Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V och A.R tackar Manipal Academy of Higher Education för TMA Pai-stipendiet. Vi tackar Science and Engineering Research Board of India för SERB-SRG (#SRG/2021/001315), liksom Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) och Intramural fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Vi tackar JNCASR:s (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indien) konfokala anläggning och B. Suma för den konfokalmikroskopi i JNCASR.

OBS: SH-SY5Y-celler odlade i DMEM / F-12-media differentierades med 10 μM retinsyra i 7 dagar och behandlades med 1 μM oAβ-oligomerer i 2 timmar vid 37 ° C (5%CO2). Efter behandling fixerades cellerna med Karnovskys fixativa lösning och dubbelimmunbehandlades med fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antikropp och F-aktinbindande falloidin. Senare togs konfokala z-stack-bilder med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop. TNT: erna kvantifierades genom manuell räkning och skilde sig från andra neurit...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Flera forskare under de senaste 2 decennierna har försökt förstå och karakterisera strukturen hos TNT18. Bristen på specifika markörer hindrar framsteg, och det finns en ökande efterfrågan på en bekväm, standardiserad metod som kan användas för att identifiera, karakterisera och kvantifiera TNT: er. TNT definieras som F-aktinbaserade membranledningar som svävar mellan två celler. Studier har visat att β-tubulinpositiva, nära-slutna, utvecklande neuriter svävar mellan två avlägsn...

Tunnelnanorör (TNT) är F-aktinbaserade, främst öppna membranledningar och spelar en viktig roll i den intercellulära överföringen av last och organeller1. Det unika kännetecknet för TNT är att de förbinder angränsande celler utan kontakt med substratet; De är över 10–300 μm långa och deras diametrar varierar mellan 50 nm och 1 μm 2,3. TNT är övergående strukturer, och deras livslängd varar mellan några minuter till flera timmar. TNT demonstrerades först i PC12 neuronala celler1; Senare visade många studier att de fanns i flera celltyper in vitro och in vivo 4,5. Flera studier har avslöjat den patologiska betydelsen av TNT i olika sjukdomsmodeller, såsom neurodegenerativa sjukdomar, cancer och virusinfektioner 6,7,8.
De strukturella heterogeniteterna hos TNT har visats av flera studier i olika cellulära system9. Skillnaderna är baserade på cytoskelettkomposition, bildningsmekanismen och de överförda lasttyperna10. I första hand anses den öppna, F-aktinpositiva membrankontinuiteten som svävar mellan två angränsande celler och överför organeller bestå av TNT11. Bristen på tydlighet eller mångfald som observerats vid bildandet av TNT ökar emellertid svårigheten att utveckla TNT-specifika markörer. Således är det svårt att identifiera TNT-strukturer med konventionella detektionsmetoder och skilja membrannanorör i termer av öppna och nära utsprång12. Karaktäristiken hos TNT att sväva som F-aktinmembranutsprång mellan två celler är dock relativt lättare och mer genomförbar att identifiera med konventionella bildtekniker. Andra aktinbaserade cellulära utsprång såsom filopodier och dorsala filopodier kan inte sväva mellan två avlägsna celler, särskilt när cellerna är fixerade. Observera att nära, elektriskt kopplade, utvecklande neuriter ofta kallas TNT-liknande strukturer13.
Det är känt att F-aktin spelar en viktig roll vid TNT-bildning, och flera studier har visat att F-aktinhämmaren cytochalasin D hämmar bildandet av TNT14,15. Däremot har hämmare av mikrotubuli ingen effekt på TNT-bildning16. De senaste 2 decennierna har sett flera rapporter om den betydande roll som TNT spelar i spridningen av patologi och tumörresistens och terapi17. Därför finns det en oändlig efterfrågan på bättre tekniker för TNT-karakterisering.
Bristen på specifika markörer för TNT och mångfalden i morfologi och cytoskeletal komposition gör det svårt att utveckla en unik metod för karakterisering. Vissa studier har använt automatiserad bilddetektering och TNT-kvantifieringstekniker18,19. Det finns dock flera fördelar med den nuvarande manuella 3D-volymanalysmetoden jämfört med automatisk bildanalys för detektering och kvantifiering av TNT: er. Ofta kan tränade mänskliga ögon lättare upptäcka dessa svävande nanostrukturer än en automatiserad bilddetekteringsmetod. Dessutom kan automatiska detektionsmetoder vara svåra att implementera i laboratorier som saknar algoritmexpertis. Den nuvarande metoden kan i stor utsträckning antas av forskare på grund av dess precision och reproducerbarhet.
I en nyligen genomförd studie visade vi att oAβ främjar biogenesen av TNT i neuronala celler via en PAK1-medierad, aktinberoende, endocytosmekanism12. oAβ-inducerade TNT uttrycker också aktiverad PAK1 (eller fosfo-PAK1). Vi utvecklade en 3D-volymvybildrekonstruktionsmetod för att skilja oAβ-inducerade, F-aktin- och fosfo-PAK1-immunfärgade TNT: er. β-III tubulinpositiva, utvecklande neuriter liknar ofta TNT-liknande svävande strukturer20. Därför skilde vi ytterligare F-aktinbaserade TNT från β-III tubulinpositiva neuriter och andra TNT-liknande utsprång. 3D-volymvisningsbilder har använts för att identifiera TNT på grundval av deras egenskaper att sväva över underlaget och hålla kontakten mellan två angränsande celler. Detta dokument beskriver identifiering och detektion av aktininnehållande membranledningar eller TNT med hjälp av konfokala z-stackbilder och slutligen manuell kvantifiering av de identifierade strukturerna från rekonstruktionsbilder av 3D-volymvyer. Den presenterade metoden kan inte skilja öppna korrekta TNT från nära TNT-liknande strukturer; denna metod hjälper till att identifiera TNT i in vitro 2D-cellodling på ett platt underlag. Metoden är dock lätt att implementera och reproducera och kan användas i stor utsträckning för exakt kvantifiering av endast aktinbaserade TNT och för att skilja dem från neuriter och β-tubulinpositiva TNT-liknande strukturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Nya upptäckter har avslöjat att celler utför direkt, långdistans, intercellulär överföring via nano-skala, aktinmembranledningar, nämligen "tunneling nanotubes" (TNT). TNT definieras som öppna, lipid-dubbelskiktade membranförlängningar som förmedlar kontinuitet mellan angränsande celler med diametrar mellan 50 nm och 1 μm. TNT demonstrerades initialt i neuronala celler, men successiva studier har avslöjat förekomsten av TNT i flera celltyper och sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, virusinfektioner och cancer. Flera studier har hänvisat till nära, elektriskt kopplade membrannanostrukturer mellan angränsande celler som TNT eller TNT-liknande strukturer.
Belysningen av ultrastruktur när det gäller membrankontinuitet vid slutpunkten är tekniskt utmanande. Dessutom är studier om cell-cellkommunikation utmanande när det gäller karakterisering av TNT med konventionella metoder på grund av bristen på specifika markörer. TNT definieras främst som F-aktinbaserade, öppna membranutsprång. En stor begränsning är dock att F-aktin finns i alla typer av utsprång, vilket gör det utmanande att skilja TNT från andra utsprång. En av de anmärkningsvärda egenskaperna hos F-aktinbaserade TNT är att dessa strukturer svävar mellan två celler utan att röra vid underlaget. Därför kan distinkta F-aktinfärgade TNT bekvämt särskiljas från andra utsprång såsom filopodier och neuriter baserat på deras svävande mellan celler.
Vi har nyligen visat att internaliseringen av oligomera amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinberoende endocytos stimulerar aktiverat p21-aktiverat kinas-1 (PAK1), som förmedlar bildandet av F-aktininnehållande TNT samuttryckta med fosfo-PAK1 mellanSH-SY5Y neuronala celler. Detta protokoll beskriver en 3D-volymanalysmetod för att identifiera och karakterisera TNT från de tagna z-stackbilderna av F-aktin- och fosfo-PAK1-immunfärgade membranutsprång i oAβ-behandlade neuronala celler. Vidare skiljer sig TNT från att utveckla neuriter och neuronala utväxter baserade på F-aktin- och β-III tubulinimmunfärgade membranledningar.

Här identifierar och karakteriserar vi oAβ-inducerade TNT i SH-SY5Y-neuronala celler genom att konstruera 3D-volymvyer från konfokala z-stackbilder (figur 1). Cellerna dubbelimmunbehandlades med F-aktin och fosfo-PAK1. Konfokala z-stackbilder av immunfärgade celler analyserades för att identifiera TNT (figur 2). Vidare analyserades DIC-bilder för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade TNT-strukturer var membranledningar mellan celler (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tunneling nanorör (TNT) är främst öppna F-aktinmembrannanorör som förbinder angränsande celler, vilket underlättar intercellulär kommunikation. Den anmärkningsvärda egenskapen som skiljer TNT från andra cellutsprång är nanorörens svävande natur mellan celler. Här karakteriserar vi TNT genom att konstruera en 3D-volymvy av konfokala z-stackbilder.

Detektion och kvantifiering av tunnelnanorör med hjälp av 3D-volymvybilder

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Bristen på tunneling nanorör specifika markörer begränsar framsteg inom området och det finns en ökande efterfrågan på en metod för att identifiera, karakterisera och kvantifiera tunneling nanorör. Automatiska detektionsmetoder är svåra att implementera i utan expertis att utveckla en algoritm och/eller ändra den befintliga algoritmen, men vår manuella metod är enkel att implementera med bättre precision. Långväga intercellulär överföring via tunneling nanorör implementeras på flera sätt i olika sjukdomsmodeller, inklusive neurodegenerativ patologi, virusspridning och cancer.Således är studier på tunneling av nanorör för att förstå deras roll i patogenes viktiga. Det är möjligt att tunnelnanorören kan gå sönder under färgningsprocessen. Undvik att använda täckslipsar och montering på rutschkanorna, använd bildskålar i glasbotten istället.Modifierat fixeringsprotokoll hjälper till att hålla tunnelnanorör intakta. Demonstrerar proceduren kommer att vara Deepak KV, doktorand från laboratoriet i Sangeeta NAF. För att börja, tvätta de kontroll- och oligomera A-beta-behandlade cellerna två gånger med PBS i två minuter före fixering.Förbered Karnovskys fixativa lösning genom att använda 2% formalinfixativ och 2,5% glutaraldehyd upplöst i 0,1 molär fosfatbuffert med pH 7,2. Fixa sedan cellerna i bildskålen genom att tillsätta Karnovskys fixativlösning i 45 minuter vid rumstemperatur. Förbered inkubationsbufferten genom att lösa 0,1 gram saponin i fem ml FBS och späd genom tillsats av 95 ml PBS.Tvätta sedan de fasta cellerna två gånger med inkubationsbuffert i två minuter. Efter fixering, tillsätt den första antikroppen mot fosfo-PAK1, tillsätt en utspädning av en till 250 i inkubationsbufferten och inkubera över natten vid fyra grader Celsius i en mörk, fuktig kammare. Nästa dag efter 24 timmars inkubation, tvätta cellerna två gånger med inkubationsbufferten i två minuter.Lägg sedan till sekundär antikropp konjugerad till Alexa Fluor 488 och Phalloidin 555. Inkubera cellerna i den mörka, fuktiga kammaren i 1,5 timmar vid rumstemperatur. Efter inkubationen, tvätta cellerna två gånger med inkubationsbuffert i två minuter.Färga kärnan genom att tillsätta DAPI i en utspädning på en till 2000 och inkubera i fem till 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Förbered DABCO-monteringsmedium med 25 milligram DABCO i 90% glycerol och 10% PBS. För att lösa upp ordentligt, justera pH till 8,6 med hjälp av spektrofotometrisk kvalitet utspädd saltsyra och håll lösningen på en vippa för blandning.Som ett antiblekmedel lägger du till DABCO-monteringsmediet direkt på bildskålen som innehåller lockglidningen längst ner. Vänta i minst en till två timmar och fortsätt direkt för att utföra konfokal avbildning. För att identifiera tunnelnanorör, fånga Z-stackbilder av immunfärgade celler med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop genom att först välja kanalerna och klicka på önskade lasrar sekventiellt i fönstren spår ett, spår två och spår tre i konfokalprogramvaran.Klicka på alternativet TPMT under spåra ett fönster för att ta kontrastbilder med differentiell interferenskontrast med fluorescenskanaler. Välj fliken Förvärv i programvaran, klicka på fliken Z-stack och vänta tills ett fönster öppnas. Klicka sedan Live Scan för att fokusera cellerna längst ner på skålen.Välj den fokuserade bilden som den första stapeln och fokusera sedan uppåt för att se den översta delen av cellen och välj den som den sista stapeln. Stoppa direktskanning och klicka på numret bredvid fliken Optimal för att fixa stegstorleken på staplarna som bestämmer antalet segment och intervallen baserat på cellernas tjocklek. Ta sekventiella bilder av tre kanaler med DAPI, FITC och TRITC med 405 nanometer, 488 nanometer och 561 nanometerlasrar och fånga med en pixeluppehållstid på 1,02 mikrosekund.Ta bilder i DIC-kanalen med fluorescenskanaler för att observera cellgränsen. Öppna konfokalbilderna som sparats i czi-dataformat i Fiji-programvaran för analys. Välj Hyperstack-alternativet för att se varje Z-stack och kanal i bilden.Bläddra i kanal- och Z-stack-rullningslisterna för att välja den exakta stacken för en viss kanal av intresse. Välj sedan den F-aktinfärgade kanalen först genom att bläddra i kanalfältet och bläddra manuellt i Z-stackarna för att se varje stapel en efter en. Identifiera de F-aktinfärgade strukturerna som verkar ansluta celler som är synliga i de nedre delarna av Z-staplarna och ligger nära ytan på bildskålen med Z lika med två som neuriter.Identifiera tunnelnanorören, den F-aktinpositiva svävande cellen till cellledningarna genom att rulla Z-stackarna mot toppen från Z är lika med fyra. Leta efter neuriter nära de nedre delarna av Z-stackarna mot ytan och observera att de börjar försvinna med rullningen av Z-stackar mot toppen vid Z lika med sex. Identifiera fosfo-PAK1-positiva tunnelnanorör på samma sätt som F-aktinpositiva tunnelnanorör genom att analysera den svävande naturen hos ledningarna från Z-stackarna.Eftersom fosfo-PAK1-färgning är svagare än F-aktinfärgning, leta efter fosfo-PAK1-färgade tunnelnanorör vid Z lika med fyra och vid Z lika med sex. Observera vidare DIC-bilderna för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade tunnelstrukturer är membranledningar mellan celler. Slå dessutom samman F-aktin- och fosfo-PAK1-kanaler för att verifiera att de identifierade tunnelnanorören är F-aktin och fosfo-PAK1 samfärgade strukturer.För att kvantifiera tunnelnanorören, räkna de totala cellnumren och de identifierade tunnelnanorören manuellt och representera siffrorna i procent. För att skilja F-aktin och beta III tubulin positiva tunneling nanorör som svävande ledningar från Z-stack bilder, slå samman F-aktin och beta III tubulin kanaler, analysera sedan Z-stackarna i de sammanslagna bilderna. Leta efter uteslutande F-aktinfärgade tunnelnanorör som är svagt synliga vid Z lika med tre och framträdande vid Z lika med sex och Z lika med nio.På samma sätt identifiera F-aktin och beta III tubulin. dubbelpositiva tunnelnanorör som svävande ledningar vid Z lika med sex och Z lika med nio. Identifiera andra F-aktin- och beta III-tubulinfärgade icke-svävande utsprång från de nedre delarna av Z-staplarna.Mät diametern på tunnelnanorören med hjälp av linjeverktyget i Fiji. Kontrollera måttskalan genom att klicka på Analysera och ställ sedan in skalan så att avståndet i pixlar ställs in automatiskt från czi-bilderna. Mät diametrarna på tunnelnanorören vid XY-planet.Med hjälp av Volume Viewer-plugin i Fiji som tillåter 3D-skivning och tröskelaktiverad 3D-visualisering, dela Z-stack-bilderna i enskilda kanaler. Beskär sedan Z-stackbilderna med en kanal för att använda 3D-rekonstruktionsvy för att markera ett eller två tunnlande nanorör eller neuriter åt gången. Fäst ett enda tunnelnanorör eller neurit i XY-planet och markera XZ- och YZ-åtkomsttvärsnitt.Observera neuriterna längst ner på XZ-planet, i XZ- och YZ-planen och tunnelnanorören i de övre Z-staplarna. Välj de enskilda tunnelnanorören eller neuriten för att rekonstruera 3D-volymvyn i XZ-planet. I 3D-rekonstruktionen, observera neuriterna längst ner på Z-planet och tunnelnanorören som verkar som svävande strukturer som förbinder två celler utan att röra vid det nedre Z-planet.Konfokala Z-stackbilder av immunfärgade celler med F-aktin och fosfo-PAK1 analyserades för att identifiera tunnlande nanorör. Vidare analyserades DIC-bilder för att verifiera att F-aktin- och fosfo-PAK1-färgade tunnelrörsstrukturer var membranledningar mellan celler. Cellerna var dubbelimmunfärgade med F-aktin och beta III-tubulin och det tunnlande nanorörsliknande F-aktinet och de tunnlande nanorörsliknande F-aktin- och beta III-tubulin-dubbelpositiva membranledningarna skildes från endast F-aktinpositiva tunnelnanorör.De tunnlande nanorören som uttrycktes tillsammans med fosfo-PAK1 och F-aktin skildes från andra neuriters cellutsprång genom att konstruera 3D-volymvybilder baserat på deras kännetecken att sväva mellan två celler utan att röra vid underlaget. Användning av rätt fixeringsmedel är viktigt eftersom ofullkomlig fixering av provet kan leda till snabb proteolytisk nedbrytning av målproteinerna och en minskning av den specifika immunreaktiviteten.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Koncentration Fastställande av nukleinsyror och proteiner med hjälp av Micro-volymen Bio-spec Nano Spektrofotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Hjärttryck Volym Loop analys Använda Konduktans katetrar hos möss

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Kolorimetrisk detektion av bakterier med användning avgörande provet

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

Automatiserad kvantifiering och analys av cellräkning Rutiner Använda ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Dra membranet nanorör från Giant Unilamellar blåsor

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volym segmentering och analys av biologiska material använda Workbench för SuRVoS (Super region volym segmentering)

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantifiering av cellulär densitet och antigena egenskaper med hjälp av magnetisk levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantifiering av interbacterial konkurrens med hjälp av fluorescensavbildning med en cell

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...