En veiledning for å undersøke intramuskulær fettdannelse og dens cellulære opprinnelse i skjelettmuskulatur

En betydelig barriere for å studere intramuskulært fett, et kjennetegn ved sarkopeni og nevromuskulære sykdommer, er effektiv bevaring og påfølgende visualisering av adipocytter, spesielt i frosne vevsseksjoner. Protokollen bevarer adipocyttmorfologi og skjelettmuskelseksjoner justert for robust, streng og reproduserbar visualisering og kvantifisering av intramuskulært fett. Vår analysepipeline gir et rammeverk for å validere nye inngrep for å forhindre fettdannelse i sykdommer som Duchenne muskeldystrofi Demonstrere prosedyren vil være Connor Johnson, en forskningstekniker fra laboratoriet mitt.

For å begynne, rengjør benet som skal injiseres med en ny alkoholserviett for å desinfisere. Trekk opp 30 til 50 mikroliter 50 % glyserol i insulinsprøyten. Børst forsiktig opp håret på leggen for å avsløre plasseringen av TA. Etter å ha lokalisert TA, sett nålen inn i TA distalt nær ankelen.

Sett nålen helt inn i muskelen og injiser glyserol sakte, mens du gradvis trekker ut nålen, noe som bidrar til å skade det meste av muskelen. Spray liberalt noen områder av musen som skal kuttes inn med 70% etanol for å holde håret utenfor dissekeringsområde og instrumenter. Bruk saks til å kutte huden rundt toppen av beinet nær bekkenet.

Trekk forsiktig huden på beinet fra toppen og ned til ankelen. Fjern først det ytre bindevevslaget med skarp spisspincett før høsting av TA. Skyv pinsetten under TA fra bunnen av muskelen, start ved den distale senen og trekk forsiktig oppover mot kneet. Stopp på slutten av muskelen.

Ikke skyv forbi motstanden som føltes i det nedre kneet. Hvis det er en betydelig motstand før du når det nedre kneet, stopp og fortsett å fjerne gjenværende lag av bindevev. Når TA er delvis løftet fra beinet med pinsetten, bruk samme bevegelse med en skalpell for å kutte forbindelsen mellom TA og under kneet.

Tarm senen ved ankelen med saks for å fjerne TA helt. Håndter bare muskelen ved senen for å unngå å skade fibrene. Klipp en tredjedel av TA på slutten, motsatt senen. Sett den i mikroentrifugenrøret og knips fryse den ved å slippe den i flytende nitrogen.

Senk de andre to tredjedelene av vevet i en merket brønn med 4% PFA for histologi. Sørg for å holde styr på når det første og siste vevet ble plassert i fikseringsmiddel. Plasser på en mutter i to til to og en halv time ved fire grader Celsius.

Etter fiksering, fjern PFA fra brønnene. Skyll vevet med kaldt en X PBS to til tre ganger og vask deretter to til tre ganger med kald 1X PBS i fem minutter per vask. Fjern PBS fra brønnene og tilsett nok 30% sukrose i 1X PBS for å la vevet flyte.

Plasser på mutteren ved fire grader Celsius over natten. Slå på mikroskopet og start bildebehandlingsprogramvaren. Fest lysbildet på scenen.

Bruk en hvilken som helst kanal til å identifisere området som skal avbildes. I bildebehandlingsprogramvaren justerer du forsterkning og eksponeringstid for hver kanal. Ta bilder av hele vevet i hver kanal og slå sammen individuelle fliser for å lage en sammensetning av hele TA-tverrsnittet.

Før du begynner, forvarm RNase fritt vann til 45 grader Celsius og tilbered fersk 70% etanol. Tilsett 1000 mikroliter guanidiniumtiocyanat til hvert rør som inneholder prøven. Det er viktig at Bead Beater-godkjente rør blir brukt.

Legg tre mellomstore perler, eller en stor og en liten perle, til hvert rør. Homogeniser vevet ved 50 Hertz i to til fire minutter ved hjelp av en Bead Beater. Avhengig av vevstype og prøvestørrelse kan det ta opptil 10 minutter.

tilsett 200 mikroliter kloroform. Rist prøvene i 15 sekunder. Inkuber i to til tre minutter ved romtemperatur.

Sentrifuge i 15 minutter ved 12 000 ganger G.Pipetter ut 350 mikroliter av den klare supernatanten og tilsett et nytt mikroentrifugerør som inneholder 350 mikroliter 70 % etanol. Vær forsiktig så du ikke aspirerer de lavere protein- og/eller DNA-lagene. Overfør opptil 700 mikroliter av denne blandingen til en minispinnkolonne plassert i et to milliliter oppsamlingsrør.

Fortsett med RNA-isolasjon etter produsentens instruksjoner. Eluer med 30 til 50 mikroliter RNase fritt vann, avhengig av forventet utbytte. Hold RNA på is og mål utbyttet ved hjelp av et spektrofotometer.

Hold RNA lagret på minus 80 grader Celsius. Bruk opptil ett mikrogram RNA for å syntetisere cDNA med et cDNA-syntesesett, etter produsentens instruksjoner. Etter at løpet er fullført, tilsett 80 mikroliter RNase fritt vann.

Oppbevar prøvene ved minus 20 grader Celsius. Bruk et 384 brønnformat, legg til en mikroliter primer til bunnen av hver brønn. Fritørkende primere resulterer i strammere tekniske replikasjoner.

La det stå til primerne har fordampet helt. Sett opp prøvereaksjoner med fire til åtte tekniske replikasjoner. Etter at PCR-kjøringen er fullført, normaliser rå syklusterskelverdier til husholdningsgennivåer og bestemmer foldendringer ved å beregne delta-delta Ct.Perilipin og positive adipocytter fra de ufikserte TAene har signifikant endret morfologi sammenlignet med faste seksjoner, noe som gjør deres identifikasjon, visualisering og en påfølgende kvantifisering mye vanskeligere og potensielt unøyaktig.

I motsetning til dette bevarer PFA-fiksering adipocytmorfologi, noe som muliggjør nøyaktig påvisning av intramuskulært fett. Sammenlignet med ubesudlet TA-muskel induserer glyserolskade uttrykk for tidlige adipogenic markører, som PPAR gamma og CEBP alfa så snart som tre dager etter skade. Modne markører som adiponektin og perilipin kan oppdages så tidlig som fem dager etter glyserolskade.

Ved hjelp av genetisk avstamningssporing uttrykker flertallet av PDGF-reseptor alfa FAPs avstamningsmarkøren EYFP. Syv dager etter glyserolskade har EYFP-positive FAPs blitt til EYFP-positive perilipin som uttrykker adipocytter, noe som viser at FAPs faktisk er den cellulære opprinnelsen til intramuskulært fett. Protokollen kan også tilpasses for å visualisere det myogene rommet.

Ved bruk av antistoffer mot PAX7 og MYOD1 kan henholdsvis muskelstamcelle- og myoblastmarkører lett påvises fem dager etter glyserolskade, selv i PFA-faste muskelvevssnitt. Denne protokollen kan også tilpasses for å visualisere og kvantifisere adipocytter og andre voksne vev. I tillegg er vår vevsbevaringsteknikk kompatibel med en rekke forskjellige stående teknikker.