Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V og A.R takker Manipal Academy of Higher Education for TMA Pai-fellesskapet. Vi takker Science and Engineering Research Board of India for SERB-SRG (#SRG/2021/001315), samt Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) og Intramural fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. Vi takker JNCASRs (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) konfokalanlegg og B. Suma for konfokalmikroskopi i JNCASR.

MERK: SH-SY5Y-celler dyrket i DMEM/F-12-medier ble differensiert med 10 μM retinsyre i 7 dager og behandlet med 1 μM oAβ oligomerer i 2 timer ved 37 °C (5 % CO2). Etter behandling ble cellene fiksert med Karnovskys fiksative løsning og dobbeltimmunstainert med fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antistoff og F-aktinbindende phalloidin. Senere ble konfokale z-stack-bilder tatt ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. TNT-ene ble kvantifisert ved manuell telling og skilt fra andre nevritter/cellefre...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Flere forskere de siste 2 tiårene har forsøkt å forstå og karakterisere strukturen til TNTs18. Mangelen på spesifikke markører hindrer fremgang, og det er en økende etterspørsel etter en praktisk, standardisert metode som kan brukes til å identifisere, karakterisere og kvantifisere TNTs. TNTs er definert som F-aktinbaserte membranledninger som svinger mellom to celler. Studier har vist at β-tubulin-positive, nære, utviklende nevritter svever mellom to fjerne celler og ligner TNT-lignend...

Tunneling nanorør (TNTs) er F-aktinbaserte, primært åpne membranledninger og spiller en viktig rolle i intercellulær overføring av last og organeller1. Den unike egenskapen til TNT-er er at de forbinder naboceller uten kontakt med substratumet; De er over 10-300 μm lange og diametrene varierer mellom 50 nm og 1 μm 2,3. TNT er forbigående strukturer, og deres levetid varer mellom noen få minutter til flere timer. TNT ble først vist i PC12 nevronceller1; Senere viste mange studier deres eksistens i flere celletyper in vitro og in vivo 4,5. Flere studier har avdekket den patologiske betydningen av TNT i ulike sykdomsmodeller, som nevrodegenerative sykdommer, kreft og virusinfeksjoner 6,7,8.
De strukturelle heterogenitetene til TNT har blitt demonstrert av flere studier i ulike cellulære systemer9. Forskjellene er basert på cytoskelettsammensetning, dannelsesmekanismen og lasttypene som overføres10. Primært anses den åpne, F-aktinpositive membrankontinuiteten som svinger mellom to naboceller og overføringsorganeller å bestå av TNTs11. Mangelen på klarhet eller mangfold observert i dannelsen av TNT legger imidlertid til vanskeligheten med å utvikle TNT-spesifikke markører. Dermed er det vanskelig å identifisere TNT-strukturer ved konvensjonelle deteksjonsmetoder og skille membrannanorør når det gjelder åpne og lukkede fremspring12. Imidlertid er karakteristikken for TNT-er å sveve som F-aktinmembranfremspring mellom to celler relativt enklere og mer gjennomførbart å identifisere ved hjelp av konvensjonelle bildebehandlingsteknikker. Andre aktinbaserte cellulære fremspring som filopodi og dorsal filopodi kan ikke sveve mellom to fjerne celler, spesielt når celler er faste. Merk at nært, elektrisk koblet, utviklende nevritter ofte kalles TNT-lignende strukturer13.
Det er kjent at F-aktin spiller en viktig rolle i TNT-dannelsen, og flere studier har vist at F-aktinhemmeren cytochalasin D hemmer dannelsen av TNT14,15. Hemmere av mikrotubuli har derimot ingen effekt på TNT-dannelse16. De siste 2 tiårene har sett flere rapporter om den betydelige rollen som TNT spiller i spredning av patologi og tumorresistens og terapi17. Derfor er det en uendelig etterspørsel etter bedre teknikker for TNT-karakterisering.
Mangelen på spesifikke markører for TNT og mangfoldet i morfologi og cytoskeletal sammensetning gjør det vanskelig å utvikle en unik karakteriseringsmetode. Noen studier har brukt automatisert bildedeteksjon og TNT-kvantifiseringsteknikker18,19. Det er imidlertid flere fordeler med den nåværende manuelle 3D-volumanalysemetoden fremfor automatisk bildeanalyse for deteksjon og kvantifisering av TNT-er. Ofte kan trente menneskelige øyne oppdage disse svevende nanostrukturene lettere enn en automatisert bildedeteksjonsmetode. Videre kan automatiske deteksjonsmetoder være vanskelige å implementere i laboratorier som mangler algoritmekompetanse. Den nåværende metoden kan bli allment vedtatt av forskere på grunn av sin presisjon og reproduserbarhet.
I en nylig studie viste vi at oAβ fremmer biogenesen av TNT i nevronceller via en PAK1-mediert, aktinavhengig endocytosemekanisme12. oAβ-induserte TNTer uttrykker også aktivert PAK1 (eller fosfo-PAK1). Vi utviklet en 3D-volumvisningsbilde-rekonstruksjonsmetode for å skille mellom oAβ-induserte, F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained TNTs. β-III tubulin-positive, utviklende neuritter ligner ofte TNT-lignende svevende strukturer20. Derfor skilte vi videre F-aktinbaserte TNTer fra β-III tubulin-positive nevritter og andre TNT-lignende fremspring. 3D-volumvisningsbilder har blitt brukt til å identifisere TNT-er på grunnlag av deres egenskaper ved å sveve over underlaget og holde kontakten mellom to naboceller. Dette papiret beskriver identifisering og deteksjon av aktinholdige membranrør eller TNT-er ved hjelp av konfokale z-stack-bilder og til slutt manuell kvantifisering av de identifiserte strukturene fra rekonstruksjonsbilder av 3D-volumvisning. Den presenterte metoden kan ikke skille åpne riktige TNT-er fra nære TNT-lignende strukturer; denne metoden bidrar til å identifisere TNT i in vitro 2D-cellekultur på et flatt substratum. Metoden er imidlertid enkel å implementere og reprodusere og kan brukes mye til presis kvantifisering av bare aktinbaserte TNT-er og for å skille dem fra nevritter og β-tubulinpositive TNT-lignende strukturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Nylige funn har avslørt at celler utfører direkte, langdistanse, intercellulær overføring via nanoskala, aktinmembranledninger, nemlig "tunneling nanorør" (TNTs). TNT er definert som åpne, lipid dobbeltlagsomkransede membranutvidelser som formidler kontinuitet mellom naboceller med diametre mellom 50 nm og 1 μm. TNT ble først demonstrert i nevronceller, men suksessive studier har avslørt eksistensen av TNT i flere celletyper og sykdommer, som nevrodegenerative sykdommer, virusinfeksjoner og kreft. Flere studier har referert til nære, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellom naboceller som TNT eller TNT-lignende strukturer.
Belysning av ultrastruktur i form av membrankontinuitet ved endepunktet er teknisk utfordrende. I tillegg er studier på celle-cellekommunikasjon utfordrende når det gjelder karakterisering av TNT ved bruk av konvensjonelle metoder på grunn av mangel på spesifikke markører. TNT er primært definert som F-aktinbaserte, åpne membranfremspring. En stor begrensning er imidlertid at F-aktin er tilstede i alle typer fremspring, noe som gjør det utfordrende å skille TNT fra andre fremspring. En av de bemerkelsesverdige egenskapene til F-aktinbaserte TNT-er er at disse strukturene svever mellom to celler uten å berøre substratumet. Derfor kan distinkte F-aktinfargede TNT-er enkelt skilles fra andre fremspring som filopodi og nevritter basert på at de svever mellom celler.
Vi har nylig vist at internalisering av oligomer amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinavhengig endocytose stimulerer aktivert p21-aktivert kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen av F-aktinholdige TNTer coexpressed med fosfo-PAK1 mellomSH-SY5Y nevronceller. Denne protokollen skisserer en 3D-volumanalysemetode for å identifisere og karakterisere TNT-er fra de fangede z-stack-bildene av F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained membranfremspring i oAβ-behandlede nevronceller. Videre skiller TNTer seg fra å utvikle nevritter og nevronale utvekster basert på F-aktin- og β-III tubulinimmunostained membranledninger.

Her identifiserer og karakteriserer vi oAβ-induserte TNT-er i SH-SY5Y-nevronceller ved å konstruere 3D-volumvisninger fra konfokale z-stack-bilder (figur 1). Cellene ble dobbeltimmunisert med F-aktin og fosfo-PAK1. Konfokale z-stack-bilder av immunstainede celler ble analysert for å identifisere TNT-er (figur 2). Videre ble DIC-bilder analysert for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede TNT-strukturer var membrankanaler mellom celler (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tunneling nanorør (TNTs) er primært åpne F-aktin membran nanorør som forbinder naboceller, noe som letter intercellulær kommunikasjon. Den bemerkelsesverdige egenskapen som skiller TNT fra andre cellefremspring er den svevende naturen til nanorørene mellom celler. Her karakteriserer vi TNT-er ved å konstruere en 3D-volumvisning av konfokale z-stack-bilder.

Deteksjon og kvantifisering av tunnelerende nanorør ved hjelp av 3D-volumvisningsbilder

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Mangelen på tunneling nanorør spesifikke markører begrense fremdriften i feltet, og det er en økende etterspørsel etter en metode for å identifisere, karakterisere, og kvantifisere tunneling nanorør. Automatiske deteksjonsmetoder er vanskelig å implementere uten kompetanse til å utvikle en algoritme og/eller endre den eksisterende algoritmen, men vår manuelle metode er enkel å implementere med bedre presisjon. Langtrekkende intercellulær overføring via tunneling nanorør er implementert på flere måter i ulike sykdomsmodeller, inkludert nevrodegenerativ patologi, viral spredning og kreft.Dermed er studier på tunneling nanorør for å forstå deres rolle i patogenese viktig. Det er mulig tunneling nanorør kan bryte under fargingsprosessen. Unngå å bruke dekselsklier og montering på lysbildene, ved å bruke glassbunnsbilder i stedet.Modifisert fikseringsprotokoll bidrar til å holde tunnelerende nanorør intakte. Demonstrere prosedyren vil være Deepak KV, en doktorgradsstudent fra laboratoriet til Sangeeta NAF. For å begynne, vask kontroll- og oligomere A-beta-behandlede celler to ganger med PBS i to minutter før fiksering.Forbered Karnovskys fiksative løsning ved å bruke 2% formalinfiksativ og 2,5% glutaraldehyd oppløst i 0,1 molar fosfatbuffer av pH 7,2. Fest deretter cellene i bildebehandlingsfatet ved å tilsette Karnovskys fikseringsløsning i 45 minutter ved romtemperatur. Forbered inkubasjonsbufferen ved å oppløse 0, 1 gram saponin i fem milliliter FBS og fortynnet ved å tilsette 95 ml PBS.Vask deretter de faste cellene to ganger ved hjelp av inkubasjonsbuffer i to minutter. Etter fiksering, tilsett det første antistoffet mot fosfo-PAK1, tilsett en fortynning på en til 250 i inkubasjonsbufferen og inkuber over natten ved fire grader Celsius i et mørkt, fuktig kammer. Neste dag etter 24 timers inkubasjon, vask cellene to ganger med inkubasjonsbufferen i to minutter.Legg deretter til sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor 488 og Phalloidin 555. Inkuber cellene i det mørke, fuktige kammeret i 1,5 timer ved romtemperatur. Etter inkubasjonen, vask cellene to ganger med inkubasjonsbuffer i to minutter.Flekk kjernen ved å legge til DAPI i en til 2000 fortynning og inkubere i fem til 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Forbered DABCO monteringsmedium ved bruk av 25 milligram DABCO i 90% glyserol og 10% PBS. For å oppløses riktig, juster pH til 8,6 ved hjelp av spektrofotometrisk fortynnet saltsyre og hold løsningen på en vippe for blanding.Som et antiblekingsmiddel, tilsett DABCO-monteringsmediet direkte på bildeparabolen som inneholder dekselet i bunnen. Vent i minst en til to timer og fortsett direkte med å utføre konfokal bildebehandling. For å identifisere tunneling nanorør, ta Z-stack bilder av immunostained celler ved hjelp av en konfokal laser-skanning mikroskop ved først å velge kanalene og klikke på de nødvendige lasere sekvensielt i vinduene spor en, spor to, og spor tre i confocal programvare.Klikk på alternativet TPMT under spor ett-vinduet for å ta bildene med differensiell interferenskontrast med fluorescenskanaler. Velg anskaffelsesfanen til programvaren, klikk på Z-stack-fanen og vent til et vindu åpnes. Klikk deretter Live Scan for å fokusere cellene nederst i parabolen.Merk det fokuserte bildet som den første stakken, og fokuser deretter opp for å se den øverste delen av cellen, og merk det som den siste stakken. Stopp live skanning og klikk på tallet ved siden av kategorien Optimal for å fikse trinnstørrelsen på stablene som bestemmer antall skiver og intervaller basert på tykkelsen på cellene. Ta sekvensielle bilder av tre kanaler med DAPI, FITC og TRITC med 405 nanometer, 488 nanometer og 561 nanometer lasere og ta opp med en pikseloppholdstid på 1,02 mikrosekund.Ta bilder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler for å observere cellegrensen. Åpne de konfokale bildene som er lagret i CZI-dataformat i Fiji-programvaren for analyse. Velg Hyperstack-alternativet for å se hver Z-stakk og kanal i bildet.Bla gjennom kanalen og rullefeltene for Z-stack for å velge den nøyaktige stakken for en bestemt kanal av interesse. Velg deretter F-aktinfarget kanal først ved å rulle kanallinjen og manuelt bla Z-stablene for å se hver stabel en etter en. Identifiser F-aktinfargede strukturer som ser ut til å forbinde celler som er synlige i de nedre delene av Z-stablene og er nær overflaten av bildebehandlingsskålen med Z lik to som nevritter.Identifiser tunnelerende nanorør, den F-aktinpositive svevende cellen til celleledninger ved å rulle Z-stablene mot toppen fra Z er lik fire. Se etter nevritter nær de nedre delene av Z-stablene mot overflaten og observer at de begynner å forsvinne med rulling av Z-stabler mot toppen ved Z lik seks. Identifiser fosfo-PAK1 positive tunneling nanorør på samme måte som F-aktin positive tunneling nanorør ved å analysere den svevende naturen til ledningene fra Z-stablene.Siden fosfo-PAK1-farging er svakere enn F-aktinfarging, se etter fosfo-PAK1-fargede tunnelnanorør ved Z lik fire og ved Z lik seks. Videre må du observere DIC-bildene for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede tunnelerende nanorørstrukturer er membranledninger mellom celler. I tillegg slår du sammen F-aktin- og fosfo-PAK1-kanaler for å verifisere at de identifiserte tunnelnanorørene er F-aktin- og fosfo-PAK1-samfargede strukturer.For å kvantifisere tunneling nanorør, telle de totale cellenumrene og de identifiserte tunneling nanorørene manuelt og representere tallene som prosentandeler. For å skille F-aktin og beta III tubulin positive tunneling nanorør som svevende kanaler fra Z-stack bilder, slå sammen F-aktin og beta III tubulin kanaler, og analyser deretter Z-stablene til de sammenslåtte bildene. Se etter utelukkende F-aktinfargede tunnelerende nanorør som er svakt synlige ved Z lik tre og fremtredende ved Z lik seks og Z lik ni.På samme måte identifisere F-aktin og beta III tubulin. dobbelt-positive tunneling nanorør som svevende ledninger ved Z lik seks og Z lik ni. Identifiser andre F-aktin og beta III tubulinfargede ikke-svevende fremspring fra de nedre delene av Z-stablene.Mål diameteren på tunnelnanorørene ved hjelp av Line-verktøyet i Fiji. Kontroller målskalaen ved å klikke Analyser og deretter angi skala slik at avstanden i piksler angis automatisk fra czi-bildene. Mål diametrene til tunnelnanorørene på XY-planet.Ved hjelp av Volume Viewer-plugin i Fiji som tillater 3D-re-slicing og terskelaktivert 3D-visualisering, kan du dele Z-stack-bildene i individuelle kanaler. Beskjær deretter Z-stack-bildene med én kanal for å bruke 3D-rekonstruksjonsvisning til å utheve én eller to tunnelerende nanorør eller nevritter om gangen. Pin en enkelt tunneling nanorør eller nevritt i XY planet og merke XZ og YZ tilgang tverrsnitt.Observer nevrittene på bunnen av XZ-planet, i XZ- og YZ-planene, og tunnelnanorørene i de øvre Z-stablene. Velg de enkelte tunnelnanorørene eller nevitten for å rekonstruere 3D-volumvisningen i XZ-planet. I 3D-rekonstruksjonen observerer du nevrittene i bunnen av Z-planet og tunnelnanorørene som fremstår som svevende strukturer som forbinder to celler uten å berøre det nederste Z-planet.Konfokale Z-stack-bilder av immunstainede celler med F-aktin og fosfo-PAK1 ble analysert for å identifisere tunnelerende nanorør. Videre ble DIC-bilder analysert for å verifisere at F-aktin- og fosfo-PAK1-fargede tunnelerende nanorørstrukturer var membranledninger mellom celler. Cellene ble dobbelt immunostained med F-aktin og beta III tubulin og tunneling nanorør-lignende F-aktin og tunneling nanorør-lignende F-aktin og beta III tubulin dobbel positiv membran ledninger ble skilt fra bare F-aktin positive tunneling nanorør.De tunnelerende nanorørene som ble uttrykt sammen med fosfo-PAK1 og F-aktin ble skilt fra andre nevritters cellefremspring ved å konstruere 3D-volumvisningsbilder basert på deres karakteristikk av å sveve mellom to celler uten å berøre substratumet. Bruk av riktig fikseringsmiddel er viktig da ufullkommen fiksering av prøven kan føre til rask proteolytisk nedbrytning av målproteinene og en reduksjon i den spesifikke immunreaktiviteten.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac Trykk Volume Loop analyse ved hjelp Conductance katetre i Mus

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolo Påvisning av bakterier Bruke lakmustest

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Automatisert Kvantifisering og analyse av Cell Telle prosedyrer ved hjelp ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Trekke membran nanorør fra gigantiske Unilamellar blemmer

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volum segmentering og analyse av biologisk materiale med SuRVoS (super regionen volum segmentering) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trinns omvendt transkripsjon dråpe digitale PCR-protokoller for SARS-CoV-2 deteksjon og kvantifisering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantifisering av cellulære tettheter og antigene egenskaper ved hjelp av magnetisk levitasjon

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantifisering av interbakteriell konkurranse ved bruk av encellet fluorescensavbildning

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...