Name: isolation and identification of vascular endothelial cells from distinct adipose depots for downstream applications
Uploaded: 2022-06-10T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications at JoVE.com

In liebevoller Erinnerung an Rich West, einen brillanten Wissenschaftler, Kollegen und lieben Freund. Wir möchten der University of Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core als Teil des Delaware Biotechnology Institute für ihre laufenden Beiträge zu unseren Studien danken. Wir danken auch Emma Hudgins für die sorgfältige Sichtung und Bearbeitung des Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher) unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Delaware INBRE-Programm unterstützt, mit einem Zuschuss des NIGMS (P20GM103446) von den National Institutes of Health und dem Bundesstaat Delaware (I.S. Fancher) und einem University of Delaware General University Research Grant (I.S. Fancher). Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der NIH dar.

Die Verwendung von Tieren in diesen Studien wurde von der University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (# 1372) genehmigt.
1. Gewebedissektion und -reinigung
HINWEIS: Im Videoprotokoll werden 10 bis 12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse verwendet. In Abbildung 1 finden Sie das Schema und das gewünschte Ergebnis der Gewebedissektion und der Reinigung der Arterien sowie die Liste der Verbrauchsmaterialien und Herstellerinformationen in der Materialtabelle .
<ol><li>Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung, gefolgt von zervikaler Dislokation.</li>
	<li>Sichern Sie die Maus mit Sezierstiften und besprühen Sie die ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Isolierung von subkutanem Fettgewebe an jedem Hinterbein HINWEIS: Sezierwerkzeuge benötigt: gerade Bonner Schere (9 cm) und stumpfe, gebogene Graefe-Pinzette.<ol><li>Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut direkt über den Genitalien anzuheben und einen kleinen (2 mm) Schnitt in die Haut zu machen.</li>
		<li>Führen Sie die Spitze der Schere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen 4-5 cm langen Mittellinienschnitt, beginnend mit dem ersten Schnitt und kranial zur Basis des Brustbeins. Seien Sie vorsichtig, um nicht in die Bauchhöhle einzudringen.</li>
		<li>Machen Sie einen 1 cm langen seitlichen Einschnitt, der sich seitlich von der Mittellinie unmittelbar unterhalb der Vorderbeine erstreckt.</li>
		<li>Machen Sie einen diagonalen 1 cm langen Schnitt zwischen Hinterbein und Genitalien.</li>
		<li>Machen Sie kleine Schnitte entlang der Mittellinien-Hautschnitte, um das zugehörige Bindegewebe abzuziehen und das subkutane Fettdepot freizulegen. Stecken Sie die Haut fest.</li>
		<li>Identifizieren Sie das "C-förmige" subkutane Fettgewebe und die Arterie / Vene, die senkrecht zur Bauchhöhle verläuft.</li>
		<li>Beginnen Sie von der Unterseite der C-Form in der Nähe der Genitalien und greifen Sie sanft das Fettgewebe, um das Bindegewebe freizulegen. Machen Sie kleine Schnitte im Bindegewebe, um das Fett von der Haut zu trennen. Vermeiden Sie es, das exponierte Gefäßsystem zu stören.</li>
		<li>Das Bindegewebe wird weiter seziert, bis das subkutane Fettgewebe intakt entfernt werden kann. Trennen Sie die freiliegende Arterie vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe.</li>
		<li>Lagern Sie das isolierte subkutane Fett im HEPES-Puffer auf Eis, bis Sie bereit sind, das interessierende Gefäßbett zu isolieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3.-1.3.5. für das verbleibende hintere subkutane Fettdepot.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung des mesenterialen Fettdepots HINWEIS: Sezierwerkzeuge benötigt: gerade Bonner Schere (9 cm), Graefe-Pinzette, eine #5-Pinzette, gerade Irisschere und gebogene Bonn-Schere (9 cm).<ol><li>Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die dünne Peritonealhöhlenwand über der Harnblase anzuheben und einen kleinen Schnitt mit einer geraden Schere zu machen.</li>
		<li>Heben Sie langsam die durchdrungene Peritonealhöhlenwand an, führen Sie vorsichtig die gerade Irisschere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen 4-5 cm langen Schnitt von der Harnblase zum Brustbein.</li>
		<li>Machen Sie zwei 1 cm lange horizontale Schnitte mit der geraden Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie bis unmittelbar über das Hinterbein und unter das Vorderbein erstrecken. Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen und die Peritonealeingeweide freizulegen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.4.3. auf der gegenüberliegenden Seite.</li>
		<li>Verwenden Sie die Zange # 5, um den Darm aus der viszeralen Höhle zu heben, um das mesenteriale Fett freizulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie die gebogene Schere und die # 5 Pinzette, um das Fett entlang des Dickdarms zu trennen, beginnend vom Blind bis zu dem Punkt, an dem der Dickdarm aus dem Blickfeld absteigt.</li>
		<li>Kehren Sie zum Fäkal zurück und verwenden Sie die gebogene Schere und die # 5 Pinzette, um das Fett entlang des Dünndarms zur Bauchspeicheldrüse zu trennen. Entfernen Sie einen kleinen Teil der Bauchspeicheldrüse, um das mesenteriale Fett vollständig zu isolieren. HINWEIS: Das Entfernen eines kleinen Teils der Bauchspeicheldrüse zusammen mit dem mesenterialen Fett kann bei der Reinigung der Arterien helfen, da es während der Reinigung Stabilität bietet.</li>
		<li>Lagern Sie das isolierte mesenteriale Fett im HEPES-Puffer auf Eis, bis die Mesenterialarterien isoliert werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung der jeweiligen Arterien aus subkutanem und mesenterialem Fettgewebe HINWEIS: Sezierwerkzeuge werden benötigt: eine Sezierschale und ein Stereoskop mit einer Lichtquelle, einem Paar # 55 Pinzetten und einem Paar # 5 Pinzetten.<ol><li>Geben Sie ~ 10 ml kalten HEPES-Puffer in die Sezierschale und übertragen Sie das Fettgewebe mit der #5-Pinzette in die Schale.</li>
		<li>Verwenden Sie das Stereoskop bei 1-facher Vergrößerung, um das Fettgewebe zu betrachten und zu positionieren, um das/die Arterien-Venenpaar(e) freizulegen (Abbildung 2).</li>
		<li>Verwenden Sie die Zange #55, um das parenchymale Fett vorsichtig aus der Arterie zu entfernen. Entfernen Sie kleine Fettstücke auf einmal und beobachten Sie sorgfältig Arterie / Venenpaare unter dem Stereoskop, um das interessierende Gefäßsystem zu identifizieren und zu vermeiden. ANMERKUNG: Stellen Sie die Vergrößerung und die Lichtquelle entsprechend ein, um die Arterien zu reinigen. Erhöhen Sie die Vergrößerung und Lichtintensität, um die Arterien besser zu sehen, wenn Fett entfernt wird. Die Feinreinigung der Arterien sollte unter 4-5-facher Vergrößerung erfolgen. Es ist wichtig, zwischen Bindegewebe (Kollagenen), Venen und Arterien zu unterscheiden. Bindegewebe und Kollagenfasern haben ein schnurartiges Aussehen ohne Zweige, sind gestreift und haben eine weißliche Farbe. Im Gegensatz zu Kollagenfasern und Bindegewebe sind Arterien und Venen transparent und haben mehrere Zweige mit einem definierten Lumen. Kleine Arterien und Venen können ähnlich aussehen, wenn sie frei von Parenchymgewebe sind. Das Vorhandensein von Blut im Lumen kann weiter helfen, die Arterien aus Venen zu identifizieren. Venen haben dünnere Blutgefäßwände und ein größeres Lumen und enthalten mehr Blut im Vergleich zu vergleichbar großen Arterien.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.5.3. bis die Arterien vollständig frei von parenchymalem Fettgewebe sind.</li>
		<li>Verwenden Sie #5 Pinzetten, um die gereinigten Arterien in einen neuen Schlauch mit frischem HEPES-Puffer zu übertragen und auf Eis zu halten, bis sie für die Verdauung bereit sind.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Verdauung isolierter Arterien zur Isolierung von Endothelzellen
HINWEIS: Bitte beachten Sie Abbildung 2 für das Schema der Gewebeverdauung und Isolierung von Endothelzellen und die Materialtabelle für eine vollständige Liste der für das Protokoll benötigten Verbrauchsmaterialien.
<ol><li>Fügen Sie jeweils 1 mg Dispase und Elastase zu jedem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung zu jedem Röhrchen hinzu. Wirbeln und bei 37 °C inkubieren, bis sie sich vollständig aufgelöst haben. Verwenden Sie die #5-Pinzette, um die gereinigten Arterien (Schritt 1.5.5.) in die jeweiligen Probenröhrchen zu übertragen. Die Endkonzentration jedes Enzyms beträgt 0,5 mg/ml.</li>
	<li>Bei 37 °C für 1 h unter leichtem Rühren durch Inversion alle 10-15 min inkubieren, so dass die Arterien in Lösung suspendiert sind, um einen konsistenten und gleichmäßigen Kontakt zwischen den Enzymen und Arterien aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Wiegen Sie 1 mg Kollagenase Typ I pro Probe und fügen Sie es in neue Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Lassen Sie die Arterien am Boden der Röhre absetzen. Entfernen Sie 500 μL des Puffers von oben, ohne die Arterien zu stören, und geben Sie ihn in dafür vorgesehene Röhrchen, die Kollagenase enthalten. Vortex und geben Sie die Lösung zu den jeweiligen Proben in den ursprünglichen Probenröhrchen zurück. Die Endkonzentration der Kollagenase Typ I beträgt 0,5 mg / ml.</li>
	<li>Bei 37 °C 15 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Arterien nach kurzem Schütteln des Probenröhrchens in Stücke trennen. Wenn sich die Arterien nach der Störung nicht in Stücke trennen, inkubieren Sie in 5-Minuten-Schritten, bis der arterielle Zusammenbruch sichtbar ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Glaspipette, trituieren Sie das verdaute Gewebe 10x-15x, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren.</li>
	<li>Die Lösung und das verdaute Gewebe durch ein 70-μm-Zellsieb oder ein Durchflusszytometrie-Röhrchensieb leiten, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.</li>
</ol>3. Färbung von Endothelzellen vor der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die Färbung und Verarbeitung von Endothelzellen erfolgt auf Eis, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern, sofern nicht angewiesen. Die 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen werden bei 1.163 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
<ol><li>Zentrifugieren Sie die einzelligen Suspensionen bei 1.163 x g für 3 min bei RT.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS + 5% BSA für 30 min bei RT. HINWEIS: Forscher sollten erwägen, FC-Rezeptoren abhängig vom Zelltyp, dem interessierenden Ziel und dem verwendeten Antikörper zu blockieren18,19.</li>
	<li>Fügen Sie 1 μL Zelllebensfähigkeitsfärbung (405 nm Anregung) hinzu (Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 min bei RT.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.163 x g für 3 min bei RT. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS + 1% BSA.</li>
	<li>Zu den Proben werden primäre Antikörper konjugiert zu CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/Probe) und CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/Probe) hinzugefügt und auf einer Wippe im Kühlschrank für 15 min inkubiert, nachdem die Proben mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden. HINWEIS: Um eine reine Population von Endothelzellen zu identifizieren und/oder zu erhalten, untersuchen Sie sowohl CD31 als auch CD45 mit CD31- und CD45-konjugierten primären Antikörpern mit ausgeprägter Anregungs-/Emissionsfluoreszenz und Gate/Sort-Zellen mit einem CD31+CD45−-Expressionsprofil. Eine Kompensation kann in Abhängigkeit von den verwendeten Fluorophorenerforderlich sein 18,20,21.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% BSA direkt in die Zellsuspension geben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.163 x g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 200 μL 1% Formaldehyd mit 0,1% BSA. Im Kühlschrank mit Aluminiumfolie abgedeckt aufbewahren, bis sie für die Durchflusszytometrie bereit sind. HINWEIS: Die Zellausbeute wird durch die Reduzierung der Wasch- und Zentrifugationsschritte verbessert. Diese müssen möglicherweise je nach Ergebnisansatz geändert werden. Die Fixierprobe sollte innerhalb von 24 h analysiert werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kr&#252;ger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+biology:+An+update.">Vascular endothelial cell biology: An update.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).</li><li>Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice.">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> The Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).</li><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Endotheliale Dysfunktion ist ein Vorläufer schwerer Krankheitszustände, die wahrscheinlich die Entwicklung von Atherosklerose, Bluthochdruck und Schlaganfall vorantreiben 3,23. Während die identifizierten Mechanismen, die der endothelialen Dysfunktion in einem bestimmten pathologischen Zustand zugrunde liegen, vielfältig sind, werden unterschiedliche Gefäßbetten wahrscheinlich differentiell durch pathologische Zustände beeinflusst 4,24. Darüber hinaus induzieren verschiedene kardiovaskuläre Risikofaktoren (z. B. Fettleibigkeit, Bluthochdruck, Dyslipidämie, Rauchen, Diabetes) Funktionsstörungen durch eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen23,25. Daher ist es wichtig, Endothelzellpopulationen aus etablierten Tiermodellen von Krankheiten oder zugänglichem menschlichem Gewebe zu isolieren und Assays an Zellen durchzuführen, die unmittelbar aus der In-vivo-Umgebung entfernt wurden. Die Isolierung von Zellen auf diese Weise hat einen einzigartigen Vorteil gegenüber der Untersuchung von Zellen in Kultur, da sie frei von kulturinduzierten phänotypischen Veränderungen sind 5,6. Darüber hinaus informiert die Einbeziehung einer heterogenen Endothelzellpopulation, wie sie in vivo 26,27 beobachtet wurde (und die durch flussunterstützte Zellsortierung weiter getrennt werden kann), von einem lebenden Organismus die In-vivo-Umgebung besser. Schließlich ist diese Methode auf die Untersuchung zahlreicher Tiermodelle und möglicherweise menschlicher Gewebe anwendbar und kann zur Erzeugung primärer Zellkulturlinien verwendet werden, wenn ein solcher Bedarf gerechtfertigt ist.
Der kritische Schritt in diesem Protokoll und der Schritt, der am meisten für verschiedene Gefäßbetten oder Zelltypen angepasst werden muss, die hier nicht vorgestellt werden, ist die Verdauung von vaskulärem Gewebe. Dieser Schritt muss für die Zellgesundheit optimiert werden, ohne die Zellausbeute zu verringern. Die verwendeten spezifischen Enzyme und die Dauer der Verdauung sind entscheidend für die Optimierung der Zellgesundheit und des Zellertrags, um nachgeschaltete Assays adäquat durchführen zu können. Für die Identifizierung der Membranexpression von CD36, wie sie durch Durchflusszytometrie in subkutanen und mesenterialen Endothelzellen nachgewiesen wurde (Abbildung 4), wurde eine modifizierte Version des ursprünglich für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie28 konzipierten Aufschlussprotokolls entwickelt. Dies beinhaltete eine Verlängerung der Kollagenase-I-Verdauungszeit auf 30 Minuten, um die Zellausbeute zu erhöhen und die Anforderungen der Durchflusszytometrie besser zu erfüllen, verglichen mit dem, was für Patch-Clamp-Studien erforderlich ist. Da diese Modifikation die Zellgesundheit bis zu einem gewissen Grad beeinträchtigen kann, wurde in den Durchflusszytometrie-Analysen eine Zelllebensfähigkeitsfärbung verwendet, um sicherzustellen, dass nur lebensfähige Endothelzellen nach diesem Protokoll bewertet wurden (Abbildung 3). Es wird empfohlen, dass Studien, die darauf abzielen, Zellen aus vaskulärem Gewebe zu isolieren, vor der Bewertung des gewünschten Ansatzes einen Marker für die Zelllebensfähigkeit enthalten sollten.
Das beschriebene Protokoll reicht aus, um lebensfähige Endothelzellen für Analysen und nachgeschaltete Anwendungen aus ≤1 mg arteriellen Proben von Mäusen freizusetzen; Wenn jedoch die interessierenden Arterien aus verschiedenen Geweben oder Organismen (z. B. Menschen) isoliert würden, was zu signifikant unterschiedlichen arteriellen Massen führen würde, müsste man den Verdauungsenzymgehalt und die Dauer der Inkubation optimieren, um die interessierende Zellpopulation effizient zu isolieren. Für einige Gefäßbetten, die mit noch kleineren Mengen an Ausgangsgewebe beginnen als die hier vorgestellten subkutanen und mesenterialen Betten (z. B. Koronararterien), kann eine Ansammlung von Arterien aus mehreren Mäusen pro Probe erforderlich sein. In der Tat kann dies ein notwendiger Schritt für jedes gegebene Gefäßbett sein, da der Ergebnisansatz eine relativ hohe Zellausbeute erfordert. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass aufgrund der Art der Schwankungen pro Probenaufschluss die Zellausbeuten manchmal zwischen den Chargen signifikant unterschiedlich sein können, selbst wenn sie aus demselben Gefäßbett stammen. Dies kann zu Problemen bei der Analyse von Daten führen und sollte gegebenenfalls durch Normalisierung berücksichtigt werden. Zum Beispiel war die CD36-Expression in den Rohdaten aufgrund von Veränderungen der Zellausbeute über einzelne Proben subkutaner und mesenterialer Fettarterien extrem variabel. Daher wurden die Rohdaten auf die mittlere Fluoreszenzintensität von CD31+CD45− normalisiert, wobei davon ausgegangen wurde, dass diese Methode Chargenunterschiede korrigieren würde (Abbildung 4). Natürlich können je nach Ansatz anspruchsvollere statistische Analysen und Normalisierungsmethoden erforderlich sein.
Zusammenfassend stellt dieser Artikel eine Methode vor, um subkutane und mesenteriale Arterien von Mäusen zu sezieren, zu isolieren und zu verdauen, um die Expression und / oder Funktion von endothelialen Zielen von Interesse zu untersuchen. Mit Modifikationen des vorgestellten Protokolls können verschiedene Gefäßbetten und Zelltypen (z.B. glatte Muskelzellen) untersucht werden. Dieses Protokoll, als Grundlage für eine Vielzahl verfügbarer experimenteller Ansätze, hat das Potenzial, das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranzutreiben.

Endothelzellen sind für ihre wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen bekannt, einschließlich Barrierefunktionen, Angiogenese und Gefäßtonusregulation 1,2. Obwohl die Endothelzelldysfunktion bei der Förderung von Atherosklerose, Bluthochdruck, Diabetes usw. gut dokumentiert ist, sind die zugrunde liegenden Mechanismen, die die endotheliale Dysfunktion antreiben, nach wie vor schlecht verstanden und unterscheiden sich wahrscheinlich zwischen verschiedenen Gefäßbetten 2,3,4. Die Bemühungen, diese pathologischen Mechanismen der Endothelzelldysfunktion zu entschlüsseln, werden durch den begrenzten Zugang zu einer reinen Population von Endothelzellen aus Geweben und/oder die phänotypischen Veränderungen von Endothelzellen in Kultur 5,6 in Frage gestellt. Daher wird die Möglichkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben.
Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Sezierung von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe von Mäusen vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Funktionell lebensfähige Endothelzellen, die die Arterienwände auskleiden, werden mit einem spezifischen Enzymcocktail freigesetzt. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, die Bedingungen des Verdauungsprotokolls zu optimieren, um eine ausreichende Ausbeute an Endothelzellen aus <1 mg Ausgangsgewebe zu erhalten, während die biomolekularen Marker für die Analyse intakt bleiben. Als nächstes werden isolierte Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Das Vorhandensein von CD31 (PECAM) wird in erster Linie zur Identifizierung von Endothelzellen verwendet. Aufgrund der Expression von CD31 in anderen Zelltypen, darunter mehrere hämatopoetischen Ursprungs, die auch CD45 exprimieren, wurde die Reinheit der isolierten Endothelzellen durch den Ausschluss von Zellen, die sowohl CD31 als auch CD45exprimieren 5,6,7,8, weiter erhöht. Darüber hinaus sollten Forscher abhängig von der Forschungsfrage und den zu verwendenden nachgelagerten Anwendungen die Auswahl eines umfangreichen Panels positiver und negativer Selektionsmarker in Betracht ziehen, um die Reinheit der interessierenden Zellpopulation zu optimieren.
Obwohl die Technik der Sezierung und Isolierung von Fettdepotarterien in den früheren Publikationen 9,10,11,12,13 verwendet wurde, muss noch ein detailliertes Protokoll vorgelegt werden, das die Isolierung eingebetteter Arterien beschreibt. Die Demonstration der Technik zur Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten einer bestimmten Art von Interesse wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen. Die Tests können unter anderem Durchflusszytometrie zur Zellsortierung und Membranproteinexpression5,8, Elektrophysiologie zur Ionenkanalaktivität9, molekulares Profiling (Proteomik/genomische Analysen usw.) umfassen. 14,15 und die Erzeugung primärer Zelllinien für das Wirkstoffscreening in vitro16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 forceps (2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 forceps (2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For parenchymal adipose removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Bonn scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td>For isolation of mesenteric adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Bonn scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope with light source</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>Z230PT40</td>
			<td>For parenchymal adipose removal and artery isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestive enzymes for Artery Digestion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS004194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (Neutral Protease)</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS02110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0005</td>
			<td>145 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Solution, pH 7.30-7.40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>56 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0005</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Glutamate monohydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>G0188</td>
			<td>80 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-119-653</td>
			<td>0.75&#181;g/sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36-APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2519</td>
			<td>2.5&#181;g/ sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td>2.5&#181;g/ sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34955</td>
			<td>1&#181;L/sample</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of vascular endothelial cells from distinct adipose depots for downstream applications

Vaskuläre Endothelzellen, die die Wand des Gefäßsystems auskleiden, spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich der Regulierung des Gefäßtonus, der Barrierefunktionen und der Angiogenese. Die Endothelzelldysfunktion ist ein charakteristischer Prädiktor und ein wichtiger Treiber für das Fortschreiten schwerer kardiovaskulärer Erkrankungen, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch wenig verstanden. Die Fähigkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, wird einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben. Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Dissektion von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe der Maus vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Die isolierten Arterien werden dann mit einem spezifischen Cocktail von Verdauungsenzymen verdaut, die sich auf die Freisetzung funktionell lebensfähiger Endothelzellen konzentrieren. Das verdaute Gewebe wird mittels Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung von CD31+/CD45−-Zellen als Marker für die positive Identifizierung von Endothelzellen beurteilt. Zellen können für sofortige nachgeschaltete funktionelle Assays sortiert oder zur Erzeugung primärer Zelllinien verwendet werden. Die Technik der Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen.

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über den Workflow. Das Schema hebt die im Protokolltext näher beschriebenen Protokollschritte hervor. Abbildung 2 zeigt Bilder von subkutanem Fettgewebe (Abbildung 2A, links) nach Dissektion und einer subkutanen Arterienarkade (Abbildung 2A, rechts) nach Reinigung des Parenchymgewebes. Abbildung 2 zeigt auch das mesenteriale Fett (Abbildung 2B, links) nach der Dissektion und die mesenteriale arterielle Arkade (Abbildung 2B, rechts) nach der Reinigung des Parenchymgewebes.
Das hier vorgestellte Protokoll soll Forschern helfen, die möglicherweise daran interessiert sind, a) verschiedene Fettdepot-Gefäßbetten in grundlagenwissenschaftlichen Ansätzen und/oder Krankheitsmodellen zu vergleichen, b) die Verdauung von Gefäßbetten vor der Isolierung von Gefäßzellen von Interesse für die nachgeschaltete Anwendung und c) die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Gefäßzellen von Interesse (Abbildung 3 ) für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Proteinexpressionsanalysen, wie sie hier durchgeführt werden (Abbildung 4). Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für unseren Ansatz zur Identifizierung von Endothelzellen aus verdauten Mausarterien mittels Durchflusszytometrie. Zellpräparate, die aus verdauten subkutanen (Abbildung 3A) oder mesenterialen (Abbildung 3B) Fettarterien gewonnen wurden, wurden vor der Fixierung und Identifizierung lebensfähiger CD31+CD45−-Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie mit CD31-PE, CD45-FITC und einem Zelllebensfähigkeitsfarbstoff gefärbt, wie es in ähnlicher Weise an anderer Stelle durchgeführtwurde 8. Die Zelllebensfähigkeitsfärbung ermöglichte die Identifizierung nur der lebensfähigen Zellen, die das Isolierungs- und Verdauungsprotokoll vor der Fixierung überlebten. Die Verwendung dieser Methode wird es den Forschern ermöglichen, die Expression oder Funktion lebensfähiger Gefäßzellen von Interesse zu beurteilen.
Um festzustellen, ob Endothelzellen, die aus verschiedenen Fettdepotgefäßen isoliert wurden, Unterschiede in der Membranproteinexpression aufwiesen, wurden isolierte Zellen auf die Fettsäuretranslokase CD36 untersucht (Abbildung 4), da sich dieses Membranprotein kürzlich als essentiell für die endothelial vermittelte Verteilung von Fettsäuren an Gewebe erwiesenhat 22 . Daher kann die Bestimmung der relativen Expressionsunterschiede zwischen Membran-CD36, beispielsweise in verschiedenen Gefäßbetten, a) vorhandene Daten über die unterschiedliche Präferenz für die Fettsäureverwertung zwischen verschiedenen Geweben unterstützen und/oder b) potenzielle neue Unterschiede in der Gewebeverteilung von Fettsäuren in Gesundheit und Krankheit aufdecken. Aus den gleichen Präparaten verdauter Gefäßzellen, die in Abbildung 3 veranschaulicht sind, wurden CD31+CD45−CD36+-Endothelzellen im subkutanen (Abbildung 4A) und mesenterialen (Abbildung 4B) Fettgewebe identifiziert, und die CD36-Expression wurde in dieser Population in jedem Gefäßbett quantifiziert. Abbildung 4C und Abbildung 4D zeigen, dass sowohl der Prozentsatz der Endothelzellen, die CD36 exprimieren, als auch die Intensität der CD36-Expression in subkutanen Endothelzellen größer waren als in mesenterialen Endothelzellen. Diese vorläufigen Ergebnisse unterstützen die Verwendung unserer Methodik, um deutliche Unterschiede zwischen Gefäßbetten zu identifizieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsschema zur Isolierung von Endothelzellen aus subkutanem und viszeralem Fettgewebe für nachgeschaltete Anwendungen . (A)10-12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse wurden eingeschläfert und zur Demonstration dieses Verfahrens verwendet. (Bi) Zuerst wird das subkutane Fett entfernt. (Bii) Anschließend wird das mesenteriale (viszerale) Fettgewebe entfernt. Die weißen gestrichelten Linien zeigen die Lage der subkutanen (links) und mesenterialen (rechts) Fettdepots nach der Dissektion und Entfernung an. Die jeweiligen Arterien sind für nachgeschaltete Anwendungen isoliert. (C) In diesem Protokoll werden isolierte Arterien als nächstes mit einem spezifischen Enzymcocktail als erster Schritt zur Freisetzung funktionell lebensfähiger Endothelzellen verdaut. (D) Isolierte Endothelzellen werden identifiziert, indem vor der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung konjugierter Antikörper nach CD31+- und CD45−-Zellen gesucht wird. Zellen mit einem Expressionsprofil von CD31+/CD45− sind die Endothelzellen, die für weitere Analysen von Interesse sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig02.jpg"> Abbildung 2: Isoliertes subkutanes und viszerales Fettgewebe und entsprechende Arterien. (A) Links: Isoliertes "C-förmiges" subkutanes Fettgewebe aus den Hintergliedmaßen. Ein Hauptast der subkutanen Fettarterie, gekennzeichnet durch Pfeil (1), wird sichtbar, wenn parenchymales Fett entfernt wird. Rechts: Isolierte subkutane Fettarterien. (B) Links: Das mesenteriale (viszerale) Fettgewebe wird aus dem Darm isoliert. Rechts: Die jeweilige arterielle Arkade wird isoliert, indem das Parenchymgewebe entfernt wird. Zwischen den Bildern von Fett (5 mm) und Arterien (1 mm) werden unterschiedliche Schuppen verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig03.jpg"> Abbildung 3: Identifizierung von Endothelzellen nach arterieller Gewebeverdauung mittels Durchflusszytometrie. Repräsentative Diagramme, die Zellen zeigen, die aus isolierten (A) subkutanen oder (B) mesenterialen Fettarterien befreit wurden. Die Zellen wurden vor der Fixierung konjugierten Antikörpern ausgesetzt, die auf extrazelluläre Epitope von CD31 (PE) und CD45 (FITC) abzielten. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die CD31+CD45− Endothelzellpopulation zu identifizieren. Eine Zelllebensfähigkeitsfärbung wurde verwendet, um nur die Zellen auszuwählen, die die Isolierungs- und Verdauungsprotokolle für nachfolgende Analysen überlebten. Darüber hinaus wird eine geeignete Ansteuerung in diesem Stadium eine beabsichtigte Zellpopulation weiter von kontaminierenden Zellen trennen, sollte die Größe des interessierenden Zelltyps bekannt sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig04.jpg"> Abbildung 4: Analyse der CD36-Membranexpression in subkutanen vs. mesenterialen Fettarterienendothelzellen mittels Durchflusszytometrie. Repräsentative Populationsdiagramme und Histogramme, die die endotheliale CD36 (APC)-Membranexpression in (A) subkutanen oder (B) mesenterialen Fettarterien zeigen. (C) Prozentsatz der Endothelzellen (ECs), die CD36 in subkutanen vs. mesenterialen ECs exprimieren (n = 5, 3 Männer, 2 Frauen; *p < 0,05 nach dem studentischen t-Test). (D) Normalisierte EC-Membran-CD36-Expression in subkutanen vs. mesenterialen Fettarterien (n = 5, 3 Männer, 2 Frauen; *p < 0,05 nach dem studentischen t-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Dissektion von Maus-Fettdepots und zur Isolierung und Verdauung entsprechender Arterien, um die Endothelzellpopulation freizusetzen und dann zu identifizieren. Frisch isolierte Zellen, die in nachgeschalteten Anwendungen eingesetzt werden, werden das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranbringen.

Isolierung und Identifizierung vaskulärer Endothelzellen aus unterschiedlichen Fettdepots für Downstream-Anwendungen

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Dieses Protokoll ermöglicht es dem Forscher, die interessierende Arterie zu sezieren und Gefäßzellen zu isolieren, um eine breite Palette von Funktionstests durchzuführen. Forscher können verschiedene Gefäßbetten und Zelltypen untersuchen, um das Wissen über die Gefäßzellbiologie und den Mechanismus der vaskulären Dysfunktion zu erweitern. Diese Methode eignet sich am besten für Forscher, die die grundlegende vaskuläre Zellbiologie sowie die Dysfunktion vaskulärer Zellen in Tiermodellen von Krankheiten untersuchen.Besondere Sorgfalt sollte auf die Optimierung des Verdauungsprotokolls verwendet werden, insbesondere wenn sich die interessierenden Gefäßbetten von den hier vorgestellten unterscheiden. Um zu beginnen, sichern Sie die Maus mit Dissektionsstiften und besprühen Sie die ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut direkt über den Genitalien anzuheben, und machen Sie einen kleinen Schnitt von etwa zwei Millimetern in der Haut.Führen Sie die Spitze der Schere in die Inzisionsstelle ein und machen Sie einen vier bis fünf Zentimeter langen Mittellinienschnitt, der mit dem ersten Schnitt beginnt und kranial zur Basis des Brustbeins seziert. Machen Sie einen Einschnitt von einem Zentimeter, der seitlich von der Mittellinie unmittelbar unter der Vorderbein reicht. Machen Sie einen diagonalen Einschnitt von einem Zentimeter zwischen der Hinterbein und den Genitalien.Machen Sie kleine Schnitte entlang der Mittellinien-Hautschnitte, um das zugehörige Bindegewebe abzuziehen und das subkutane Fettdepot freizulegen. Identifizieren Sie das C-förmige subkutane Fettgewebe und die Arterie oder Vene, die senkrecht zur Bauchhöhle verläuft. Beginnen Sie von der Unterseite der C-Form in der Nähe der Genitalien und greifen Sie sanft das Fettgewebe, um das Bindegewebe freizulegen.Machen Sie kleine Schnitte im Bindegewebe, um das Fett von der Haut zu trennen, und vermeiden Sie, das freiliegende Gefäßsystem zu stören. Das Bindegewebe wird weiter seziert, bis das subkutane Fettgewebe intakt entfernt werden kann. Trennen Sie die freiliegende Arterie vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe.Lagern Sie das isolierte subkutane Fett im HEPES-Puffer auf Eis. Wiederholen Sie die Dissektion für das verbleibende hintere subkutane Fettdepot. Um das mesenteriale Fettdepot zu isolieren, verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die dünne Peritonealhöhlenwand über der Harnblase anzuheben, und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer geraden Schere.Heben Sie langsam die Peritonealhöhlenwand an und führen Sie die gerade Irisschere in die Inzisionsstelle ein. Machen Sie einen Schnitt von vier bis fünf Zentimetern von der Harnblase bis zum Brustbein. Machen Sie dann zwei horizontale Einschnitte von einem Zentimeter mit der geraden Irisschere, die sich seitlich von der Mittellinie bis unmittelbar über die Hinterbein und unter die Vordergliedmaße erstreckt.Verwenden Sie die Graefe-Pinzette, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen und die Peritonealeingeweide freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette Nummer fünf, um den Darm aus der Viszeralhöhle zu heben, um das mesenteriale Fett freizulegen. Verwenden Sie die gebogene Schere und die Zange Nummer fünf, um das Fett entlang des Dickdarms zu trennen, beginnend vom Blinddarm bis zum Abstieg des Dickdarms aus dem Blickfeld.Dann trennen Sie das Fett entlang des Dünndarms zur Bauchspeicheldrüse. Entfernen Sie einen kleinen Teil der Bauchspeicheldrüse, um das mesenteriale Fett vollständig zu isolieren. Lagern Sie das isolierte mesenteriale Fett im HEPES-Puffer auf Eis.Um die Arterien zu isolieren, übertragen Sie zuerst das Fettgewebe in eine Sezierschale, die 10 Milliliter kalten HEPES-Puffer enthält. Positionieren Sie unter einem Stereomikroskop das subkutane Fettgewebe, um das Arterienvenenpaar freizulegen. Positionieren Sie das viszerale Fettgewebe, um die Blumenkohlform und das jeweilige Arterienvenenpaar freizulegen.Verwenden Sie die Zange Nummer 55, um das parenchymale Fett vorsichtig aus der Arterie zu entfernen. Entfernen Sie kleine Fettstücke auf einmal, ohne das interessierende Gefäßsystem zu beschädigen. Fahren Sie fort, bis die Arterien vollständig frei von parenchymalem Fettgewebe sind.Verwenden Sie die Nummer fünf Pinzetten, um die gereinigten Arterien in einen neuen Schlauch mit frischem HEPES-Puffer zu übertragen, und halten Sie sie auf Eis, bis sie für die Verdauung bereit sind. Fügen Sie zuerst jeweils ein Milligramm Dispase und Elastase zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationslösung, Wirbel hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, bis sie vollständig aufgelöst sind.Verwenden Sie die Nummer fünf Pinzetten, um die gereinigten Arterien in die jeweiligen Probenröhrchen zu übertragen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde mit sanftem Rühren durch Inversion alle 10 bis 15 Minuten. In der Zwischenzeit fügen Sie ein Milligramm Kollagenase Typ eins pro Probe zu neuen Röhrchen hinzu.Lassen Sie nach der Inkubation die Arterien am Boden des Röhrchens absetzen und übertragen Sie 500 Mikroliter des Puffers von oben in die Kollagenase-haltigen Röhrchen. Vortex und geben Sie diese Lösung in die jeweiligen Probenröhrchen zurück. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.Stellen Sie sicher, dass sich die Arterien beim Schütteln des Probenröhrchens in Stücke trennen. Mit einer Glaspipette das verdaute Gewebe 10 bis 15 Mal kräftig trituieren, um die Zellen mechanisch zu dissoziieren. Führen Sie die aufgeschlossenen Proben durch ein 70-Mikron-Zellsieb oder ein Durchflusszytometrie-Röhrchensieb, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.Zentrifugieren Sie die einzellige Suspension und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 5% BSA für 30 Minuten. Fügen Sie einen Mikroliter Zelllebensfähigkeitsfärbung hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 Minuten.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS mit 1% BSA. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die an CD31 und CD45 konjugiert sind, und inkubieren Sie 15 Minuten lang auf einer Wippe im Kühlschrank. Waschen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter PBS mit 1% BSA direkt in die Zellsuspension geben.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern 1% Formaldehyd mit 0,1% BSA. Die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie für die Durchflusszytometrie bereit sind. Zellpräparate aus verdauten subkutanen Fettarterien wurden verwendet, um die Endothelzellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.CD31-positive CD45-negative Zellen wurden als Endothelzellen identifiziert. Die Zelllebensfähigkeitsfärbung ermöglichte die Identifizierung nur der lebensfähigen Zellen, die das Isolierungs- und Verdauungsprotokoll vor der Fixierung überlebten. Um die Unterschiede in der Membranproteinexpression und den Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepotgefäßen zu identifizieren, wurden die isolierten Zellen auf Fettsäuretranslokase CD36 untersucht.CD36-positive Endothelzellen wurden im subkutanen und mesenterialen Fettgewebe identifiziert. Die Quantifizierung der CD36-Expression und der subkutanen und mesenterialen Endothelzellen zeigte, dass sowohl der Prozentsatz der Endothelzellen, die CD36 exprimieren, als auch die Intensität der CD36-Expression in subkutanen Endothelzellen größer waren. Es ist wichtig, die Arterien sorgfältig zu sezieren, zu identifizieren und zu reinigen.Am wichtigsten ist, dass das Verdauungsprotokoll eine ausreichende Ausbeute an lebensfähigen Zellen für nachgelagerte Anwendungen liefert. Nach diesem Verfahren kann die isolierte Zellpopulation für Anwendungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Elektrophysiologie, molekulares Profiling und Generierung einer primären Zelllinie für das Arzneimittelscreening in vitro.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Forschung

Biologie

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...