Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
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D.K.V e A.R agradecem à Academia Manipal de Ensino Superior pela bolsa TMA Pai. Agradecemos ao Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia da Índia pelo SERB-SRG (#SRG/2021/001315), bem como ao Conselho Indiano de Pesquisa Médica da Índia (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) e ao fundo Intramural da Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Índia. Agradecemos à instalação confocal do JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Índia) e à B. Suma pela microscopia confocal no JNCASR.

NOTA: As células SH-SY5Y cultivadas em meio DMEM/F-12 foram diferenciadas com ácido retinóico de 10 μM por 7 dias e tratadas com oligômeros de 1 μM oAβ por 2 h a 37 °C (5% de CO2). Após o tratamento, as células foram fixadas com solução fixadora de Karnovsky e duplamente imunocoradas com anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina ligadora de F-actina. Posteriormente, imagens confocais de pilha z foram obtidas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Os TNTs foram quantific...

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	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Vários pesquisadores nas últimas 2 décadas vêm tentando entender e caracterizar a estrutura dos TNTs18. A falta de marcadores específicos dificulta o progresso, e há uma demanda crescente por um método conveniente e padronizado que possa ser usado para identificar, caracterizar e quantificar TNTs. Os TNTs são definidos como conduítes de membrana à base de actina F que pairam entre duas células. Estudos têm demonstrado que neurites em desenvolvimento β-tubulina-positivas, fechadas, pai...

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são condutos de membrana à base de actina F, principalmente abertos, e desempenham um papel vital na transferência intercelular de carga e organelas1. A característica única dos TNTs é que eles conectam células vizinhas sem qualquer contato com o substrato; têm mais de 10-300 μm de comprimento e os seus diâmetros variam entre 50 nm a 1 μm 2,3. Os TNTs são estruturas transitórias e sua vida útil dura entre alguns minutos a várias horas. Os TNTs foram demonstrados pela primeira vez em células neuronaisPC12 1; posteriormente, numerosos estudos mostraram sua existência em vários tipos celulares in vitro e in vivo 4,5. Diversos estudos têm revelado a significância patológica dos TNTs em diversos modelos de doenças, como doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais 6,7,8.
As heterogeneidades estruturais dos TNTs têm sido demonstradas por diversos estudos em diversos sistemas celulares9. As diferenças são baseadas na composição do citoesqueleto, no mecanismo de formação e nos tipos de carga transferidos10. Primeiramente, considera-se que a continuidade da membrana aberta e positiva para F-actina que paira entre duas células vizinhas e transfere organelas consiste em TNTs11. No entanto, a falta de clareza ou diversidade observada na formação de TNTs aumenta a dificuldade no desenvolvimento de marcadores específicos de TNT. Assim, é difícil identificar estruturas de TNT por métodos convencionais de detecção e distinguir nanotubos de membrana em termos de saliências abertas e fechadas12. No entanto, a característica dos TNTs pairarem como saliências de membrana de actina F entre duas células é relativamente mais fácil e mais viável de identificar usando técnicas de imagem convencionais. Outras saliências celulares à base de actina, como filópodes e filópodes dorsais, não podem pairar entre duas células distantes, particularmente quando as células são fixas. É importante ressaltar que neurites em desenvolvimento fechadas, eletricamente acoplados e são frequentemente denominados estruturas semelhantes ao TNT13.
Sabe-se que a F-actina desempenha um papel importante na formação de TNT, e vários estudos têm demonstrado que o inibidor de F-actina citocalasina D inibe a formação de TNTs14,15. Em contraste, os inibidores dos microtúbulos não têm qualquer efeito sobre a formação de TNT16. Nas últimas 2 décadas, houve vários relatos sobre o papel significativo que os TNTs desempenham na disseminação da patologia e da resistência e terapia tumoral17. Portanto, há uma demanda interminável por melhores técnicas para caracterização do TNT.
A falta de marcadores específicos de TNTs e a diversidade na morfologia e composição citoesquelética dificultam o desenvolvimento de um método único de caracterização. Alguns estudos têm utilizado técnicas automatizadas de detecção de imagens e quantificação de TNT18,19. No entanto, existem várias vantagens do atual método de análise manual de volume 3D sobre a análise automática de imagens para a detecção e quantificação de TNTs. Muitas vezes, os olhos humanos treinados podem detectar essas nanoestruturas pairando mais facilmente do que um método automatizado de detecção de imagem. Além disso, os métodos de detecção automática podem ser difíceis de implementar em laboratórios sem experiência em algoritmos. O presente método poderia ser amplamente adotado pelos pesquisadores devido à sua precisão e reprodutibilidade.
Em um estudo recente, mostramos que a oAβ promove a biogênese de TNTs em células neuronais por meio de um mecanismo de endocitose mediado por PAK1, dependente deactina12. TNTs induzidos por oAβ também expressam PAK1 ativado (ou fosfo-PAK1). Desenvolvemos um método de reconstrução de imagem de visão de volume 3D para distinguir TNTs imunocorados por oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. β-III tubulina positiva, neurites em desenvolvimento muitas vezes se assemelham a estruturas flutuantes semelhantes a TNT20. Assim, distinguimos ainda mais os TNTs à base de F-actina dos neurites positivos para tubulina β-III e de outras saliências semelhantes ao TNT. Imagens de visualização de volume 3D têm sido usadas para identificar TNTs com base em suas características de pairar sobre o substrato e permanecer conectado entre duas células vizinhas. Este trabalho descreve a identificação e detecção de condutos de membrana contendo actina ou TNTs usando imagens confocais z-stack e, finalmente, quantificação manual das estruturas identificadas a partir de imagens de reconstrução de visualização de volume 3D. O método apresentado não pode distinguir TNTs próprios abertos de estruturas semelhantes a TNT fechadas; este método ajuda a identificar TNTs em cultura de células 2D in vitro em um substrato plano. No entanto, o método é fácil de implementar e reproduzir e pode ser amplamente utilizado para a quantificação precisa de apenas TNTs à base de actina e para distingui-los de neurites e estruturas β-tubulina positivas semelhantes a TNT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Descobertas recentes revelaram que as células realizam transferência intercelular direta, de longo alcance, através de conduítes de membrana de actina em nanoescala, ou seja, "nanotubos de tunelamento" (TNTs). Os TNTs são definidos como extensões de membrana abertas e circundadas por bicamadas lipídicas que medeiam a continuidade entre células vizinhas de diâmetros que variam entre 50 nm e 1 μm. Os TNTs foram demonstrados inicialmente em células neuronais, mas estudos sucessivos revelaram a existência de TNTs em vários tipos celulares e doenças, como doenças neurodegenerativas, infecções virais e câncer. Vários estudos se referiram a nanoestruturas de membrana fechadas e eletricamente acopladas entre células vizinhas como TNTs ou estruturas semelhantes a TNT.
A elucidação da ultraestrutura em termos de continuidade da membrana no desfecho é tecnicamente desafiadora. Além disso, estudos sobre comunicação célula-célula são desafiadores em termos de caracterização de TNTs usando métodos convencionais devido à falta de marcadores específicos. Os TNTs são definidos principalmente como saliências de membrana abertas à base de F-actina. No entanto, uma grande limitação é que a F-actina está presente em todos os tipos de saliências, tornando desafiador diferenciar TNTs de outras saliências. Uma das características notáveis dos TNTs à base de actina F é que essas estruturas pairam entre duas células sem tocar o substrato. Portanto, TNTs distintos corados com F-actina podem ser convenientemente distinguidos de outras saliências, como filópodes e neurites, com base em seu pairar entre as células.
Recentemente, mostramos que a internalização da amilóide-βoligomérica 1-42 (oAβ) via endocitose dependente de actina estimula a quinase-1 ativada por p21 ativada (PAK1), que medeia a formação de TNTs contendo F-actina coexpressos com fosfo-PAK1 entre células neuronais SH-SY5Y. Este protocolo descreve um método de análise de volume 3D para identificar e caracterizar TNTs a partir das imagens capturadas de z-stack de protuberâncias de membrana imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 em células neuronais tratadas com oAβ. Além disso, os TNTs distinguem-se do desenvolvimento de neurites e excrescências neuronais com base em condutos de membrana imunocorados de tubulina F-actina e β-III.

Aqui, identificamos e caracterizamos TNTs induzidos por oAβ em células neuronais SH-SY5Y através da construção de visualizações de volume 3D a partir de imagens confocais z-stack (Figura 1). As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1. Imagens confocais de z-stack de células imunocoradas foram analisadas para identificar TNTs (Figura 2). Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas TNT coradas com F...

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Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são principalmente nanotubos de membrana de actina F abertos que conectam células vizinhas, facilitando a comunicação intercelular. A característica notável que distingue os TNTs de outras saliências celulares é a natureza flutuante dos nanotubos entre as células. Aqui, caracterizamos os TNTs construindo uma visão de volume 3D de imagens confocais z-stack.

Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

A falta de marcadores específicos de nanotubos de tunelamento restringe o progresso no campo e há uma demanda crescente por um método para identificar, caracterizar e quantificar nanotubos de tunelamento. Os métodos de detecção automática são difíceis de implementar sem a experiência para desenvolver um algoritmo e / ou alterar o algoritmo existente, mas nosso método manual é fácil de implementar com melhor precisão. A transferência intercelular de longo alcance através de nanotubos de tunelamento é implementada de várias maneiras em vários modelos de doenças, incluindo patologia neurodegenerativa, disseminação viral e câncer.Assim, estudos sobre nanotubos de tunelamento para entender seu papel na patogênese são importantes. É possível que os nanotubos de tunelamento se quebrem durante o processo de coloração. Evite usar folhas de cobertura e montagem nas lâminas, usando pratos de imagem de fundo de vidro.O protocolo de fixação modificado ajuda a manter os nanotubos de tunelamento intactos. Demonstrando o procedimento estará Deepak KV, um estudante de doutorado do laboratório de Sangeeta NAF. Para começar, lave as células de controle e oligoméricas tratadas com A-beta duas vezes com PBS por dois minutos antes da fixação.Preparar a solução fixadora de Karnovsky usando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato molar a 0,1 de pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky por 45 minutos à temperatura ambiente. Preparar o tampão de incubação dissolvendo 0,1 grama de saponina em cinco mililitros de FBS e diluído adicionando 95 mililitros de PBS.Em seguida, lave as células fixas duas vezes usando tampão de incubação por dois minutos. Após a fixação, adicione o primeiro anticorpo contra a fosfo-PAK1, adicione uma diluição de um a 250 no tampão de incubação e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara escura e úmida. No dia seguinte, após 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com o tampão de incubação por dois minutos.Em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 e à Faloidina 555. Incubar as células na câmara escura e húmida durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células duas vezes com tampão de incubação por dois minutos.Coloração do núcleo adicionando DAPI em uma diluição de um a 2000 e incubar por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 miligramas de DABCO em 90% de glicerol e 10% PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando ácido clorídrico diluído de grau espectrofotométrico e mantenha a solução em um balancim para mistura.Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos uma a duas horas e prossiga diretamente para realizar imagens confocais. Para identificar nanotubos de tunelamento, capture imagens de pilha Z de células imunocoradas usando um microscópio confocal de varredura a laser, primeiro selecionando os canais e clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas track one, track two e track three no software confocal.Clique na opção TPMT abaixo da janela de faixa um para obter as imagens de contraste de interferência diferencial com canais de fluorescência. Selecione a guia Aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em Live Scan para focar as células na parte inferior do prato.Selecione essa imagem focada como a primeira pilha e, em seguida, foque para cima para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia Ótimo para corrigir o tamanho da etapa das pilhas, que determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células. Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nanômetros, 488 nanômetros e 561 nanômetros e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 microssegundo.Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular. Abra as imagens confocais salvas no formato de dados czi no software Fiji para análise. Selecione a opção Hyperstack para ver cada Z-stack e canal da imagem.Role o canal e as barras de rolagem Z-stack para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse. Em seguida, selecione o canal manchado de actina F primeiro rolando a barra de canais e role manualmente as pilhas Z para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células que são visíveis nas partes inferiores das pilhas Z e estão próximas à superfície do prato de imagem com Z igual a dois como neurites.Identifique os nanotubos de tunelamento, a célula de pairar positiva para os condutos de célula positiva F, rolando as pilhas Z em direção ao topo de Z igual a quatro. Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas Z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas Z em direção ao topo em Z igual a seis. Identifique nanotubos de tunelamento positivos para fosfo-PAK1 de forma semelhante aos nanotubos de tunelamento positivos para F-actina, analisando a natureza flutuante dos conduítes das pilhas Z.Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure nanotubos de tunelamento corados fosfo-PAK1 em Z igual a quatro e em Z igual a seis. Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas de nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células. Além disso, mescle os canais F-actina e fosfo-PAK1 para verificar se os nanotubos de tunelamento identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1.Para quantificar os nanotubos de tunelamento, conte o número total de células e os nanotubos de tunelamento identificados manualmente e represente os números como porcentagens. Para distinguir nanotubos de tunelamento positivo de tubulina F e beta III, como conduítes pairando de imagens de pilha Z, mescle os canais de tubulina F-actina e beta III e, em seguida, analise as pilhas Z das imagens mescladas. Procure nanotubos de tunelamento exclusivamente corados com actina que sejam fracamente visíveis em Z igual a três e proeminentes em Z igual a seis e Z igual a nove.Da mesma forma, identifique F-actina e beta III tubulina. nanotubos de tunelamento duplo-positivos como conduítes pairando em Z igual a seis e Z igual a nove. Identifique outras saliências não pairantes coradas de F-actina e beta III das partes inferiores das pilhas Z.Meça o diâmetro dos nanotubos de tunelamento usando a ferramenta Line em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar e, em seguida, defina a escala para que a distância em pixels seja definida automaticamente a partir das imagens czi. Meça os diâmetros dos nanotubos de tunelamento no plano XY.Usando o plugin Volume Viewer em Fiji, que permite o refatiamento 3D e a visualização 3D habilitada para limite, divida as imagens Z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens de pilha Z de canal único para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois nanotubos ou neurites de tunelamento de cada vez. Fixe um único nanotubo de tunelamento ou neurito no plano XY e marque as seções transversais de acesso XZ e YZ.Observe os neurites na parte inferior do plano XZ, nos planos XZ e YZ, e os nanotubos de tunelamento nas pilhas Z superiores. Selecione os nanotubos ou neuritos de tunelamento individuais para reconstruir a visualização do volume 3D no plano XZ. Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano Z e os nanotubos de tunelamento aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano Z inferior.Imagens confocais de Pilha Z de células imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 foram analisadas para identificar nanotubos de tunelamento. Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas dos nanotubos de tunelamento coradas com F-actina e fosfo-PAK1 eram condutos de membrana entre as células. As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e beta III tubulina e os condutos de membrana duplamente positivos de nanotubos de tunelamento e de encapsulamento de nanotubos F-actina e beta III tubulina foram distinguidos de apenas nanotubos de tunelamento positivos para F-actina.Os nanotubos de tunelamento co-expressos com fosfo-PAK1 e F-actina foram distinguidos das saliências celulares de outros neuritos através da construção de imagens de visualização de volume 3D com base em sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato. O uso de agente fixador direito é importante, pois a fixação imperfeita da amostra pode levar à rápida degradação proteolítica das proteínas-alvo e a uma redução na imunorreatividade específica.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Biologia

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

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Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

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Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

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Volume de segmentação e análise de materiais biológicos, usando a bancada de trabalho de SuRVoS (região super Volume segmentação)

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