Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
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D.K.V와 A.R은 TMA Pai 펠로우십에 대해 Manipal Academy of Higher Education에 감사드립니다. SERB-SRG(#SRG/2021/001315)에 대한 인도 과학 및 공학 연구 위원회와 인도 의학 연구 위원회(#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) 및 인도 마니팔에 있는 마니팔 고등 교육 아카데미의 교내 기금에 감사드립니다. JNCASR (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) 공초점 시설과 B. Suma에 JNCASR의 컨포칼 현미경에 감사드립니다.

참고: DMEM/F-12 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포를 7일 동안 10μM 레티노산으로 분화시키고 37°C(5%CO2)에서 2시간 동안 1μM oAβ 올리고머로 처리했습니다. 처리 후, 세포를 카르노프스키의 고정 용액으로 고정하고, 포스포-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) 항체 및 F-액틴-결합 팔로이딘으로 이중 면역염색하였다. 나중에 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 컨포칼 z-스택 이미지를 촬영했습니다. TNT는 수동...

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	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

지난 2 년 동안 여러 연구자들은 TNT18의 구조를 이해하고 특성화하려고 노력해 왔습니다. 특정 마커의 부족은 진행을 방해하고 TNT를 식별, 특성화 및 정량화하는 데 사용할 수 있는 편리하고 표준화된 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. TNT는 두 세포 사이를 맴도는 F-액틴 기반 막 도관으로 정의됩니다. 연구에 따르면 β 튜 불린 양성, 폐쇄 종말, 발달 신경 돌기는 두 개의 먼 ...

터널링 나노 튜브 (TNT)는 F- 액틴 기반의 주로 개방형 막 도관이며화물 및 세포 기관의 세포 간 이동에 중요한 역할을합니다1. TNT의 독특한 특징은 지층과의 접촉없이 이웃 세포를 연결한다는 것입니다. 길이는 10-300 μm 이상이며 직경은 50 nm에서 1 μm 2,3 사이입니다. TNT는 일시적인 구조이며 수명은 몇 분에서 몇 시간 사이입니다. TNT는 PC12 뉴런 세포1에서 처음 입증되었습니다. 나중에 수많은 연구에서 시험관 내 및 생체 내여러 세포 유형에서 존재하는 것으로 나타났습니다 4,5. 여러 연구에서 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 6,7,8과 같은 다양한 질병 모델에서 TNT의 병리학 적 중요성이 밝혀졌습니다.
TNT의 구조적 이질성은 다양한 세포 시스템에서 여러 연구에 의해 입증되었습니다9. 차이점은 세포 골격 구성, 형성 메커니즘 및 이송 된화물 유형을 기반으로합니다10. 주로, 두 개의 인접한 세포 사이를 맴돌고 세포 기관을 전달하는 개방형 F- 액틴 양성 막 연속성은 TNT11로 구성된 것으로 간주됩니다. 그러나 TNT 형성에서 관찰되는 명확성 또는 다양성의 부족은 TNT 특이 적 마커를 개발하는 데 어려움을 더합니다. 따라서, 종래의 검출 방법에 의해 TNT 구조를 동정하고, 개방형 및 폐쇄 단부 돌출부(12)의 관점에서 막 나노튜브를 구별하는 것은 어렵다. 그러나, 두 세포 사이의 F-액틴 막 돌출부로서 호버링하는 TNTs의 특성은 종래의 이미징 기술을 사용하여 식별하기가 상대적으로 쉽고 실현 가능하다. 필로포디아 및 등쪽 필로포디아와 같은 다른 액틴 기반 세포 돌출부는 특히 세포가 고정된 경우 멀리 있는 두 세포 사이를 맴돌 수 없습니다. 참고로, 폐쇄되고 전기적으로 결합되어 발달하는 신경돌기는 종종 TNT 유사 구조(13)라고 불립니다.
F- 액틴은 TNT 형성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 여러 연구에서 F- 액틴 억제제 사이토 칼라 신 D가 TNT14,15의 형성을 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 대조적으로, 미세소관의 억제제는 TNT 형성16에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 지난 2 년 동안 TNT가 병리학 및 종양 내성 및 치료의 확산에서 중요한 역할을한다는 여러 보고서가있었습니다17. 따라서 TNT 특성화를 위한 더 나은 기술에 대한 끝없는 요구가 있습니다.
TNT의 특정 마커가 부족하고 형태 및 세포 골격 구성의 다양성으로 인해 고유 한 특성 분석 방법을 개발하기가 어렵습니다. 일부 연구는 자동 이미지 검출 및 TNT 정량화 기술을 사용했습니다18,19. 그러나, TNT의 검출 및 정량화를 위한 자동 이미지 분석에 비해 현재의 3D 부피 수동 분석 방법의 몇 가지 장점이 있다. 종종 훈련된 인간의 눈은 자동화된 이미지 감지 방법보다 이러한 호버링 나노 구조를 더 쉽게 발견할 수 있습니다. 또한 자동 검출 방법은 알고리즘 전문 지식이 부족한 실험실에서 구현하기 어려울 수 있습니다. 현재의 방법은 정밀도와 재현성으로 인해 연구자들에 의해 널리 채택 될 수 있습니다.
최근 연구에서 우리는 oAβ가 PAK1 매개 액틴 의존성 엔도 사이토 시스 메커니즘을 통해 신경 세포에서 TNT의 생물 발생을 촉진한다는 것을 보여주었습니다12. oAβ-유도 TNT는 또한 활성화된 PAK1 (또는 포스포-PAK1)을 발현한다. 우리는 oAβ 유도, F- 액틴 및 포스 포 -PAK1- 면역 염색 TNT를 구별하기 위해 3D 부피보기 이미지 재구성 방법을 개발했습니다. β-III 튜 불린 양성, 발달 신경돌기는 종종 TNT와 같은 호버링 구조와 유사합니다20. 따라서 우리는 F- 액틴 기반 TNT를 β-III 튜 불린 양성 신경 돌기 및 기타 TNT 유사 돌출부와 구별했습니다. 3D 볼륨 뷰 이미지는 지층 위로 마우스를 가져가고 인접한 두 셀 사이에 연결된 상태를 유지하는 특성을 기반으로 TNT를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 백서에서는 컨포칼 z-스택 이미지를 사용하여 액틴 함유 막 도관 또는 TNT를 식별 및 검출하고, 마지막으로 3D 볼륨 뷰 재구성 이미지에서 식별된 구조를 수동으로 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 제시된 방법은 개방형 적절한 TNT와 폐쇄형 TNT 유사 구조를 구별할 수 없습니다. 이 방법은 평평한 지층에서 시험 관 내 2D 세포 배양에서 TNT를 식별하는 데 도움이 됩니다. 그러나 이 방법은 구현 및 재현이 용이하며 액틴계 TNT만을 정밀하게 정량하고 신경돌기 및 β튜불린 양성 TNT 유사 구조와 구별하는 데 널리 사용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

최근의 발견에 따르면 세포는 나노 크기의 액틴-막 도관, 즉 "터널링 나노 튜브"(TNT)를 통해 직접적이고 장거리 세포 간 전달을 수행합니다. TNT는 50nm에서 1μm 사이의 직경을 가진 이웃 세포 사이의 연속성을 매개하는 개방형 지질 이중층으로 둘러싸인 막 확장으로 정의됩니다. TNT는 처음에는 신경 세포에서 입증되었지만 연속적인 연구에서 신경 퇴행성 질환, 바이러스 감염 및 암과 같은 여러 세포 유형 및 질병에서 TNT의 존재가 밝혀졌습니다. 여러 연구에서 이웃 세포 사이의 폐쇄형, 전기 결합 막 나노 구조를 TNT 또는 TNT 유사 구조로 언급했습니다.
종말점에서의 막 연속성 측면에서 미세 구조의 해명은 기술적으로 어렵습니다. 또한, 세포-세포 통신에 대한 연구는 특정 마커가 없기 때문에 종래의 방법을 사용한 TNT의 특성 분석 측면에서 도전적이다. TNT는 주로 F- 액틴 기반의 개방형 막 돌출부로 정의됩니다. 그러나 한 가지 주요 한계는 F- 액틴이 모든 유형의 돌출부에 존재하여 TNT를 다른 돌출부와 구별하기가 어렵다는 것입니다. F- 액틴 기반 TNT의 주목할만한 특징 중 하나는 이러한 구조가 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴돌고 있다는 것입니다. 따라서, 별개의 F- 액틴 염색 TNT는 세포 사이의 호버링에 기초하여 필로 포디아 및 신경 돌기와 같은 다른 돌출부와 편리하게 구별 될 수있다.
우리는 최근 액틴 의존성 엔도 사이토 시스를 통한 올리고머 아밀로이드 -β1-42 (oAβ)의 내재화가 활성화 된 p21- 활성화 키나아제 -1 (PAK1)을 자극하여 SH-SY5Y 신경 세포 사이에서 phospho-PAK1과 공동 발현되는 F- 액틴 함유 TNT의 형성을 매개한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 oAβ 처리된 신경 세포에서 F-액틴 및 포스포-PAK1-면역염색 막 돌출부의 캡처된 z-스택 이미지에서 TNT를 식별하고 특성화하기 위한 3D 부피 분석 방법을 설명합니다. 또한, TNT는 F- 액틴 - 및 β -III 튜 불린 - 면역 염색 막 도관을 기반으로 한 신경 돌기 및 신경 세포 파생물을 개발하는 것과 구별된다.

여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지에서 3D 볼륨 뷰를 구성하여 SH-SY5Y 신경 세포에서 oAβ 유도 TNT를 식별하고 특성화합니다(그림 1). 세포를 F-액틴 및 포스포-PAK1로 이중 면역염색하였다. 면역염색된 세포의 공초점 z-스택 이미지를 분석하여 TNT를 식별했습니다(그림 2). 또한, DIC 이미지를 분석하여 F-액틴- 및 포스포-PAK1 염색된 TNT 구조가 세포 사이의 막 도?...

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Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

터널링 나노 튜브 (TNT)는 주로 인접한 세포를 연결하여 세포 간 통신을 촉진하는 개방형 F- 액틴 막 나노 튜브입니다. TNT를 다른 세포 돌출부와 구별하는 주목할만한 특징은 세포 사이의 나노 튜브의 호버링 특성입니다. 여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지의 3D 볼륨 뷰를 구성하여 TNT의 특성을 분석합니다.

3D 볼륨 뷰 이미지를 사용한 터널링 나노튜브의 검출 및 정량화

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

터널링 나노 튜브 특이 적 마커의 부족은 현장에서의 진행을 제한하고 터널링 나노 튜브를 식별, 특성화 및 정량화하는 방법에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 자동 검출 방법은 알고리즘을 개발하거나 기존 알고리즘을 변경할 수 있는 전문 지식 없이는 구현하기 어렵지만 수동 방법은 더 정밀하게 구현하기 쉽습니다. 터널링 나노 튜브를 통한 장거리 세포 간 전달은 신경 퇴행성 병리학, 바이러스 확산 및 암을 포함한 다양한 질병 모델에서 여러 가지 방식으로 구현됩니다.따라서 병인에서의 역할을 이해하기 위해 나노 튜브 터널링에 대한 연구가 중요합니다. 염색 과정에서 터널링 나노 튜브가 파손될 수 있습니다. 커버 슬립을 사용하거나 슬라이드에 장착하지 말고 대신 유리 바닥 이미징 접시를 사용하십시오.수정 된 고정 프로토콜은 터널링 나노 튜브를 그대로 유지하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 Sangeeta NAF 실험실의 박사 과정 학생 인 Deepak KV가 될 것입니다. 시작하기로, 대조군 및 올리고머 A-베타 처리된 세포를 고정 전에 2분 동안 PBS로 2회 세척한다.pH 7.2의 0.1 몰 인산염 완충액에 용해 된 2 % 포르말린 정착액과 2.5 % 글루 타르 알데히드를 사용하여 Karnovsky의 고정 용액을 준비하십시오. 그런 다음 Karnovsky의 고정 용액을 실온에서 45 분 동안 추가하여 이미징 접시에 세포를 고정시킵니다. 5 밀리리터의 FBS에 0.1 그램의 사포닌을 용해시켜 배양 완충액을 제조하고 95 밀리리터의 PBS를 첨가하여 희석한다.그 후 고정된 세포를 2분 동안 배양 완충액을 사용하여 2회 세척한다. 고정 후, phospho-PAK1에 대한 첫 번째 항체를 추가하고, 인큐베이션 완충액에 1 내지 250의 희석물을 첨가하고, 어둡고 습한 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 다음날 24 시간 배양 후, 배양 완충액으로 세포를 2 분 동안 두 번 세척한다.그런 다음 Alexa Fluor 488 및 Phalloidin 555에 접합 된 2 차 항체를 추가하십시오. 세포를 실온에서 1.5 시간 동안 어둡고 습한 챔버에서 배양한다. 인큐베이션 후, 세포를 2분 동안 인큐베이션 완충액으로 2회 세척한다.1 내지 2000 희석액의 DAPI를 첨가하여 핵을 염색하고 암실에서 실온에서 5 내지 10분 동안 배양한다. 90% 글리세롤 및 10% PBS에서 25mg의 DABCO를 사용하여 DABCO 장착 매체를 준비합니다. 적절하게 용해하려면 분광 광도계 등급의 묽은 염산을 사용하여 pH를 8.6으로 조정하고 혼합을 위해 용액을 로커에 보관하십시오.표백 방지제로 DABCO 장착 매체를 바닥에 커버 슬립이 포함된 이미징 접시에 직접 추가합니다. 최소 1-2 시간 동안 기다렸다가 직접 컨포칼 이미징을 수행하십시오. 터널링 나노튜브를 식별하려면 먼저 채널을 선택하고 컨포칼 소프트웨어의 창 트랙 1, 트랙 2 및 트랙 3에서 필요한 레이저를 순차적으로 클릭하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 면역염색 세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.트랙 1 창 아래에 있는 TPMT 옵션을 클릭하여 형광 채널이 있는 미분 간섭 대비 이미지를 촬영합니다. 소프트웨어의 획득 탭을 선택하고 Z 스택 탭을 클릭한 다음 창이 열릴 때까지 기다립니다. 그런 다음 라이브 스캔을 클릭하여 접시 하단의 셀에 초점을 맞춥니다.초점이 맞춰진 이미지를 첫 번째 스택으로 선택한 다음 셀의 맨 위 부분을 볼 수 있도록 초점을 맞추고 마지막 스택으로 선택합니다. 라이브 스캔을 중지하고 최적 탭 옆에 있는 숫자를 클릭하여 셀 두께를 기준으로 슬라이스 수와 간격을 결정하는 스택의 단계 크기를 수정합니다. 405나노미터, 488나노미터 및 561나노미터 레이저로 DAPI, FITC 및 TRITC의 3개 채널을 순차적으로 촬영하고 1.02마이크로초의 픽셀 체류 시간으로 캡처합니다.형광 채널이 있는 DIC 채널에서 이미지를 캡처하여 세포 경계를 관찰합니다. 분석을 위해 피지 소프트웨어에서 czi 데이터 형식으로 저장된 공초점 이미지를 엽니다. 하이퍼스택 옵션을 선택하여 이미지의 각 Z 스택 및 채널을 확인합니다.채널 및 Z 스택 스크롤 막대를 스크롤하여 관심 있는 특정 채널의 정확한 스택을 선택합니다. 그런 다음 먼저 채널 막대를 스크롤하여 F-actin 염색 채널을 선택하고 Z-스택을 수동으로 스크롤하여 각 스택을 하나씩 확인합니다. Z-스택의 하부에서 볼 수 있고 Z가 신경돌기로 2인 이미징 접시의 표면에 가까운 세포를 연결하는 것처럼 보이는 F-액틴 염색 구조를 식별합니다.터널링 나노 튜브를 식별하고, Z- 스택을 Z에서 4까지 상단으로 스크롤하여 F- 액틴 양성 호버링 세포 대 세포 도관을 식별합니다. 표면을 향한 Z-스택의 아래쪽 부분 근처에서 신경돌기를 찾고 Z-스택이 6인 Z에서 상단으로 스크롤되면서 사라지기 시작하는 것을 관찰합니다. Z-스택에서 도관의 호버링 특성을 분석하여 F-액틴 양성 터널링 나노튜브와 유사하게 phospho-PAK1 포지티브 터널링 나노튜브를 식별합니다.phospho-PAK1 염색은 F- 액틴 염색보다 약하기 때문에 Z가 4이고 Z가 6 인 phospho-PAK1 염색 터널링 나노 튜브를 찾으십시오. 또한, DIC 이미지를 관찰하여 F-actin 및 phospho-PAK1 염색 터널링 나노튜브 구조가 세포간 막 도관임을 확인하였다. 또한 F- 액틴과 phospho-PAK1 채널을 병합하여 확인 된 터널링 나노 튜브가 F- 액틴 및 phospho-PAK1 공동 염색 구조인지 확인합니다.터널링 나노 튜브를 정량화하려면 총 세포 수와 확인 된 터널링 나노 튜브를 수동으로 계산하고 숫자를 백분율로 나타냅니다. Z- 스택 이미지에서 호버링 도관과 같은 F- 액틴 및 베타 III 튜 불린 양성 터널링 나노 튜브를 구별하려면 F- 액틴 및 베타 III 튜 불린 채널을 병합 한 다음 병합 된 이미지의 Z 스택을 분석합니다. Z가 3이고 Z가 6이고 Z가 9에서 두드러지는 F- 액틴 염색 터널링 나노 튜브를 찾으십시오.유사하게, F- 액틴과 베타 III 튜 불린을 확인하십시오. Z에서 6과 같고 Z가 9에 속하는 호버링 도관과 같은 이중 양성 터널링 나노 튜브. Z-스택의 하부에서 다른 F-액틴 및 베타 III 튜불린 염색 비호버링 돌출부를 식별합니다.피지의 라인 도구를 사용하여 터널링 나노 튜브의 직경을 측정하십시오. 분석을 클릭하여 측정 배율을 확인한 다음 픽셀 단위의 거리가 czi 이미지에서 자동으로 설정되도록 배율을 설정합니다. XY 평면에서 터널링 나노 튜브의 직경을 측정합니다.3D 재 슬라이싱 및 임계 값 지원 3D 시각화를 허용하는 피지의 볼륨 뷰어 플러그인을 사용하여 Z 스택 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 그런 다음 단일 채널 Z 스택 이미지를 잘라 3D 재구성 보기를 사용하여 한 번에 하나 또는 두 개의 터널링 나노튜브 또는 신경돌기를 강조 표시합니다. XY 평면에 단일 터널링 나노 튜브 또는 신경 돌기를 고정하고 XZ 및 YZ 액세스 단면을 표시합니다.XZ 평면의 하단, XZ 및 YZ 평면의 신경돌기, 상부 Z 스택의 터널링 나노 튜브를 관찰하십시오. 개별 터널링 나노튜브 또는 신경돌기를 선택하여 XZ 평면에서 3D 볼륨 뷰를 재구성합니다. 3D 재구성에서 Z 평면의 바닥에있는 신경 돌기와 바닥 Z 평면을 건드리지 않고 두 세포를 연결하는 호버링 구조로 나타나는 터널링 나노 튜브를 관찰하십시오.F-액틴 및 포스포-PAK1을 사용한 면역염색 세포의 컨포칼 Z-스택 이미지를 분석하여 터널링 나노튜브를 식별했습니다. 또한, FIC 이미지를 분석하여 F-actin 및 phospho-PAK1 염색 터널링 나노튜브 구조가 세포 사이의 막 도관임을 확인하였다. 세포를 F-액틴과 베타 III 튜불린으로 이중면역염색하였고, 터널링 나노튜브형 F-액틴과 터널링 나노튜브 형상의 F-액틴 및 베타III 튜불린 이중 양성 막 도관은 F-액틴 양성 터널링 나노튜브만을 구별하였다.phospho-PAK1 및 F- 액틴과 함께 발현 된 터널링 나노 튜브는 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴도는 특성을 기반으로 3D 체적보기 이미지를 구성하여 다른 신경 돌기의 세포 돌출부와 구별되었습니다. 샘플의 불완전한 고정은 표적 단백질의 빠른 단백질 분해 분해 및 특정 면역 반응성의 감소로 이어질 수 있으므로 올바른 고정제의 사용이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

연구

생물학

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

마우스에서 컨덕턴스 카테터를 사용하여 심장 압력 볼륨 루프 분석

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJ에 플러그인을 사용하여 셀 카운팅 절차의 자동화 된 정량 및 분석

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

볼륨 세분화 및 SuRVoS (슈퍼 지역 볼륨 세분화) 워크 벤치를 사용 하 여 생물학 물자의 분석

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...