Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V и A.R благодарят Академию высшего образования Манипал за стипендию TMA Pai. Мы благодарим Совет по научным и инженерным исследованиям Индии за SERB-SRG (#SRG/2021/001315), а также Индийский совет медицинских исследований Индии (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) и Очный фонд Академии высшего образования Манипал, Манипал, Индия. Мы благодарим конфокальный центр JNCASR (Центр перспективных научных исследований Джавахарлала Неру, Индия) и Б. Суму за конфокальную микроскопию в JNCASR.

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки SH-SY5Y, культивируемые в средах DMEM/F-12, дифференцировали 10 мкМ ретиноевой кислоты в течение 7 дней и обрабатывали 1 мкМ oAβ олигомерами в течение 2 ч при 37 °C (5% CO2). После лечения клетки фиксировали фиксирующим раствором Карновского и двойным иммуноокрашиванием фосфо-PA...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Несколько исследователей в течение последних 2 десятилетий пытались понять и охарактеризовать структуру TNT18. Отсутствие специфических маркеров препятствует прогрессу, и существует растущий спрос на удобный, стандартизированный метод, который можно использовать для иден...

Туннельные нанотрубки (ТНТ) основаны на F-актинах, в первую очередь на открытых мембранных каналах и играют жизненно важную роль в межклеточном переносе груза и органелл1. Уникальной характеристикой ТНТ является то, что они соединяют соседние клетки без какого-либо контакта с субстратом; они имеют длину более 10-300 мкм, а их диаметр колеблется от 50 нм до 1 мкм 2,3. ТНТ являются переходными структурами, и их срок службы длится от нескольких минут до нескольких часов. ТНТ были впервые продемонстрированы в нейронных клетках PC121; позже многочисленные исследования показали их существование в нескольких типах клеток in vitro и in vivo 4,5. Несколько исследований выявили патологическое значение ТНТ в различных моделях заболеваний, таких как нейродегенеративные заболевания, рак и вирусные инфекции 6,7,8.
Структурные неоднородности ТНТ были продемонстрированы несколькими исследованиями в различных клеточных системах9. Различия основаны на составе цитоскелета, механизме образования и10 передаваемых типах грузов. Прежде всего, открытая, F-актин-положительная мембранная непрерывность, которая парит между двумя соседними клетками и переносит органеллы, считается состоящей из TNT11. Однако отсутствие ясности или разнообразия, наблюдаемое при формировании ТНТ, усугубляет трудности в разработке маркеров, специфичных для тротила. Таким образом, трудно идентифицировать тротиловые структуры обычными методами обнаружения и различать мембранные нанотрубки с точки зрения открытых и закрытых выступов12. Тем не менее, характеристику ТНТ для парения в виде протрузий F-актиновой мембраны между двумя клетками относительно легче и более осуществимо идентифицировать с помощью обычных методов визуализации. Другие клеточные протрузии на основе актина, такие как филоподия и дорсальная филоподия, не могут парить между двумя отдаленными клетками, особенно когда клетки фиксированы. Следует отметить, что закрытые, электрически связанные, развивающиеся нейриты часто называют тротилоподобными структурами13.
Известно, что F-актин играет важную роль в образовании тротила, и несколько исследований показали, что ингибитор F-актина цитохалазин D ингибирует образование ТНТ14,15. Напротив, ингибиторы микротрубочек не оказывают никакого влияния на образование тротила16. За последние 2 десятилетия было несколько сообщений о значительной роли, которую ТНТ играют в распространении патологии и резистентности опухолей и терапии17. Поэтому существует бесконечный спрос на более совершенные методы характеристики тротила.
Отсутствие специфических маркеров ТНТ и разнообразие морфологии и состава цитоскелета затрудняют разработку уникального метода характеризации. В некоторых исследованиях использовались автоматизированные методы обнаружения изображений и количественной оценки тротила18,19. Тем не менее, есть несколько преимуществ нынешнего метода ручного анализа объема 3D перед автоматическим анализом изображений для обнаружения и количественной оценки ТНТ. Часто обученные человеческие глаза могут обнаружить эти парящие наноструктуры легче, чем автоматизированный метод обнаружения изображений. Кроме того, автоматические методы обнаружения может быть трудно реализовать в лабораториях, не имеющих опыта работы с алгоритмами. Настоящий метод может быть широко принят исследователями из-за его точности и воспроизводимости.
В недавнем исследовании мы показали, что oAβ способствует биогенезу ТНТ в нейронных клетках через PAK1-опосредованный, актин-зависимый, эндоцитозный механизм12. oAβ-индуцированные ТНТ также экспрессируют активированный PAK1 (или фосфо-PAK1). Мы разработали метод реконструкции изображения 3D-объемного вида для различения oAβ-индуцированных, F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных TNT. β-III тубулин-положительные, развивающиеся нейриты часто напоминают ТНТ-подобные парящие структуры20. Следовательно, мы дополнительно различали ТНТ на основе F-актина от β-III тубулин-положительных нейритов и других ТНТ-подобных протрузий. 3D-изображения с объемным видом были использованы для идентификации ТНТ на основе их характеристик зависания над субстратом и поддержания связи между двумя соседними ячейками. В данной работе описывается идентификация и обнаружение актинсодержащих мембранных трубопроводов или ТНТ с использованием конфокальных изображений z-стека и, наконец, ручная количественная оценка идентифицированных структур из 3D-изображений реконструкции объемного вида. Представленный метод не может отличить открытые собственные ТНТ от закрытых тротилоподобных структур; этот метод помогает идентифицировать ТНТ в 2D-культуре клеток in vitro на плоском субстрате. Однако метод прост в реализации и воспроизведении и может широко использоваться для точной количественной оценки только ТНТ на основе актина и для их отличия от нейритов и β-тубулин-положительных тротилоподобных структур.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Недавние открытия показали, что клетки выполняют прямой, дальний, межклеточный перенос через наноразмерные, актин-мембранные каналы, а именно «туннельные нанотрубки» (TNT). ТНТ определяются как открытые, липидные двухслойные мембранные расширения, которые опосредуют непрерывность между соседними клетками диаметром от 50 нм до 1 мкм. ТНТ были продемонстрированы первоначально в нейрональных клетках, но последовательные исследования выявили существование ТНТ в нескольких типах клеток и заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания, вирусные инфекции и рак. В нескольких исследованиях упоминались близкие, электрически связанные мембранные наноструктуры между соседними клетками как TNT или TNT-подобные структуры.
Выяснение ультраструктуры с точки зрения непрерывности мембраны в конечной точке является технически сложной задачей. Кроме того, исследования клеточно-клеточной коммуникации являются сложными с точки зрения характеристики ТНТ с использованием обычных методов из-за отсутствия специфических маркеров. ТНТ в первую очередь определяются как открытые мембранные протрузии на основе F-актина. Однако одним из основных ограничений является то, что F-актин присутствует во всех типах выступов, что затрудняет дифференциацию ТНТ от других выступов. Одной из примечательных характеристик ТНТ на основе F-актина является то, что эти структуры парят между двумя клетками, не касаясь субстрата. Таким образом, различные F-актин-окрашенные ТНТ можно удобно отличить от других выступов, таких как филоподии и нейриты, на основе их парения между клетками.
Недавно мы показали, что интернализация олигомерного амилоид-β1-42 (oAβ) через актин-зависимый эндоцитоз стимулирует активированную р21-активированную киназу-1 (PAK1), которая опосредует образование F-актин-содержащих ТНТ, совместно экспрессируемых с фосфо-PAK1 между нейрональными клетками SH-SY5Y. Этот протокол описывает метод 3D-объемного анализа для идентификации и характеристики ТНТ по захваченным z-стековым изображениям F-актин- и фосфо-PAK1-иммуноокрашенных мембранных протрузий в нейронных клетках, обработанных oAβ. Кроме того, ТНТ отличаются от развивающихся нейритов и нейрональных выростов на основе F-актин- и β-III тубулин-иммуноокрашенных мембранных каналов.

Здесь мы идентифицируем и характеризуем oAβ-индуцированные TNT в нейронных клетках SH-SY5Y путем построения 3D-объемных представлений из конфокальных изображений z-стека (рисунок 1). Клетки были дважды иммуноизолированы F-актином и фосфо-PAK1. Конфокальные изображения z-стека им?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Туннельные нанотрубки (TNT) представляют собой в основном открытые F-актиновые мембранные нанотрубки, которые соединяют соседние клетки, облегчая межклеточную связь. Примечательной характеристикой, которая отличает ТНТ от других клеточных выступов, является парящая природа нанотрубок между клетками. Здесь мы характеризуем TNT, создавая 3D-объемное представление конфокальных изображений z-стека.

Обнаружение и количественная оценка туннельных нанотрубок с использованием изображений 3D Volume View

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Отсутствие специфических маркеров туннельных нанотрубок ограничивает прогресс в этой области, и существует растущий спрос на метод идентификации, характеристики и количественной оценки туннельных нанотрубок. Автоматические методы обнаружения трудно реализовать без опыта разработки алгоритма и / или изменения существующего алгоритма, но наш ручной метод легко реализовать с большей точностью. Дальний межклеточный перенос через туннельные нанотрубки реализуется несколькими способами в различных моделях заболеваний, включая нейродегенеративную патологию, распространение вируса и рак.Таким образом, исследования на туннельных нанотрубках, чтобы понять их роль в патогенезе, важны. Возможно, туннельные нанотрубки могут сломаться во время процесса окрашивания. Избегайте использования скольжения крышки и крепления на слайдах, используя вместо этого стеклянные нижние тарелки для визуализации.Модифицированный протокол фиксации помогает сохранить туннельные нанотрубки нетронутыми. Продемонстрировать процедуру будет Дипак КВ, аспирант из лаборатории Sangeeta NAF. Для начала промыть контрольные и олигомерные клетки, обработанные А-бета, дважды PBS в течение двух минут перед фиксацией.Готовят фиксаторный раствор Карновского, используя 2%-ной формалиновый фиксатор и 2,5%-ный глутаральный альдегид, растворенный в 0,1-молярно-фосфатном буфере рН 7,2. Затем зафиксируйте клетки в тарелке для визуализации, добавив фиксирующий раствор Карновского в течение 45 минут при комнатной температуре. Готовят инкубационный буфер, растворяя 0,1 грамма сапонина в пяти миллилитрах FBS и разбавляя добавлением 95 миллилитров PBS.Затем дважды промыть неподвижные клетки с помощью инкубационного буфера в течение двух минут. После фиксации добавляют первое антитело против фосфо-ПАК1, добавляют разведение от одного до 250 в инкубационный буфер и инкубируют на ночь при четырех градусах Цельсия в темной, влажной камере. На следующий день после 24 часов инкубации промыть клетки дважды инкубационным буфером в течение двух минут.Затем добавляют вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488 и фаллоидином 555. Инкубируют клетки в темной, влажной камере в течение 1,5 часов при комнатной температуре. После инкубации дважды промыть клетки инкубационным буфером в течение двух минут.Окрашивают ядро, добавляя DAPI в разведении от одного до 2000 и инкубируют в течение пяти-10 минут при комнатной температуре в темноте. Приготовьте монтажную среду DABCO, используя 25 миллиграммов DABCO в 90% глицерина и 10% PBS. Чтобы раствориться должным образом, отрегулируйте рН до 8,6 с помощью спектрофотометрического сорта, разбавьте соляную кислоту и держите раствор на коромысле для перемешивания.В качестве антиотбеливающего агента добавьте монтажную среду DABCO непосредственно на тарелку для визуализации, содержащую крышку снизу внизу. Подождите, по крайней мере, один-два часа и непосредственно приступайте к выполнению конфокальной визуализации. Чтобы идентифицировать туннельные нанотрубки, захватывайте Z-образные изображения иммуноокрашенных клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, сначала выбирая каналы и последовательно щелкая необходимые лазеры в окнах трек один, трек два и трек три в конфокальном программном обеспечении.Щелкните опцию TPMT под окном трека один, чтобы получить дифференциальные интерференционные контрастные изображения с флуоресцентными каналами. Выберите вкладку Приобретение программного обеспечения, щелкните вкладку Z-stack и дождитесь открытия окна. Затем нажмите кнопку Live Scan, чтобы сфокусировать ячейки в нижней части тарелки.Выделите это сфокусированное изображение в качестве первого стека, а затем сфокусируйте вверх, чтобы увидеть самую верхнюю часть ячейки, и выберите ее в качестве последней стека. Остановите сканирование в реальном времени и щелкните число рядом с вкладкой Оптимальный, чтобы зафиксировать размер шага стеков, который определяет количество фрагментов и интервалы на основе толщины ячеек. Делайте последовательные изображения трех каналов DAPI, FITC и TRITC с помощью 405-нанометровых, 488-нанометровых и 561-нанометровых лазеров и делайте снимки со временем ожидания пикселей 1,02 микросекунды.Захват изображений в DIC-канале с флуоресцентными каналами для наблюдения за границей ячейки. Откройте для анализа конфокальные изображения, сохраненные в формате данных czi в программном обеспечении Фиджи. Выберите параметр Hyperstack, чтобы просмотреть каждый Z-стек и канал изображения.Прокрутите канал и полосы прокрутки Z-стека, чтобы выбрать точный стек конкретного интересующего канала. Затем сначала выберите окрашенный канал F-actin, прокрутив панель канала и вручную прокрутив Z-стеки, чтобы увидеть каждый стек по одному. Идентифицируйте окрашенные F-актином структуры, которые, по-видимому, соединяют клетки, которые видны в нижних частях Z-стеков и находятся близко к поверхности тарелки для визуализации с Z, равным двум в качестве нейритов.Идентифицируйте туннельные нанотрубки, F-актин положительно парит от ячейки к клеточным каналам, прокручивая Z-стеки к вершине от Z равных четырем. Ищите нейриты вблизи нижних частей Z-стеков к поверхности и наблюдайте, что они начинают исчезать с прокруткой Z-стеков к вершине в Z, равной шести. Идентифицировать фосфо-PAK1 позитивные туннельные нанотрубки аналогично F-актиновым положительным туннельным нанотрубкам путем анализа парящей природы трубопроводов из Z-стеков.Поскольку окрашивание фосфо-PAK1 слабее, чем окрашивание F-актином, ищите фосфо-PAK1 окрашенные туннельные нанотрубки при Z, равные четырем, и при Z, равные шести. Кроме того, понаблюдайте за изображениями ДВС-синдрома, чтобы убедиться, что окрашенные F-актином и фосфо-ПАК1 туннельные структуры нанотрубок являются мембранными проводниками между клетками. Кроме того, объедините каналы F-актина и фосфо-ПАК1, чтобы убедиться, что идентифицированные туннельные нанотрубки являются структурами совместного окрашивания F-актина и фосфо-ПАК1.Чтобы количественно оценить туннельные нанотрубки, подсчитайте общее количество клеток и идентифицированные туннельные нанотрубки вручную и представьте числа в процентах. Чтобы отличить F-актин и бета-III тубулин с положительным туннелированием нанотрубок, таких как парящие каналы, от изображений Z-стека, объедините каналы F-актина и бета-III тубулина, а затем проанализируйте Z-стеки объединенных изображений. Ищите исключительно окрашенные F-актином туннельные нанотрубки, которые слабо видны при Z, равном трем, и заметные при Z, равные шести, и Z, равные девяти.Аналогично идентифицируют F-актин и бета-III тубулин. двойные положительные туннельные нанотрубки, такие как парящие каналы при Z, равные шести и Z равные девяти. Идентифицировать другие F-актин и бета-III тубулин окрашенные ненависающие выступы из нижних частей Z-стеков.Измерьте диаметр туннельных нанотрубок с помощью инструмента Line на Фиджи. Проверьте масштаб измерения, щелкнув Анализ, а затем установите масштаб, чтобы расстояние в пикселях автоматически устанавливалось из изображений czi. Измерьте диаметры туннельных нанотрубок в плоскости XY.Используя плагин Volume Viewer на Фиджи, который позволяет 3D-перенарезку и 3D-визуализацию с пороговой поддержкой, разделите изображения Z-стека на отдельные каналы. Затем обрежьте одноканальные изображения Z-стека, чтобы использовать 3D-режим реконструкции, чтобы выделить одну или две туннельные нанотрубки или нейриты за раз. Закрепите одну туннельную нанотрубку или нейрит в плоскости XY и отметьте поперечные сечения доступа XZ и YZ.Наблюдайте за нейритами в нижней части плоскости XZ, в плоскостях XZ и YZ, и туннельными нанотрубками в верхних Z-стеках. Выберите отдельные туннельные нанотрубки или нейриты, чтобы реконструировать 3D-вид объема в плоскости XZ. В 3D-реконструкции наблюдайте нейриты в нижней части Z-плоскости и туннельные нанотрубки, появляющиеся в виде парящих структур, соединяющих две клетки, не касаясь нижней Z-плоскости.Конфокальные изображения Z-стека иммуноокрашенных клеток с F-актином и фосфо-PAK1 были проанализированы для идентификации туннельных нанотрубок. Кроме того, изображения DIC были проанализированы, чтобы убедиться, что F-актин и фосфо-PAK1 окрашенные туннельные структуры нанотрубок были мембранными проводниками между клетками. Клетки были дважды иммуноокрашены F-актином и бета-III тубулином, а туннельные нанотрубовидные F-актин и туннельные нанотрубкообразные F-актин и бета-III тубулин двойные положительные мембранные каналы отличались только от F-актин-положительных туннельных нанотрубок.Туннельные нанотрубки, совместно экспрессируемые с фосфо-ПАК1 и F-актином, отличались от протрузий клеток других нейритов путем построения 3D-изображений объемного вида на основе их характеристики зависания между двумя клетками без прикосновения к субстрату. Использование правильного фиксатора важно, так как несовершенная фиксация образца может привести к быстрой протеолитической деградации белков-мишеней и снижению специфической иммунореактивности.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Определение концентрации нуклеиновых кислот и белков Использование Micro объемом Био-спецификации Nano Спектрофотометр

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Сердечная давления Объем Анализ обратной связи с использованием проводимости Катетеры у мышей

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Колометрической Обнаружение бактерий с помощью лакмусовой тест

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Автоматизированная Количественное и анализ процедур Cell подсчет с использованием ImageJ плагинов

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Потянув нанотрубок мембраны из гигантских однослойных везикул

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Объем сегментации и анализ биологических материалов с помощью Workbench SuRVoS (супер-регионе объем сегментация)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Количественная оценка клеточных плотностей и антигенных свойств с использованием магнитной левитации

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Количественная оценка межбактериальной конкуренции с использованием одноклеточной флуоресцентной визуализации

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...