유육종증과 신경근 질환의 특징인 근육 내 지방을 연구하는 데 있어 중요한 장벽 중 하나는 특히 동결 조직 절편에서 지방세포의 효과적인 보존과 후속 시각화입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방의 견고하고 엄격하며 재현 가능한 시각화 및 정량화를 위해 정렬 된 지방 세포 형태학 및 골격근 절편을 보존합니다. 우리의 분석 파이프 라인은 Duchenne 근육 이영양증과 같은 질병에서 지방 형성을 예방하기위한 새로운 개입을 검증하기위한 프레임 워크를 제공합니다 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Connor Johnson이 될 것입니다.
시작하려면 다리를 청소하여 신선한 알코올 닦아내기를 주입하여 소독하십시오. 30 ~ 50 마이크로 리터의 50 % 글리세롤을 인슐린 주사기에 넣으십시오. 정강이에 머리카락을 부드럽게 닦아 TA의 위치를 노출시킵니다. TA를 찾은 후, 바늘을 발목 근처의 원위 방향으로 TA에 삽입하십시오.
바늘을 근육에 완전히 삽입하고 천천히 글리세롤을 주입하면서 점차적으로 바늘을 꺼내어 근육의 대부분을 손상시키는 데 도움이됩니다. 70 % 에탄올로 자르는 마우스의 모든 부위를 자유롭게 스프레이하여 머리카락을 해부 부위와 악기에서 떼어 낼 수 있도록하십시오. 가위를 사용하여 골반 근처의 다리 꼭대기 주위의 피부를 자릅니다.
다리의 피부를 위에서 발목까지 부드럽게 당깁니다. 먼저, TA를 수확하기 전에 날카로운 팁 핀셋을 사용하여 외부 결합 조직층을 제거한다. 근육의 바닥에서 TA 아래의 핀셋을 밀어 원위 힘줄에서 시작하여 무릎쪽으로 부드럽게 위로 당깁니다. 근육의 끝에서 멈추십시오.
아래 무릎에서 느껴지는 저항을 지나치지 마십시오. 무릎 아래에 도달하기 전에 상당한 저항이있는 경우, 결합 조직의 남은 층을 멈추고 계속 제거하십시오. TA가 핀셋으로 다리에서 부분적으로 들어 올려지면 메스와 동일한 동작을 사용하여 TA와 무릎 아래 연결을 끊습니다.
발목의 힘줄을 가위로 장하여 TA를 완전히 제거하십시오. 섬유의 손상을 피하기 위해 힘줄의 근육 만 다루십시오. 힘줄 반대편에있는 끝에서 TA의 삼분의 일을 자릅니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고 액체 질소에 떨어 뜨려 스냅하십시오.
조직의 다른 두 삼분의 일을 조직학을 위해 4%PFA로 표지된 웰에 잠급니다. 첫 번째와 마지막 조직이 고정에 배치 된 시점을 추적하십시오. 네 섭씨 온도에서 두 시간 반 동안 너트 레이터에 놓습니다.
고정 후 웰에서 PFA를 제거하십시오. 조직을 차가운 1X PBS로 두세 번 헹구고 세척당 5분 동안 차가운 1X PBS로 두세 번 세척한다. 웰로부터 PBS를 제거하고 조직이 부유할 수 있도록 1X PBS에 충분한 30%수크로오스를 첨가한다.
밤새 섭씨 네 도에서 너트 레이터에 올려 놓으십시오. 현미경을 켜고 이미징 소프트웨어를 시작하십시오. 슬라이드를 스테이지에 고정합니다.
모든 채널을 사용하여 이미지화할 영역을 식별합니다. 이미징 소프트웨어에서 각 채널의 게인 및 노출 시간을 조정합니다. 각 채널에서 전체 조직의 이미지를 촬영하고 개별 타일을 병합하여 전체 TA 단면의 합성을 만듭니다.
시작하기 전에 RNase 유리 물을 섭씨 45도까지 예열하고 신선한 70 % 에탄올을 준비하십시오. 1000 마이크로 리터의 구아니디늄 티오시아네이트를 샘플이 들어있는 각 튜브에 첨가하십시오. 비드 비터 승인 튜브를 사용하는 것이 중요합니다.
세 개의 중간 구슬 또는 하나의 크고 작은 구슬을 각 튜브에 추가하십시오. 비드 비터를 사용하여 조직을 50 헤르츠에서 두 내지 네 분 동안 균질화한다. 조직 유형 및 샘플 크기에 따라 최대 10분이 걸릴 수 있습니다.
클로로포름 200 마이크로 리터를 첨가하십시오. 샘플을 15초 동안 흔든다. 실온에서 두세 분 동안 인큐베이션한다.
12에서 15분 동안 원심분리하고, 350 마이크로리터의 투명한 상청액을 350 마이크로리터의 G.Pipette에서 000배 첨가하고, 350 마이크로리터의 70% 에탄올을 함유하는 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 첨가한다. 하부 단백질 및/또는 DNA 층을 흡인하지 않도록 주의하십시오. 이 혼합물의 최대 700 마이크로리터를 두 밀리리터 수집 튜브에 놓인 미니 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
제조업체의 지침에 따라 RNA 분리를 계속하십시오. 예상 수율에 따라 30 ~ 50 마이크로 리터의 RNase 유리 물로 희석하십시오. RNA를 얼음 위에 보관하고 분광 광도계를 사용하여 수율을 측정하십시오.
저장된 RNA를 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 최대 한 마이크로그램의 RNA를 사용하여 cDNA를 cDNA 합성 키트로 합성하고 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성합니다. 실행이 완료되면 80 마이크로 리터의 RNase 유리 물을 첨가하십시오.
샘플을 영하 20도에 보관하십시오. 384 웰 포맷을 사용하여 각 웰의 바닥에 프라이머 한 마이크로리터를 첨가한다. 자유 건조 프라이머는 더 엄격한 기술적 반복을 초래합니다.
프라이머가 완전히 증발 할 때까지 덮으십시오. 네 개에서 여덟 개의 기술적 반복실험으로 샘플 반응을 설정합니다. PCR 실행이 완료된 후, 원시 주기 역치 값을 하우스 키핑 유전자 수준으로 정규화하고 델타 델타 Ct.Perilipin 및 고정되지 않은 TA의 양성 지방세포를 계산하여 폴드 변화를 결정함으로써 고정 된 섹션에 비해 형태학이 크게 변경되어 식별, 시각화 및 후속 정량화가 훨씬 어렵고 잠재적으로 부정확 해집니다.
대조적으로, PFA 고정은 지방세포 형태를 보존하여 근육 내 지방의 정확한 검출을 가능하게 합니다. 손상되지 않은 TA 근육과 비교하여, 글리세롤 손상은 손상 후 사흘 이내에 PPAR 감마 및 CEBP 알파와 같은 초기 아디포제닉 마커의 발현을 유도한다. 아디포넥틴 및 페리리핀과 같은 성숙한 마커는 글리세롤 손상 후 오일부터 검출될 수 있다.
유전적 혈통 추적을 사용하여, 대부분의 PDGF 수용체 알파 FAPs는 계통 마커 EYFP를 발현한다. 글리세롤 손상 후 칠일 후, EYFP 양성 FAP는 지방세포를 발현하는 EYFP 양성 페리리핀으로 변하여 FAP가 실제로 근육내 지방의 세포 기원임을 입증합니다. 프로토콜은 또한 근인성 구획을 시각화하도록 적응될 수 있다.
PAX7 및 MYOD1에 대한 항체를 사용하여, 근육 줄기 세포 및 근원세포 마커는 각각 PFA 고정 근육 조직 절편에서도 글리세롤 손상 후 오일 동안 용이하게 검출될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 지방세포 및 다른 성인 조직을 시각화하고 정량화하도록 적응될 수 있다. 또한, 우리의 조직 보존 기술은 다양한 서있는 기술과 호환됩니다.
