Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
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D.K.VとA.Rは、TMAパイフェローシップを提供してくれたマニパル高等教育アカデミーに感謝します。SERB-SRG(#SRG/2021/001315)、インド医学研究評議会(#5 / 4-5 / Ad-hoc/Neuro / 216/2020-NCD-I)、およびインドのマニパルにあるマニパル高等教育アカデミーの壁内基金に感謝します。JNCASR(インドのジャワハルラールネルー高等科学研究センター)の共焦点施設と、JNCASRの共焦点顕微鏡法を提供してくれたB.スマに感謝します。

注:DMEM/F-12培地で培養したSH-SY5Y細胞を10 μMレチノイン酸で7日間分化させ、1 μMのoAβオリゴマーで37°C(5%CO2)で2時間処理しました。処理後、細胞をカルノフスキー固定液で固定し、ホスホ-PAK1(Thr423)/PAK2(Thr402)抗体とF-アクチン結合ファロイジンで二重免疫染色しました。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて共焦点zスタック画像を撮影した。TNTは手作業でカウントし、3Dボリュー...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

過去20年間の何人かの研究者は、TNTの構造を理解し、特徴付けようとしてきました18。特定のマーカーの欠如は進歩を妨げ、TNTの識別、特性評価、および定量に使用できる便利で標準化された方法に対する需要が高まっています。 TNTは、2つの細胞間をホバリングするFアクチンベースの膜導管として定義されます。研究によると、βチューブリン陽性のクローズエンドの発達?...

トンネリングナノチューブ(TNT)は、Fアクチンベースの、主にオープンエンド膜導管であり、貨物および細胞小器官の細胞間移動において重要な役割を果たします1。TNTのユニークな特徴は、基層と接触することなく隣接する細胞を接続することです。それらは長さが10〜300μmを超え、直径は50nm〜1μmの間で変化します2,3。TNTは一時的な構造であり、その寿命は数分から数時間続きます。TNTは、PC12ニューロン細胞で最初に実証されました1。その後、多くの研究が、インビトロおよびインビボ4,5のいくつかの細胞型でそれらの存在を示しました。いくつかの研究は、神経変性疾患、癌、およびウイルス感染などの様々な疾患モデルにおけるTNTの病理学的意義を明らかにしている6,7,8。
TNTの構造的不均一性は、さまざまな細胞系におけるいくつかの研究によって実証されています9。違いは、細胞骨格の組成、形成のメカニズム、および転送される貨物の種類に基づいています10。主に、2つの隣接する細胞間をホバリングし、細胞小器官を移すオープンエンドのFアクチン陽性膜連続性は、TNTs11からなると考えられる。しかし、TNTの形成に見られる明瞭さや多様性の欠如は、TNT特異的マーカーの開発を困難にしています。したがって、従来の検出方法でTNT構造を同定し、膜ナノチューブを開放端突起と閉端突起12で区別することは困難である。しかし、2つの細胞間のF-アクチン膜突起としてホバリングするTNTの特性は、従来のイメージング技術を使用して識別するのが比較的簡単で実行可能です。糸状足や背側糸状突起などの他のアクチンベースの細胞突起は、特に細胞が固定されている場合、2つの離れた細胞の間をホバリングすることはできません。注目すべきことに、近接し、電気的に結合し、発達中の神経突起は、しばしばTNT様構造と呼ばれる13。
F-アクチンがTNT形成に重要な役割を果たすことが知られており、いくつかの研究は、F-アクチン阻害剤サイトカラシンDがTNTの形成を阻害することを示した14,15。対照的に、微小管の阻害剤はTNT形成に何の影響も及ぼさない16。過去20年間で、病理学と腫瘍抵抗性および治療の広がりにおいてTNTが果たす重要な役割に関するいくつかの報告が見られました17。したがって、TNTの特性評価のためのより良い技術に対する終わりのない要求があります。
TNTの特異的マーカーの欠如、形態および細胞骨格組成の多様性は、独自の特性評価方法を開発することを困難にしている。いくつかの研究では、自動画像検出およびTNT定量化技術が使用されています18,19。しかしながら、TNTの検出および定量化のための自動画像解析よりも、現在の3D体積手動解析法にはいくつかの利点がある。 多くの場合、訓練された人間の目は、自動画像検出方法よりも簡単にこれらのホバリングナノ構造を見つけることができます。さらに、自動検出方法は、アルゴリズムの専門知識がないラボでは実装が難しい場合があります。本手法は、その精度と再現性から研究者に広く採用されている。
最近の研究では、oAβがPAK1を介したアクチン依存性のエンドサイトーシスメカニズム を介して 神経細胞におけるTNTの生合成を促進することを示しました12。oAβ誘導性TNTは、活性化されたPAK1(またはホスホPAK1)も発現します。我々は、oAβ誘導性、F-アクチンおよびホスホ-PAK1免疫染色TNTを区別するための3Dボリュームビュー画像再構成法を開発しました。 β-IIIチューブリン陽性の発達中の神経突起は、しばしばTNT様ホバリング構造に似ています20。したがって、F-アクチンベースのTNTをβ-IIIチューブリン陽性神経突起および他のTNT様突起とさらに区別しました。3Dボリュームビュー画像は、基層上にホバリングし、2つの隣接するセル間の接続を維持するという特性に基づいてTNTを識別するために使用されてきました。この論文では、共焦点zスタック画像を使用したアクチン含有膜導管またはTNTの識別と検出、および最後に、3Dボリュームビュー再構成画像から識別された構造の手動定量について説明します。提示された方法は、オープンエンドの適切なTNTとクローズエンドのTNT様構造を区別することはできません。この方法は、平坦な基層上の in vitro 2D細胞培養でTNTを同定するのに役立ちます。しかし、この方法は実施と再現が容易であり、アクチンベースのTNTのみを正確に定量し、神経突起やβチューブリン陽性TNT様構造と区別するために広く使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

最近の発見により、細胞はナノスケールのアクチン膜導管、すなわち「トンネリングナノチューブ」(TNT) を介して 直接、長距離、細胞間移動を行うことが明らかになりました。TNTは、直径50 nmから1 μmの範囲の隣接細胞間の連続性を媒介する、オープンエンドの脂質二重層で囲まれた膜伸長として定義されます。 TNTは当初神経細胞で実証されましたが、連続した研究により、神経変性疾患、ウイルス感染、癌など、いくつかの細胞型および疾患におけるTNTの存在が明らかになりました。いくつかの研究では、隣接する細胞間のクローズエンドの電気的に結合された膜ナノ構造をTNTまたはTNT様構造と呼んでいます。
エンドポイントでの膜連続性の観点からの微細構造の解明は技術的に困難です。さらに、細胞間コミュニケーションに関する研究は、特異的マーカーがないため、従来の方法を使用したTNTの特性評価の観点から困難です。TNTは、主にFアクチンベースのオープンエンド膜突起として定義されます。ただし、大きな制限の1つは、F-アクチンがすべてのタイプの突起に存在するため、TNTを他の突起と区別することが難しいことです。F-アクチンベースのTNTの注目すべき特徴の1つは、これらの構造が基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングすることです。したがって、明確なFアクチン染色TNTは、細胞間のホバリングに基づいて、糸状足や神経突起などの他の突起と便利に区別できます。
我々は最近、アクチン依存性エンドサイトーシスを介したオリゴマーアミロイドβ1-42(oAβ)の内在化が、SH-SY5Y神経細胞間でホスホPAK1と共発現するF-アクチン含有TNTの形成を媒介する活性化p21活性化キナーゼ-1(PAK1)を刺激することを示した。このプロトコルは、oAβ処理された神経細胞におけるF-アクチンおよびホスホ-PAK1免疫染色膜突起のキャプチャされたzスタック画像からTNTを同定および特性評価するための3D体積分析方法の概要を示しています。さらに、TNTは、F-アクチンおよびβ-IIIチューブリン免疫染色膜導管に基づく神経突起およびニューロン増殖の発生とは区別されます。

ここでは、共焦点Zスタック画像から3Dボリュームビューを構築することにより、SH-SY5Yニューロン細胞におけるoAβ誘導TNTを同定し、特性評価します(図1)。細胞をF-アクチンおよびホスホ-PAK1で二重免疫染色した。免疫染色細胞の共焦点zスタック画像を解析してTNTを同定しました(図2)。さらに、DIC画像を解析し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色され?...

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Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

トンネリングナノチューブ(TNT)は、主にオープンエンドのFアクチン膜ナノチューブであり、隣接する細胞を接続し、細胞間コミュニケーションを促進します。TNTを他の細胞突起と区別する注目すべき特徴は、細胞間のナノチューブのホバリング特性です。ここでは、共焦点zスタック画像の3Dボリュームビューを構築することにより、TNTを特徴付けます。

3Dボリュームビュー画像を用いたトンネルナノチューブの検出と定量

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

トンネリングナノチューブ固有のマーカーの欠如は、この分野の進歩を制限し、トンネリングナノチューブを識別、特性評価、および定量化する方法に対する需要が高まっています。自動検出方法は、アルゴリズムの開発や既存のアルゴリズムの変更の専門知識がなければ実装が困難ですが、手動の方法はより正確に簡単に実装できます。トンネルナノチューブを介した長距離細胞間移動は、神経変性病理、ウイルス拡散、癌など、さまざまな疾患モデルでいくつかの方法で実装されています。したがって、病因におけるナノチューブの役割を理解するためのトンネルナノチューブの研究は重要です。染色プロセス中にトンネルナノチューブが破損する可能性があります。カバースリップを使用したり、スライドに取り付けたりすることは避け、代わりにガラス底のイメージングディッシュを使用してください。修正された固定プロトコルは、トンネリングナノチューブを無傷に保つのに役立ちます。手順を実演するのは、サンギータNAFの研究室の博士課程の学生であるディーパックKVです。まず、コントロールおよびオリゴマーA-β処理細胞をPBSで2分間2回洗浄してから固定します。pH 7.2の0.1モルリン酸緩衝液に溶解した2%ホルマリン固定液と2.5%グルタルアルデヒドを使用して、カルノフスキーの固定液を調製します。次に、カルノフスキーの固定液を室温で45分間加えて、イメージングディッシュ内の細胞を固定します。0.1グラムのサポニンを5ミリリットルのFBSに溶解し、95ミリリットルのPBSを加えて希釈してインキュベーションバッファーを調製します。その後、固定した細胞をインキュベーションバッファーを用いて2分間2回洗浄する。固定後、ホスホ-PAK1に対する最初の抗体を加え、インキュベーションバッファーに1〜250の希釈を加え、暗くて湿ったチャンバーで摂氏4度で一晩インキュベートします。24時間のインキュベーションの翌日、細胞をインキュベーションバッファーで2分間2回洗浄する。次に、Alexa Fluor 488およびファロイジン555に結合した二次抗体を追加します。細胞を暗くて湿ったチャンバー内で室温で1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をインキュベーションバッファーで2分間2回洗浄する。DAPIを1〜2000倍に希釈して核を染色し、暗所で室温で5〜10分間インキュベートします。90%グリセロールと10%PBS中の25ミリグラムのDABCOを使用してDABCO封入剤を準備します。適切に溶解するには、分光光度グレードの希塩酸を使用してpHを8.6に調整し、溶液をロッカーに置いて混合します。漂白防止剤として、DABCO封入剤を、底部にカバースリップを含むイメージングディッシュに直接追加します。少なくとも1〜2時間待ってから、共焦点イメージングの実行に直接進みます。トンネルナノチューブを特定するには、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して免疫染色細胞のZスタック画像をキャプチャし、最初にチャネルを選択し、共焦点ソフトウェアのウィンドウトラック1、トラック2、トラック3で必要なレーザーを順番にクリックします。トラック1ウィンドウの下にあるオプションTPMTをクリックして、蛍光チャンネルを含む微分干渉コントラスト画像を撮影します。ソフトウェアの[取得]タブを選択し、[Zスタック]タブをクリックして、ウィンドウが開くのを待ちます。次に、をクリックします ライブスキャン 皿の下部にあるセルに焦点を合わせます。フォーカスされた画像を最初のスタックとして選択し、上に焦点を合わせてセルの一番上の部分を表示し、それを最後のスタックとして選択します。ライブスキャンを停止し、[最適]タブの横にある数字をクリックして、セルの厚さに基づいてスライスの数と間隔を決定するスタックのステップサイズを修正します。405ナノメートル、488ナノメートル、および561ナノメートルのレーザーでDAPI、FITC、およびTRITCの3つのチャネルの連続画像を撮影し、1.02マイクロ秒のピクセル滞留時間でキャプチャします。蛍光チャンネルでDICチャンネルで画像を撮影し、細胞境界を観察します。フィジーのソフトウェアでcziデータ形式で保存された共焦点画像を開いて分析します。Hyperstackオプションを選択して、イメージの各Zスタックとチャンネルを表示します。チャネルと Z スタックのスクロール バーをスクロールして、目的の特定のチャネルの正確なスタックを選択します。次に、最初にチャンネルバーをスクロールしてF-アクチン染色チャンネルを選択し、Zスタックを手動でスクロールして各スタックを1つずつ表示します。Zスタックの下部に見え、Zが神経突起として2に等しいイメージングディッシュの表面に近い細胞を接続しているように見えるFアクチン染色構造を特定します。トンネルナノチューブ、F-アクチン正ホバリングセルをZから4に等しい上に向かってスクロールすることによって細胞導管に正のホバリングを同定する。Zスタックの下部近くで表面に向かって神経突起を探し、Zスタックが6に等しいZスタックの上部に向かってスクロールすると、神経突起が消え始めることを確認します。Zスタックからの導管のホバリング特性を分析することにより、F-アクチン陽性トンネルナノチューブと同様にホスホ-PAK1正トンネリングナノチューブを特定します。ホスホPAK1染色はF-アクチン染色よりも弱いため、Zが4に、Zが6に、ホスホPAK1染色されたトンネルナノチューブを探します。さらに、DIC画像を観察し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたトンネルナノチューブ構造体が細胞間の膜導管であることを確認した。さらに、F-アクチンチャネルとホスホ-PAK1チャネルをマージして、同定されたトンネルナノチューブがF-アクチンとホスホ-PAK1の共染色構造であることを確認します。トンネリングナノチューブを定量化するには、総細胞数と同定されたトンネリングナノチューブを手動でカウントし、その数をパーセンテージで表します。ホバリング導管のようなFアクチンとベータIIIチューブリンの正のトンネリングナノチューブをZスタック画像から区別するには、FアクチンとベータIIIチューブリンチャネルをマージし、マージされた画像のZスタックを分析します。3に等しいZでかすかに見え、6に等しいZと9に等しいZで目立つF-アクチン染色トンネルナノチューブのみを探してください。同様に、F-アクチンとベータIIIチューブリンを特定します。Zが6に等しく、Zが9に等しいホバリング導管のような二重正のトンネリングナノチューブ。Zスタックの下部から他のFアクチンおよびベータIIIチューブリン染色された非ホバリング突起を特定します。フィジーのラインツールを使用して、トンネルナノチューブの直径を測定します。[分析]をクリックして測定のスケールを確認し、ピクセル単位の距離がczi画像から自動的に設定されるようにスケールを設定します。XY平面におけるトンネルナノチューブの直径を測定します。3D再スライスとしきい値対応の3D視覚化を可能にするフィジーのボリュームビューアプラグインを使用して、Zスタック画像を個々のチャネルに分割します。次に、単一チャンネルのZスタック画像をトリミングして、3D再構成ビューを使用して、一度に1つまたは2つのトンネルナノチューブまたは神経突起を強調表示します。単一のトンネルナノチューブまたはニューライトをXY平面に固定し、XZおよびYZアクセス断面をマークします。XZ平面の下部、XZおよびYZ平面の神経突起、および上部のZスタックのトンネルナノチューブを観察します。個々のトンネリングナノチューブまたはニューライトを選択して、XZ平面の3Dボリュームビューを再構築します。3D再構成では、Z面の下部にある神経突起と、底部のZ平面に触れることなく2つの細胞を接続するホバリング構造として現れるトンネルナノチューブを観察します。F-アクチンおよびホスホ-PAK1で免疫染色した細胞の共焦点Zスタック画像を解析し、トンネルナノチューブを同定した。さらに、DIC画像を解析し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたトンネルナノチューブ構造が細胞間の膜導管であることを確認しました。細胞をF-アクチンおよびβIIIチューブリンで二重免疫染色し、トンネルナノチューブ様F-アクチンおよびトンネリングナノチューブ様F-アクチンおよびβIIIチューブリン二重陽性膜導管は、F-アクチン陽性トンネルナノチューブのみと区別された。ホスホPAK1とF-アクチンを共発現させたトンネルナノチューブは、基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングするという特性に基づいて3Dボリュームビュー画像を構築することにより、他の神経突起の細胞突起と区別されました。サンプルの不完全な固定は、標的タンパク質の急速なタンパク質分解および特異的免疫反応性の低下につながる可能性があるため、右固定剤の使用は重要である。

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

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Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

マウスにおけるコンダクタンスカテーテルを用いて心臓圧力 - 体積ループ解析

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

リトマス試験を用いて細菌の比色検出

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

ボリューム分割と SuRVoS (超領域ボリューム分割) ワークベンチを用いた生物学的材料の分析

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...