים בתא החשוך והלח למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר הדגירה במשך שתי דקות.הכתימו את הגרעין על ידי הוספת DAPI בדילול של אחד עד 2000 ודגירה במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הכן מדיום הרכבה של DABCO באמצעות 25 מיליגרם של DABCO ב-90% גליצרול ו-10% PBS. כדי להתמוסס כראוי, התאם את ה- pH ל- 8.6 באמצעות חומצה הידרוכלורית מדוללת בדרגה ספקטרופוטומטרית ושמור את התמיסה על נדנדה לערבוב.כחומר נגד הלבנה, הוסיפו את מדיום ההרכבה של DABCO ישירות על צלחת ההדמיה המכילה את החלקת הכיסוי בתחתית. המתן לפחות שעה עד שעתיים והמשך ישירות לביצוע הדמיה קונפוקלית. כדי לזהות ננו-צינוריות מנהור, צלם תמונות Z-stack של תאים מדוכאי חיסון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר על ידי בחירה ראשונה של התעלות ולחיצה על הלייזרים הנדרשים ברצף בחלונות עקוב אחר אחד, עקוב אחר שתיים ועקוב אחר שלוש בתוכנת הקונפוקל.לחץ על האפשרות TPMT מתחת לחלון רצועה אחד כדי לצלם את תמונות הניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות עם ערוצי פלואורסצנציה. בחר בכרטיסייה רכישה של התוכנה, לחץ על הכרטיסייה Z-stack והמתן לפתיחת חלון. לאחר מכן לחצו על 'סריקה חיה' כדי למקד את התאים בתחתית המנה.בחר תמונה ממוקדת זו כאוסף הראשון, ולאחר מכן התמקד למעלה כדי לראות את החלק העליון ביותר של התא, ובחר בה כאוסף האחרון. הפסק את הסריקה החיה ולחץ על המספר שליד הכרטיסיה אופטימלי כדי לתקן את גודל הצעד של הערימות שקובע את מספר הפרוסות ואת המרווחים בהתבסס על עובי התאים. צלם תמונות עוקבות של שלושה ערוצים של DAPI, FITC ו- TRITC עם לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, ולכוד עם זמן השהייה בפיקסלים של 1.02 מיקרו-שניות.צלם תמונות בערוץ DIC עם ערוצים פלואורסצנטיים כדי לבחון את גבול התא. פתח את התמונות הקונפוקליות שנשמרו בפורמט נתונים czi בתוכנת פיג'י לניתוח. בחרו באפשרות Hyperstack כדי לראות כל ערימת Z וערוץ של התמונה.גלול בפסי הגלילה של הערוץ ושל Z-stack כדי לבחור את הערימה המדויקת של ערוץ מסוים שמעניין אותך. לאחר מכן בחר תחילה את הערוץ המוכתם F-actin על-ידי גלילת סרגל הערוצים וגלילה ידנית של ערימות Z כדי לראות כל ערימה בזו אחר זו. זהה את המבנים המוכתמים ב-F-actin שנראים כמחברים תאים הנראים בחלקים התחתונים של ערימות ה-Z וקרובים לפני השטח של צלחת ההדמיה כאשר Z שווה לשניים כ-neurites.זהה את הננו-צינוריות של המנהור, התא המרחף החיובי של F-actin לתעלות התא על ידי גלילת ערימות Z לכיוון החלק העליון מ-Z שווה לארבע. חפשו נוריטים ליד החלקים התחתונים של ערימות Z לכיוון פני השטח ושימו לב שהם מתחילים להיעלם עם גלילה של ערימות Z לכיוון החלק העליון ב-Z השווה לשש. זהה ננו-צינוריות מנהור חיוביות של phospho-PAK1 בדומה לננו-צינוריות מנהור חיוביות של F-actin על-ידי ניתוח האופי המרחף של הצינורות מערימות Z.מכיוון שצביעת phospho-PAK1 חלשה יותר מכתמת F-actin, חפשו ננו-צינוריות מנהור מוכתמות ב-Z השווה לארבע וב-Z שווה לשישה. יתר על כן, התבונן בתמונות DIC כדי לוודא שמבני הננו-צינוריות המוכתמים F-actin ו- phospho-PAK1 הם צינורות ממברנה בין התאים. בנוסף, מזגו תעלות F-אקטין ו-phospho-PAK1 כדי לוודא שננו-צינוריות המנהור שזוהו הן מבנים מוכתמים במשותף של F-actin ו-phospho-PAK1.כדי לכמת את הננו-צינוריות של המנהור, ספרו את סך כל מספרי התאים ואת הננו-צינוריות המזוהות של המנהור באופן ידני וייצגו את המספרים כאחוזים. כדי להבחין בין ננו-צינוריות מנהור חיוביות של F-actin ו-beta III tubulin, כגון צינורות מרחפים מתמונות Z-stack, מזגו את ערוצי הטובולין F-actin ו-beta III, ולאחר מכן נתחו את ערימות ה-Z של התמונות הממוזגות. חפשו אך ורק ננו-צינוריות מנהור מוכתמות ב-F-actin שנראות קלושות ב-Z שווה לשלוש ובולטות ב-Z שוות לשש ו-Z שווה לתשע.באופן דומה, זהה F-אקטין ובטא III טובולין. ננו-צינוריות מנהור חיוביות כפולות כמו צינורות מרחפים ב-Z שווים לשש ו-Z שווה לתשע. זהה בליטות אחרות של F-actin ובטא III טובולין מוכתמות שאינן מרחפות מהחלקים התחתונים של ערימות Z.מדוד את הקוטר של ננו-צינוריות המנהור באמצעות הכלי קו בפיג'י. אמת את קנה המידה על-ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן הגדר קנה מידה כך שהמרחק בפיקסלים ייקבע אוטומטית מתמונות czi. מדוד את הקטרים של ננו-צינוריות המנהור במישור XY.באמצעות תוסף Volume Viewer בפיג'י המאפשר חיתוך מחדש בתלת-ממד והדמיה תלת-ממדית התומכת בסף, פצל את תמונות Z-stack לערוצים בודדים. לאחר מכן חתוך את תמונות Z-stack של ערוץ יחיד כדי להשתמש בתצוגת שחזור תלת-ממדית כדי להדגיש ננו-צינוריות או נוריטים של מנהור אחד או שניים בכל פעם. הצמד ננו-צינוריות מנהור בודדות או נויריט במישור XY וסמן חתכי גישה XZ ו- YZ.שימו לב לנויריטים בתחתית מישור XZ, במישורי XZ ו-YZ, ולננו-צינוריות המנהור בערימות Z העליונות. בחר את ננו-צינוריות המנהור הבודדות או את הנויריט כדי לשחזר את תצוגת הנפח התלת-ממדית במישור XZ. בשחזור התלת-ממדי, התבוננו בנויריטים בתחתית מישור ה-Z ובננו-צינוריות המנהור המופיעות כמבנים מרחפים המחברים בין שני תאים מבלי לגעת במישור ה-Z התחתון.תמונות Z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון עם F-אקטין ופוספו-PAK1 נותחו כדי לזהות ננו-צינוריות מנהור. יתר על כן, תמונות DIC נותחו כדי לוודא שמבני הננו-צינוריות המוכתמות F-actin ו-phospho-PAK1 היו צינורות ממברנה בין תאים. התאים היו מדוכאי חיסון עם F-אקטין ובטא III טובולין, ותעלות הממברנה דמויי הננו-צינורית F-אקטין ובטא III טובולין דמויי ננו-צינוריות המנהור נבדלו מננו-צינוריות מנהור חיוביות בלבד של F-actin.ננו-צינוריות המנהור המבוטאות יחד עם phospho-PAK1 ו-F-actin נבדלו מבליטות תאים של נוריטים אחרים על ידי בניית תמונות תצוגת נפח תלת-ממדיות בהתבסס על המאפיין שלהן של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. שימוש בחומר מקבע נכון חשוב מכיוון שקיבוע לא מושלם של הדגימה עלול להוביל לפירוק פרוטאוליטי מהיר של חלבוני המטרה ולהפחתה בפעילות החיסונית הספציפית.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

לחץ-נפח לב ניתוח לולאה באמצעות מוליכות קטטרים בעכברים

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

נפח פילוח וניתוח של חומרים ביולוגיים באמצעות SuRVoS (סופר-אזור אחסון פילוח) עבודה, שעליו מונחים

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...