Name: detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

D.K.V ve A.R, TMA Pai bursu için Manipal Yüksek Öğretim Akademisi'ne teşekkür eder. SERB-SRG için Hindistan Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'na (#SRG/2021/001315) ve Hindistan Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) ve Manipal Yüksek Öğretim Akademisi, Manipal, Hindistan'ın Intramural fonuna teşekkür ederiz. JNCASR'nin (Jawaharlal Nehru İleri Bilimsel Araştırma Merkezi, Hindistan) konfokal tesisine ve B. Suma'ya JNCASR'deki konfokal mikroskopi için teşekkür ederiz.

NOT: DMEM/F-12 ortamında kültürlenen SH-SY5Y hücreleri 7 gün boyunca 10 μM retinoik asit ile farklılaştırıldı ve 37 °C'de (% 5 CO2) 2 saat boyunca 1 μM oAβ oligomerleri ile muamele edildi. Tedaviden sonra, hücreler Karnovsky'nin fiksatif çözeltisi ile sabitlendi ve fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı faloidin ile çift immüno-boyandı. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak konfokal z-stack görüntüleri alındı. TNT'ler manuel sayımla ?...

<ol>
	<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Desir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy-induced+tunneling+nanotubes+mediate+intercellular+drug+efflux+in+pancreatic+cancer.">Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer.</a> Scientific Reports. 8, 9484 (2018).</li><li>Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peering+into+tunneling+nanotubes-The+path+forward.">Peering into tunneling nanotubes-The path forward.</a> The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).</li><li>Dieriks, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+transfer+through+tunneling+nanotubes+occurs+in+SH-SY5Y+cells+and+primary+brain+pericytes+from+Parkinson's+disease+patients.">&#945;-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients.</a> Scientific Reports. 7, 42984 (2017).</li><li>Chen, J., Cao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+transportation+of+enhanced+green+fluorescent+protein+in+cerebral+cortex+requires+F-actin+dependent+tunneling+nanotubes.">Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes.</a> Scientific Reports. 11, 16798 (2021).</li><li>Mittal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+by+tunneling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapeutic+applications.">Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).</li><li>Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia+cells+use+tunneling+nanotubes+to+orchestrate+their+microenvironment.">B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment.</a> Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).</li><li>Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes+as+a+novel+route+of+cell-to-cell+spread+of+herpesviruses.">Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses.</a> Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).</li><li>Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Diversity+in+morphology+and+structure.">Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).</li><li>Han, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+tunneling+nanotubes+research:+How+far+from+clinical+application.">Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).</li><li>Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunneling+nanotubes:+Reshaping+connectivity.">Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).</li><li>Dilna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta+induced+membrane+damage+instigates+tunneling+nanotube-like+conduits+by+p21-activated+kinase+dependent+actin+remodulation.">Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cellular+close-ended+tunneling+nanotubes+through+mechanical+deformation.">Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation.</a> Science Advances. 8 (13), (2022).</li><li>Bukoreshtliev, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+block+of+tunneling+nanotube+(TNT)+formation+inhibits+intercellular+organelle+transfer+between+PC12+cells.">Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells.</a> FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+tunneling+nanotubes+within+human+mesenchymal+stem+cell+spheroids.">Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).</li><li>Hanna, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Rho-GTPases+and+actin+polymerization+during+Macrophage+Tunneling+Nanotube+Biogenesis.">The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis.</a> Scientific Reports. 7, 8547 (2017).</li><li>Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+Rho+GTPases+in+the+biogenesis+of+tunnelling+nanotubes:+Implications+in+disease+and+therapy.">Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).</li><li>Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+tunneling+nanotubes+for+intercellular+trafficking.">Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking.</a> Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).</li><li>Hodneland, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+detection+of+tunneling+nanotubes+in+3D+images.">Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images.</a> Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).</li><li>Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+neurons+form+transient+nanotubes+facilitating+electrical+coupling+and+calcium+signaling+with+distant+astrocytes.">Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes.</a> PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+neurodegenerative+pathology+via+neuron-to-neuron+transmission+of+beta-amyloid.">Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).</li><li>Domert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+amyloid-beta+peptides+via+neuritic+cell-to-cell+transfer+is+dependent+on+insufficient+cellular+clearance.">Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance.</a> Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+Pixels,+and+Gray+Levels:+Digitizing+Image+Data.">Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Pontes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+elastic+properties+of+tunneling+nanotubes.">Structure and elastic properties of tunneling nanotubes.</a> European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).</li><li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH).">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology.">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria.">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).</li><li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation.">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li></ol>

Son 2 yılda birçok araştırmacı TNT'lerin yapısını anlamaya ve karakterize etmeye çalışıyor18. Spesifik belirteçlerin eksikliği ilerlemeyi engeller ve TNT'leri tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabilecek uygun, standartlaştırılmış bir yönteme olan talep artmaktadır. TNT'ler, iki hücre arasında gezinen F-aktin bazlı membran kanalları olarak tanımlanır. Çalışmalar, β-tübülin-pozitif, yakın uçlu, gelişmekte olan nöritlerin iki uzak hücre ara...

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) F-aktin bazlı, öncelikle açık uçlu membran kanallarıdır ve kargo ve organellerin hücreler arası transferinde hayati bir rol oynarlar1. TNT'lerin benzersiz özelliği, komşu hücreleri substratla herhangi bir temas olmadan bağlamalarıdır; uzunlukları 10-300 μm'nin üzerindedir ve çapları 50 nm ila 1 μm 2,3 arasında değişmektedir. TNT'ler geçici yapılardır ve ömürleri birkaç dakika ila birkaç saat arasında sürer. TNT'ler ilk olarak PC12 nöronal hücrelerindegösterilmiştir 1; Daha sonra, çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo 4,5 çeşitli hücre tiplerinde varlıklarını göstermiştir. Birçok çalışma, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalık modellerinde TNT'lerin patolojik önemini ortaya koymuştur 6,7,8.
TNT'lerin yapısal heterojenlikleri çeşitli hücresel sistemlerde yapılan çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir9. Farklılıklar sitoiskelet bileşimine, oluşum mekanizmasına ve10 aktarılan kargo tiplerine dayanmaktadır. Öncelikle, iki komşu hücre arasında gezinen ve organelleri transfer eden açık uçlu, F-aktin-pozitif membran sürekliliğinin TNT'lerden oluştuğu düşünülmektedir11. Bununla birlikte, TNT'lerin oluşumunda gözlenen netlik veya çeşitlilik eksikliği, TNT'ye özgü belirteçlerin geliştirilmesindeki zorluğu arttırmaktadır. Bu nedenle, TNT yapılarını geleneksel tespit yöntemleriyle tanımlamak ve membran nanotüplerini açık uçlu ve kapalı uçlu çıkıntılar açısından ayırt etmek zordur12. Bununla birlikte, TNT'lerin iki hücre arasında F-aktin membran çıkıntıları olarak gezinme özelliği, geleneksel görüntüleme teknikleri kullanılarak tanımlanması nispeten daha kolay ve daha uygundur. Filopodia ve dorsal filopodia gibi diğer aktin bazlı hücresel çıkıntılar, özellikle hücreler sabitlendiğinde, iki uzak hücre arasında gezinemez. Not olarak, yakın uçlu, elektriksel olarak birleşmiş, gelişmekte olan nöritler genellikle TNT benzeri yapılar olarak adlandırılır13.
F-aktinin TNT oluşumunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ve birçok çalışma F-aktin inhibitörü sitokalasin D'nin TNT oluşumunu inhibe ettiğini göstermiştir14,15. Buna karşılık, mikrotübül inhibitörlerinin TNT oluşumu16 üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Son 2 yılda, TNT'lerin patoloji ve tümör direncinin ve tedavisinin yayılmasında oynadığı önemli rol hakkında çeşitli raporlar görülmüştür17. Bu nedenle, TNT karakterizasyonu için daha iyi teknikler için hiç bitmeyen bir talep vardır.
TNT'lerin spesifik belirteçlerinin eksikliği ve morfoloji ve sitoiskelet kompozisyonundaki çeşitlilik, benzersiz bir karakterizasyon yönteminin geliştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bazı çalışmalarda otomatik görüntü algılama ve TNT niceleme teknikleri kullanılmıştır18,19. Bununla birlikte, mevcut 3D hacimli manuel analiz yönteminin, TNT'lerin tespiti ve nicelleştirilmesi için otomatik görüntü analizine göre birkaç avantajı vardır. Ayrıca, algoritma uzmanlığı olmayan laboratuvarlarda otomatik algılama yöntemlerinin uygulanması zor olabilir. Mevcut yöntem, hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak benimsenebilir.
Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, oAβ'nın nöronal hücrelerdeki TNT'lerin biyogenezini PAK1 aracılı, aktin bağımlı, endositoz mekanizması12 aracılığıyla desteklediğini gösterdik. oAβ kaynaklı TNT'ler ayrıca aktif PAK1'i (veya fosfo-PAK1) eksprese eder. OAβ ile indüklenen, F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı TNT'leri ayırt etmek için bir 3D hacim görünümü görüntü rekonstrüksiyon yöntemi geliştirdik. β-III tübülin-pozitif, gelişen nöritler genellikle TNT benzeri gezinme yapılarına benzerler20. Bu nedenle, F-aktin bazlı TNT'leri β-III tübülin pozitif nöritlerden ve diğer TNT benzeri çıkıntılardan daha da ayırt ettik. 3D hacim görünümü görüntüleri, TNT'leri substratum üzerinde gezinme ve iki komşu hücre arasında bağlı kalma özelliklerine dayanarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yazıda, aktin içeren membran kanallarının veya TNT'lerin konfokal z-yığın görüntüleri kullanılarak tanımlanması ve tespiti ve son olarak, 3D hacim görünümü rekonstrüksiyon görüntülerinden tanımlanan yapıların manuel olarak ölçülmesi açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, açık uçlu uygun TNT'leri kapalı uçlu TNT benzeri yapılardan ayırt edemez; Bu yöntem, TNT'lerin in vitro 2D hücre kültürünü düz bir substrat üzerinde tanımlamaya yardımcı olur. Bununla birlikte, yöntemin uygulanması ve çoğaltılması kolaydır ve sadece aktin bazlı TNT'lerin hassas bir şekilde ölçülmesi ve bunları nöritlerden ve β-tübülin pozitif TNT benzeri yapılardan ayırt etmek için yaygın olarak kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-14-1.5-N</td>
			<td>Imaging dish used to seed cells for staining experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946; (1-42) 1 mg</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>#64129</td>
			<td>Oligomers of amyloid beta to treat the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary antibody for phospho-PAK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td>
			<td>51025411</td>
			<td>Provide aspetic conditions duirng cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td>
			<td>51026556</td>
			<td>For growing cells at or near body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td>LSM 880</td>
			<td>Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8034560100</td>
			<td>Anti-bleaching reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td>Neuclear stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Used for the preparation of 100uM of A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham&#8217;s F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12500062</td>
			<td>Culture media for SH-SY5Y</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade</td>
			<td>Cryopur</td>
			<td>CP-100</td>
			<td>Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB058</td>
			<td>Used as one of the dissolving agent for the lyophilized A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&#160;Major supplement for Culture media (US origin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ML</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>Component in the Karnovsky&#39;s fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution</td>
			<td>TCI</td>
			<td>H024</td>
			<td>Used to dissolve A&#946; (1-42) 1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named &#34;volume viewer&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Christ, Alpha</td>
			<td>2.4 LDplus</td>
			<td>0.05 mg aliquots of A&#946; (1-42) can be stored in -20 &#176;C after lyophilization only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>15640055</td>
			<td>Antibiotic mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFlor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176756</td>
			<td>F-actin binding stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]</td>
			<td>CST</td>
			<td>#2601</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)</td>
			<td>Cloud clone</td>
			<td>PAE711Hu01</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td>Differentiating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td>Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)</td>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>3.0 L/3.2</td>
			<td>Sonicator used to dissolve A&#946; (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 &#181;M A&#946; (1-42)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>ZEISS (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of tunneling nanotubes using 3d volume view images

Son keşifler, hücrelerin nano ölçekli, aktin-membran kanalları, yani "tünelleme nanotüpleri" (TNT'ler) yoluyla doğrudan, uzun menzilli, hücreler arası transfer gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur. TNT'ler, 50 nm ile 1 μm arasında değişen çaplardaki komşu hücreler arasında sürekliliğe aracılık eden açık uçlu, lipid çift katmanlı kuşatılmış membran uzantıları olarak tanımlanmaktadır. TNT'ler başlangıçta nöronal hücrelerde gösterilmiştir, ancak birbirini izleyen çalışmalar, nörodejeneratif hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi çeşitli hücre tiplerinde ve hastalıklarında TNT'lerin varlığını ortaya koymuştur. Birçok çalışma, komşu hücreler arasındaki yakın uçlu, elektriksel olarak bağlanmış membran nanoyapılarına TNT'ler veya TNT benzeri yapılar olarak atıfta bulunmuştur.
Ultrayapının uç noktadaki membran sürekliliği açısından aydınlatılması teknik olarak zordur. Ayrıca hücre-hücre iletişimi üzerine yapılan çalışmalar, spesifik belirteçlerin bulunmaması nedeniyle TNT'lerin konvansiyonel yöntemler kullanılarak karakterizasyonu açısından zordur. TNT'ler öncelikle F-aktin bazlı, açık uçlu membran çıkıntıları olarak tanımlanır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, F-aktin'in her türlü çıkıntıda mevcut olmasıdır ve TNT'leri diğer çıkıntılardan ayırt etmeyi zorlaştırır. F-aktin bazlı TNT'lerin göze çarpan özelliklerinden biri, bu yapıların substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinmesidir. Bu nedenle, farklı F-aktin boyalı TNT'ler, hücreler arasında gezinmelerine bağlı olarak filopodia ve nöritler gibi diğer çıkıntılardan, kolayca ayırt edilebilir.
Son zamanlarda, oligomerik amiloid β 1-42'nin (oAβ) aktin bağımlı endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, SH-SY5Y nöronal hücreleri arasında fosfo-PAK1 ile birlikte eksprese edilen F-aktin içeren TNT'lerin oluşumuna aracılık eden aktif p21-aktivekinaz-1'i (PAK1) uyardığını gösterdik. Bu protokol, oAβ ile tedavi edilen nöronal hücrelerde F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı membran çıkıntılarının yakalanan z-yığın görüntülerinden TNT'leri tanımlamak ve karakterize etmek için bir 3D hacim analizi yöntemini özetlemektedir. Ayrıca, TNT'ler, F-aktin ve β-III tübülin-immünoboyalı membran kanallarına dayanan nöritler ve nöronal çıkıntılar geliştirmekten ayırt edilir.

Burada, SH-SY5Y nöronal hücrelerinde oAβ kaynaklı TNT'leri, konfokal z-yığın görüntülerinden 3D hacim görünümleri oluşturarak tanımlamakta ve karakterize ediyoruz (Şekil 1). Hücreler F-aktin ve fosfo-PAK1 ile çift immün boyandı. İmmünoboyalı hücrelerin konfokal z-stack görüntüleri TNT'leri tanımlamak için analiz edildi (Şekil 2). Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları oldu?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images at JoVE.com

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) öncelikle komşu hücreleri birbirine bağlayan ve hücreler arası iletişimi kolaylaştıran açık uçlu F-aktin membran nanotüpleridir. TNT'leri diğer hücre çıkıntılarından ayıran göze çarpan özellik, nanotüplerin hücreler arasında gezinen doğasıdır. Burada, TNT'leri konfokal z-yığın görüntülerinin 3B hacim görünümünü oluşturarak karakterize ediyoruz.

3D Hacim Görünümü Görüntüleri Kullanarak Tünelleme Nanotüplerinin Tespiti ve Niceliği

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

Tünelleme nanotüplerine özgü belirteçlerin eksikliği, alandaki ilerlemeyi kısıtlar ve tünelleme nanotüplerini tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için bir yönteme olan talep artmaktadır. Otomatik algılama yöntemlerinin bir algoritma geliştirme ve / veya mevcut algoritmayı değiştirme uzmanlığı olmadan uygulanması zordur, ancak manuel yöntemimizin daha iyi bir hassasiyetle uygulanması kolaydır. Tünelleme nanotüpleri yoluyla uzun menzilli hücreler arası transfer, nörodejeneratif patoloji, viral yayılma ve kanser dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde çeşitli şekillerde uygulanır.Bu nedenle, nanotüplerin patogenezdeki rollerini anlamak için tünelleme çalışmaları önemlidir. Boyama işlemi sırasında tünelleme nanotüplerinin kırılması mümkündür. Kapak kaymaları kullanmaktan ve slaytlara monte etmekten kaçının, bunun yerine cam tabanlı görüntüleme kapları kullanın.Modifiye fiksasyon protokolü, tünelleme nanotüplerinin bozulmadan kalmasına yardımcı olur. Prosedürü gösteren, Sangeeta NAF laboratuvarından doktora öğrencisi olan Deepak KV olacak. Başlamak için, kontrol ve oligomerik A-beta ile tedavi edilen hücreleri, fiksasyondan önce iki dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini, pH 7.2'nin 0.1 molar fosfat tamponunda çözünmüş% 2 formalin fiksatif ve% 2.5 glutaraldehit kullanarak hazırlayın. Ardından, Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini oda sıcaklığında 45 dakika ekleyerek görüntüleme kabındaki hücreleri sabitleyin. Kuluçka tamponunu, beş mililitre FBS'de 0.1 gram saponin çözerek ve 95 mililitre PBS ekleyerek seyrelterek hazırlayın.Daha sonra iki dakika boyunca inkübasyon tamponu kullanarak sabit hücreleri iki kez yıkayın. Fiksasyondan sonra, fosfo-PAK1'e karşı ilk antikoru ekleyin, inkübasyon tamponuna bir ila 250 seyreltme ekleyin ve karanlık, nemli bir odada dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. 24 saatlik inkübasyondan sonraki ertesi gün, hücreleri iki dakika boyunca inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın.Daha sonra Alexa Fluor 488 ve Phalloidin 555'e konjuge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Karanlık, nemli odadaki hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri iki dakika boyunca inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın.DAPI'yi bir ila 2000 seyreltmeye ekleyerek çekirdeği sabitleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. DABCO montaj ortamını, %90 gliserol ve %10 PBS'de 25 miligram DABCO kullanarak hazırlayın. Düzgün bir şekilde çözünmesi için, spektrofotometrik sınıf seyreltilmiş hidroklorik asit kullanarak pH'ı 8.6'ya ayarlayın ve çözeltiyi karıştırmak için bir rocker üzerinde tutun.Ağartma önleyici bir ajan olarak, DABCO montaj ortamını doğrudan alttaki kapak kaymasını içeren görüntüleme kabının üzerine ekleyin. En az bir ila iki saat bekleyin ve doğrudan konfokal görüntüleme yapmaya devam edin. Tünelleme nanotüplerini tanımlamak için, önce kanalları seçerek ve gerekli lazerleri pencerelerde sırayla tıklatarak konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immünoboyalı hücrelerin Z-yığın görüntülerini yakalayın, konfokal yazılımda bir, iki ve üç parça izleyin.Floresan kanallı diferansiyel parazit kontrast görüntülerini çekmek için bir izleme penceresinin altındaki TPMT seçeneğini tıklatın. Yazılımın Edinme sekmesini seçin, Z-yığını sekmesine tıklayın ve bir pencerenin açılmasını bekleyin. Ardından, çanağın altındaki hücreleri odaklamak için Canlı Tarama'yı tıklatın.Odaklanmış görüntüyü ilk yığın olarak seçin ve ardından hücrenin en üst bölümünü görmek için yukarı odaklanın ve son yığın olarak seçin. Canlı taramayı durdurun ve hücrelerin kalınlığına bağlı olarak dilim sayısını ve aralıkları belirleyen yığınların adım boyutunu düzeltmek için En Uygun sekmesinin yanındaki sayıyı tıklatın. 405 nanometre, 488 nanometre ve 561 nanometre lazerlerle üç DAPI, FITC ve TRITC kanalının sıralı görüntülerini alın ve 1,02 mikrosaniyelik piksel bekleme süresiyle çekim yapın.Hücre sınırını gözlemlemek için floresan kanallı DIC kanalındaki görüntüleri yakalayın. Analiz için Fiji yazılımında czi veri biçiminde kaydedilmiş konfokal görüntüleri açın. Görüntünün her bir Z-yığınını ve kanalını görmek için Hyperstack seçeneğini belirleyin.Belirli bir ilgi alanı kanalının tam yığınını seçmek için kanalı ve Z yığını kaydırma çubuklarını kaydırın. Ardından, kanal çubuğunu kaydırarak önce F-aktin lekeli kanalı seçin ve her bir yığını tek tek görmek için Z-yığınlarını manuel olarak kaydırın. Z-yığınlarının alt kısımlarında görülebilen hücreleri birbirine bağlıyor gibi görünen ve görüntüleme kabının yüzeyine yakın olan F-aktin lekeli yapıları, Z'nin nörit olarak ikiye eşit olduğu şekilde tanımlayın.Tünelleme nanotüplerini tanımlayın, F-aktin pozitif uçan hücreden hücreye kanallar, Z-yığınlarını Z'den üste doğru kaydırarak dörde eşittir. Z-yığınlarının alt kısımlarının yakınında yüzeye doğru nöritleri arayın ve Z-yığınlarının altıya eşit Z'de üste doğru kaydırılmasıyla kaybolmaya başladıklarını gözlemleyin. Fosfo-PAK1 pozitif tünelleme nanotüplerini, Z-yığınlarından gelen kanalların gezinme doğasını analiz ederek F-aktin pozitif tünelleme nanotüplerine benzer şekilde tanımlayın.Fosfo-PAK1 boyaması F-aktin boyamasından daha zayıf olduğundan, Z'de dörde eşit ve Z'de altıya eşit fosfo-PAK1 boyalı tünelleme nanotüplerini arayın. Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 lekeli tünelleme nanotüp yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntülerini gözlemleyin. Ek olarak, tanımlanan tünelleme nanotüplerinin F-aktin ve fosfo-PAK1 birlikte boyanmış yapılar olduğunu doğrulamak için F-aktin ve fosfo-PAK1 kanallarını birleştirin.Tünelleme nanotüplerini ölçmek için, toplam hücre sayılarını ve tanımlanan tünelleme nanotüplerini manuel olarak sayın ve sayıları yüzde olarak temsil edin. F-aktin ve beta III tübülin pozitif tünelleme nanotüplerini Z-yığını görüntülerinden gezinme kanalları gibi ayırt etmek için, F-aktin ve beta III tübülin kanallarını birleştirin, ardından birleştirilmiş görüntülerin Z-yığınlarını analiz edin. Sadece üçe eşit Z'de hafifçe görülebilen ve Z'de altıya eşit ve Z'de dokuza eşit belirgin olan F-aktin lekeli tünelleme nanotüplerini arayın.Benzer şekilde, F-aktin ve beta III tübülini tanımlayın. Z'de altıya eşit ve Z'de dokuza eşit olan uçan kanallar gibi çift pozitif tünelleme nanotüpleri. Diğer F-aktin ve beta III tübülin lekeli, Z-yığınlarının alt kısımlarından havada asılı durmayan çıkıntıları tanımlayın.Fiji'deki Line aracını kullanarak tünelleme nanotüplerinin çapını ölçün. Analiz Et'i tıklatarak ölçüm ölçeğini doğrulayın ve ardından ölçeği piksel cinsinden mesafenin czi görüntülerinden otomatik olarak ayarlanması için ayarlayın. XY düzlemindeki tünelleme nanotüplerinin çaplarını ölçün.3D yeniden dilimleme ve eşik özellikli 3D görselleştirmeye izin veren Fiji'deki Volume Viewer eklentisini kullanarak, Z-stack görüntülerini ayrı kanallara bölün. Ardından, bir seferde bir veya iki tünelleme nanotüpünü veya nöritini vurgulamak için 3D rekonstrüksiyon görünümünü kullanmak üzere tek kanallı Z-yığını görüntülerini kırpın. XY düzleminde tek bir tünelleme nanotüplerini veya nöritini sabitleyin ve XZ ve YZ erişim kesitlerini işaretleyin.XZ düzleminin altındaki nöritleri, XZ ve YZ düzlemlerini ve üst Z-yığınlarındaki tünelleme nanotüplerini gözlemleyin. XZ düzleminde 3B hacim görünümünü yeniden oluşturmak için tek tek tünelleme nanotüplerini veya nöritini seçin. 3D rekonstrüksiyonda, Z-düzleminin altındaki nöritleri ve alt Z-düzlemine dokunmadan iki hücreyi birbirine bağlayan gezinen yapılar olarak görünen tünelleme nanotüplerini gözlemleyin.F-aktin ve fosfo-PAK1 ile immünoboyalı hücrelerin konfokal Z-yığın görüntüleri, tünelleme nanotüplerini tanımlamak için analiz edildi. Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 lekeli tünelleme nanotüp yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntüleri analiz edildi. Hücreler F-aktin ve beta III tübülin ile çift immünoboyalıydı ve tünelleme nanotüp benzeri F-aktin ve tünelleme nanotüp benzeri F-aktin ve beta III tübülin çift pozitif membran kanalları sadece F-aktin pozitif tünelleme nanotüplerinden ayırt edildi.Fosfo-PAK1 ve F-aktin ile birlikte eksprese edilen tünelleme nanotüpleri, substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerine dayanarak 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak diğer nöritlerin hücre çıkıntılarından ayırt edildi. Sağ fiksatif ajanın kullanımı önemlidir, çünkü numunenin kusurlu fiksasyonu hedef proteinlerin hızlı proteolitik yıkımına ve spesifik immünoreaktivitede azalmaya neden olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Farelerde İletkenlik Balon Kullanımı kalp Basınç Hacim Döngüsü Analizi

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

ImageJ Eklentileri Kullanma Hücre Sayım Usul Otomatik Niceleme ve Analizi

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Birim segmentasyon ve SuRVoS (süper bölge birim segmentasyon) tezgah kullanarak biyolojik malzemelerin analizi

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Interbakteriyel Rekabetin Nicelemesi

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...