Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
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डीकेवी और एआर टीएमए पाई फैलोशिप के लिए मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन को धन्यवाद देते हैं। हम एसईआरबी-एसआरजी (#SRG/2021/001315) के लिए भारतीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड के साथ-साथ भारतीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (#5/4-5/तदर्थ/न्यूरो/216/2020-एनसीडी-1) और मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन, मणिपाल, भारत के इंट्राम्यूरल फंड को धन्यवाद देते हैं। हम जेएनसीएएसआर (जवाहरलाल नेहरू सेंटर फॉर एडवांस्ड साइंटिफिक रिसर्च, इंडिया) की कॉन्फोकल फैसिलिटी और बी. सुमा को जेएनसीएएसआर में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए धन्यवाद देते हैं।

एफ -12 मीडिया में संवर्धित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए 10 μM रेटिनोइक एसिड के साथ विभेदित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस (5% CO2) पर 2 घंटे के लिए 1 μM oAooomers के साथ इलाज कियागया था। उपचार के बाद, कोशि?...

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	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

पिछले 2 दशकों में कई शोधकर्ता टीएनटी18 की संरचना को समझने और चिह्नित करने की कोशिश कर रहे हैं। विशिष्ट मार्करों की कमी प्रगति में बाधा डालती है, और एक सुविधाजनक, मानकीकृत विधि की बढ़ती मांग है जि?...

टनलिंग नैनोट्यूब (टीएनटी) एफ-एक्टिन-आधारित हैं, मुख्य रूप से ओपन-एंडेड झिल्ली नाली और कार्गो और ऑर्गेनेल के अंतरकोशिकीय हस्तांतरण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। टीएनटी की अनूठी विशेषता यह है कि वे सबस्ट्रेटम के साथ किसी भी संपर्क के बिना पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ते हैं; वे लंबाई में 10-300 μm से अधिक हैं और उनके व्यास 50 nm से 1 μm 2,3 के बीच भिन्न होते हैं। टीएनटी क्षणिक संरचनाएं हैं, और उनका जीवनकाल कुछ मिनटों से कई घंटों के बीच रहता है। टीएनटी को पहली बार पीसी 12 न्यूरोनल कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया था; बाद में, कई अध्ययनों ने विट्रो और विवो 4,5 में कई सेल प्रकारों में अपना अस्तित्व दिखाया। कई अध्ययनों ने विभिन्न रोग मॉडलों में टीएनटी के पैथोलॉजिकल महत्व का खुलासा किया है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, कैंसर और वायरल संक्रमण 6,7,8।
विभिन्न सेलुलर प्रणालियों में कई अध्ययनों द्वारा टीएनटी की संरचनात्मक विषमताओं का प्रदर्शन किया गयाहै। अंतर साइटोस्केलेटन संरचना, गठन के तंत्र और स्थानांतरित कार्गोप्रकारों पर आधारित हैं। मुख्य रूप से, ओपन-एंडेड, एफ-एक्टिन-पॉजिटिव झिल्ली निरंतरता जो दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मंडराती है और ऑर्गेनेल को स्थानांतरित करती है, उसे टीएनटी11 से मिलकर माना जाता है। हालांकि, टीएनटी के गठन में देखी गई स्पष्टता या विविधता की कमी टीएनटी-विशिष्ट मार्करों को विकसित करने में कठिनाई को बढ़ाती है। इस प्रकार, पारंपरिक पहचान विधियों द्वारा टीएनटी संरचनाओं की पहचान करना और ओपन-एंडेड और क्लोज-एंडेड प्रोट्रूशियंस12 के संदर्भ में झिल्ली नैनोट्यूब को अलग करना मुश्किल है। हालांकि, दो कोशिकाओं के बीच एफ-एक्टिन झिल्ली प्रोट्रूशियंस के रूप में मंडराने के लिए टीएनटी की विशेषता पारंपरिक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके पहचानना अपेक्षाकृत आसान और अधिक संभव है। अन्य एक्टिन-आधारित सेलुलर प्रोट्रूशियंस जैसे फिलोपोडिया और पृष्ठीय फिलोपोडिया दो दूर की कोशिकाओं के बीच नहीं मंडरा सकते हैं, खासकर जब कोशिकाएं तय होती हैं। ध्यान दें, क्लोज-एंडेड, विद्युत रूप से युग्मित, विकासशील न्यूरॉइट्स को अक्सर टीएनटी जैसी संरचनाएंकहा जाता है।
यह ज्ञात है कि एफ-एक्टिन टीएनटी गठन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और कई अध्ययनों से पता चला है कि एफ-एक्टिन अवरोधक साइटोचलासिन डी टीएनटी14,15 के गठन को रोकता है। इसके विपरीत, सूक्ष्मनलिकाएं के अवरोधकों का टीएनटी गठन16 पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। पिछले 2 दशकों में पैथोलॉजी और ट्यूमर प्रतिरोध और चिकित्सा के प्रसार में टीएनटी की महत्वपूर्ण भूमिका पर कई रिपोर्टें देखीगई हैं। इसलिए, टीएनटी लक्षण वर्णन के लिए बेहतर तकनीकों की कभी न खत्म होने वाली मांग है।
टीएनटी के विशिष्ट मार्करों की कमी और आकृति विज्ञान और साइटोस्केलेटल संरचना में विविधता लक्षण वर्णन की एक अनूठी विधि विकसित करना मुश्किल बनाती है। कुछ अध्ययनों ने स्वचालित छवि का पता लगाने और टीएनटी परिमाणीकरण तकनीक18,19 का उपयोग किया है। हालांकि, टीएनटी का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए स्वचालित छवि विश्लेषण पर वर्तमान 3 डी वॉल्यूम मैनुअल विश्लेषण विधि के कई फायदे हैं। अक्सर, प्रशिक्षित मानव आंखें स्वचालित छवि पहचान विधि की तुलना में इन मंडराते नैनो-संरचनाओं को अधिक आसानी से देख सकती हैं। इसके अलावा, एल्गोरिदम विशेषज्ञता की कमी वाली प्रयोगशालाओं में स्वचालित पहचान विधियों को लागू करना मुश्किल हो सकता है। वर्तमान विधि को इसकी सटीकता और प्रजनन क्षमता के कारण शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक रूप से अपनाया जा सकता है।
हाल के एक अध्ययन में, हमने दिखाया कि ओएएए पीएके 1-मध्यस्थता, एक्टिन-निर्भर, एंडोसाइटोसिस तंत्र12 के माध्यम से न्यूरोनल कोशिकाओं में टीएनटी के जैवजनन को बढ़ावा देता है। oA-प्रेरित TNT भी सक्रिय PAK1 (या फॉस्फो-PAK1) को व्यक्त करते हैं। हमने ओए-प्रेरित, एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-इम्यूनोस्टेन्ड टीएनटी को अलग करने के लिए एक 3 डी वॉल्यूम व्यू इमेज पुनर्निर्माण विधि विकसित की है। β-III ट्यूबुलिन-पॉजिटिव, विकासशील न्यूरॉइट्स अक्सर टीएनटी जैसी होवरिंग संरचनाओंसे मिलते जुलते हैं। इसलिए, हमने एफ-एक्टिन-आधारित टीएनटी को β-III ट्यूबुलिन-पॉजिटिव न्यूरॉइट्स और अन्य टीएनटी-जैसे प्रोट्रूशियंस से अलग किया। 3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का उपयोग टीएनटी की पहचान करने के लिए किया गया है, जो सबस्ट्रेटम पर मंडराने और दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच जुड़े रहने की उनकी विशेषताओं के आधार पर है। यह पेपर कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का उपयोग करके एक्टिन युक्त झिल्ली नाली या टीएनटी की पहचान और पता लगाने का वर्णन करता है और अंत में, 3 डी वॉल्यूम व्यू पुनर्निर्माण छवियों से पहचानी गई संरचनाओं की मैन्युअल मात्रा का ठहराव करता है। प्रस्तुत विधि क्लोज-एंडेड टीएनटी जैसी संरचनाओं से ओपन-एंडेड उचित टीएनटी को अलग नहीं कर सकती है; यह विधि एक फ्लैट सबस्ट्रेटम पर इन विट्रो 2 डी सेल कल्चर में टीएनटी की पहचान करने में मदद करती है। हालांकि, विधि को लागू करना और पुन: उत्पन्न करना आसान है और इसका व्यापक रूप से उपयोग केवल एक्टिन-आधारित टीएनटी की सटीक मात्रा के लिए किया जा सकता है और उन्हें न्यूरॉइट्स और β-ट्यूबुलिन पॉजिटिव टीएनटी जैसी संरचनाओं से अलग करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

हाल की खोजों से पता चला है कि कोशिकाएं नैनो-स्केल, एक्टिन-झिल्ली नाली, अर्थात् "टनलिंग नैनोट्यूब" (टीएनटी) के माध्यम से प्रत्यक्ष, लंबी दूरी, अंतरकोशिकीय हस्तांतरण करती हैं। टीएनटी को ओपन-एंडेड, लिपिड बाइलेयर-घेरे हुए झिल्ली विस्तार के रूप में परिभाषित किया गया है जो 50 एनएम और 1 μm के व्यास की पड़ोसी कोशिकाओं के बीच निरंतरता का मध्यस्थता करते हैं। TNTs को शुरू में न्यूरोनल कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया था, लेकिन लगातार अध्ययनों ने कई सेल प्रकारों और बीमारियों, जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों, वायरल संक्रमण और कैंसर में टीएनटी के अस्तित्व का खुलासा किया है। कई अध्ययनों ने पड़ोसी कोशिकाओं के बीच क्लोज-एंडेड, विद्युत युग्मित झिल्ली नैनोस्ट्रक्चर को टीएनटी या टीएनटी जैसी संरचनाओं के रूप में संदर्भित किया है।
समापन बिंदु पर झिल्ली निरंतरता के संदर्भ में अल्ट्रास्ट्रक्चर का स्पष्टीकरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, विशिष्ट मार्करों की कमी के कारण पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके टीएनटी के लक्षण वर्णन के संदर्भ में सेल-सेल संचार पर अध्ययन चुनौतीपूर्ण हैं। टीएनटी को मुख्य रूप से एफ-एक्टिन-आधारित, ओपन-एंडेड मेम्ब्रेन प्रोट्रूशियंस के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, एक बड़ी सीमा यह है कि एफ-एक्टिन सभी प्रकार के प्रोट्रूशियंस में मौजूद है, जिससे टीएनटी को अन्य प्रोट्रूशियंस से अलग करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। एफ-एक्टिन-आधारित टीएनटी की उल्लेखनीय विशेषताओं में से एक यह है कि ये संरचनाएं सबस्ट्रेटम को छूने के बिना दो कोशिकाओं के बीच मंडराती हैं। इसलिए, अलग-अलग एफ-एक्टिन-दाग वाले टीएनटी को आसानी से कोशिकाओं के बीच उनके मंडराने के आधार पर फिलोपोडिया और न्यूरॉइट्स जैसे अन्य प्रोट्रूशियंस से अलग किया जा सकता है।
हमने हाल ही में दिखाया है कि एक्टिन-निर्भर एंडोसाइटोसिस के माध्यम से ऑलिगोमेरिकएमिलॉयड-β 1-42 (ओए) का आंतरिककरण सक्रिय पी 21-सक्रिय किनेज -1 (पीएके 1) को उत्तेजित करता है, जो एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं के बीच फॉस्फो-पीएके 1 के साथ सह-व्यक्त एफ-एक्टिन युक्त टीएनटी के गठन की मध्यस्थता करता है। यह प्रोटोकॉल ओए-उपचारित न्यूरोनल कोशिकाओं में एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-इम्यूनोस्टेन्ड झिल्ली प्रोट्रूशियंस की कैप्चर की गई जेड-स्टैक छवियों से टीएनटी की पहचान और विशेषता के लिए एक 3 डी वॉल्यूम विश्लेषण विधि की रूपरेखा तैयार करता है। इसके अलावा, टीएनटी को एफ-एक्टिन- और β-III ट्यूबुलिन-इम्यूनोस्टेन्ड झिल्ली नाली के आधार पर न्यूरॉइट्स और न्यूरोनल आउटग्रोथ विकसित करने से अलग किया जाता है।

यहां, हम कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों (चित्रा 1) से 3 डी वॉल्यूम दृश्यों का निर्माण करके एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं में ओए-प्रेरित टीएनटी की पहचान और विशेषता करते हैं। कोशिकाओं को एफ-एक्ट?...

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Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

टनलिंग नैनोट्यूब (टीएनटी) मुख्य रूप से ओपन-एंडेड एफ-एक्टिन झिल्ली नैनोट्यूब हैं जो पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ते हैं, अंतरकोशिकीय संचार की सुविधा प्रदान करते हैं। उल्लेखनीय विशेषता जो टीएनटी को अन्य सेल प्रोट्रूशियंस से अलग करती है, कोशिकाओं के बीच नैनोट्यूब की मंडराती प्रकृति है। यहां, हम कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों के 3 डी वॉल्यूम दृश्य का निर्माण करके टीएनटी को चिह्नित करते हैं।

3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का उपयोग करके टनलिंग नैनोट्यूब का पता लगाना और परिमाणीकरण

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

लघु मात्रा जैव कल्पना नैनो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारण

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

तेजी से विश्लेषण और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों का अन्वेषण

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर प्रोटोकॉल

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

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