Name: isolation and identification of vascular endothelial cells from distinct adipose depots for downstream applications
Uploaded: 2022-06-10T15:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications at JoVE.com

Em memória amorosa de Rich West, um brilhante cientista, colega e querido amigo. Gostaríamos de agradecer à Citometria de Fluxo da Universidade de Delaware e ao Núcleo de Bioimagem como parte do Instituto de Biotecnologia de Delaware por suas contribuições contínuas para nossos estudos. Também gostaríamos de agradecer a Emma Hudgins pela cuidadosa revisão e edição do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Este projeto também foi apoiado pelo programa Delaware INBRE, com uma bolsa do NIGMS (P20GM103446) dos Institutos Nacionais de Saúde e do Estado de Delaware (I.S. Fancher), e uma bolsa de Pesquisa da Universidade Geral de Delaware (I.S. Fancher). Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

O uso de animais nesses estudos foi aprovado pela Universidade de Delaware, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (# 1372).
1. Dissecção e limpeza de tecidos
NOTA: Ratos C57BL/6J de 10 a 12 semanas de idade são usados no protocolo de vídeo. Consulte a Figura 1 para obter o esquema e o resultado desejado da dissecção tecidual e da limpeza das artérias e consulte a Tabela de Materiais para obter a lista de suprimentos e informações sobre o fabricante.
<ol><li>Eutanasiar o rato por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical.</li>
	<li>Prenda o mouse usando pinos de dissecção e pulverize a superfície ventral com etanol a 70%.</li>
	<li>Isolamento dos tecidos adiposos subcutâneos localizados por cada membro posterior NOTA: Ferramentas de dissecação necessárias: tesoura reta Bonn (9 cm) e pinça Graefe curva e contundente.<ol><li>Use fórceps para levantar a pele logo acima dos genitais e fazer uma pequena incisão (2 mm) na pele.</li>
		<li>Insira a ponta da tesoura no local da incisão e faça uma incisão de 4-5 cm na linha média, começando na incisão inicial e dissecando cranialmente até a base do esterno. Seja cauteloso para não penetrar na cavidade abdominal.</li>
		<li>Faça uma incisão lateral de 1 cm, estendendo-se lateralmente a partir da linha média imediatamente abaixo do membro anterior.</li>
		<li>Faça uma incisão diagonal de 1 cm entre o membro posterior e os genitais.</li>
		<li>Faça pequenos cortes ao longo das incisões da pele da linha média para descascar o tecido conjuntivo associado e expor o depósito adiposo subcutâneo. Prenda a pele para baixo.</li>
		<li>Identifique o tecido adiposo subcutâneo "em forma de C" e a artéria/veia que corre perpendicularmente à cavidade abdominal.</li>
		<li>Comece a partir da parte inferior da forma C perto dos genitais e segure suavemente o tecido adiposo para expor os tecidos conjuntivos. Faça pequenos cortes no tecido conjuntivo para separar a gordura da pele. Evite perturbar a vasculatura exposta.</li>
		<li>Continue dissecando o tecido conjuntivo até que o tecido adiposo subcutâneo possa ser removido intacto. Separe cuidadosamente a artéria exposta do tecido conjuntivo circundante.</li>
		<li>Armazenar o adiposo subcutâneo isolado em tampão HEPES no gelo até que esteja pronto para isolar o leito vascular de interesse.</li>
		<li>Repita as etapas 1.3.3.-1.3.5. para o depósito adiposo subcutâneo posterior restante.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento do depósito adiposo mesentérico NOTA: Ferramentas de dissecação necessárias: tesoura reta Bonn (9 cm), pinça Graefe, um par de pinças #5, tesoura de íris reta e tesoura curva Bonn (9 cm).<ol><li>Use a pinça Graefe para levantar a parede fina da cavidade peritoneal acima da bexiga urinária e fazer uma pequena incisão usando tesoura reta.</li>
		<li>Levante lentamente a parede da cavidade peritoneal penetrada, insira cuidadosamente a tesoura reta da íris no local da incisão e faça uma incisão de 4-5 cm da bexiga urinária para o esterno.</li>
		<li>Faça duas incisões horizontais de 1 cm de comprimento com a tesoura reta da íris, estendendo-se lateralmente da linha média até imediatamente acima do membro posterior e abaixo do membro anterior. Use a pinça Graefe para descascar a musculatura abdominal e expor as vísceras peritoneais.</li>
		<li>Repita a etapa 1.4.3. do lado oposto.</li>
		<li>Use o par de pinça # 5 para levantar os intestinos para fora da cavidade visceral para revelar o adiposo mesentérico.</li>
		<li>Use a tesoura curva e a pinça #5 para separar o tecido adiposo ao longo do cólon, começando do ceco até onde o cólon desce da vista.</li>
		<li>Retorne ao ceco e use a tesoura curva e a pinça #5 para separar o tecido adiposo ao longo do intestino delgado até o pâncreas. Remova uma pequena parte do pâncreas para isolar completamente o tecido adiposo mesentérico. NOTA: A remoção de uma pequena parte do pâncreas, juntamente com o tecido adiposo mesentérico, pode ajudar na limpeza das artérias, pois proporciona estabilidade durante a limpeza.</li>
		<li>Armazenar o adiposo mesentérico isolado em tampão HEPES no gelo até que esteja pronto para isolar as artérias mesentéricas.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento das respectivas artérias dos tecidos adiposos subcutâneo e mesentérico NOTA: Ferramentas de dissecação necessárias: um prato de dissecação e estereoscópio com uma fonte de luz, um par de pinças #55 e um par de pinças #5.<ol><li>Coloque ~ 10 mL de tampão HEPES frio no prato dissecante e transfira o tecido adiposo para o prato usando a pinça # 5.</li>
		<li>Use o estereoscópio na ampliação de 1x para visualizar e posicionar o tecido adiposo para expor o(s) par(es) artéria/veia (Figura 2).</li>
		<li>Use a pinça #55 para remover cuidadosamente o tecido adiposo parenquimatoso da artéria. Remova pequenos pedaços de tecido adiposo de cada vez e observe cuidadosamente os pares artéria/veia sob o estereoscópio para identificar e evitar danificar a vasculatura de interesse. NOTA: Ajuste a ampliação e a fonte de luz de acordo para limpar as artérias. Aumente a ampliação e a intensidade da luz para ver melhor as artérias à medida que o tecido adiposo é removido. A limpeza fina das artérias deve ser feita sob ampliação de 4x-5x. É importante distinguir entre tecidos conjuntivos (colágenos), veias e artérias. Os tecidos conjuntivos e as fibras de colágeno têm uma aparência semelhante a uma corda, sem ramos, são estriados e têm uma cor esbranquiçada. Ao contrário das fibras colágenas e dos tecidos conjuntivos, as artérias e veias são transparentes e têm múltiplos ramos com um lúmen definido. Pequenas artérias e veias podem parecer semelhantes em aparência quando livres de tecido parenquimatoso. A presença de sangue no lúmen pode ainda ajudar a identificar as artérias das veias. As veias têm paredes de vasos sanguíneos mais finas e um lúmen maior e contêm mais sangue em comparação com artérias de tamanho comparável.</li>
		<li>Repita a etapa 1.5.3. até que as artérias estejam completamente vazias de tecido adiposo parenquimatoso.</li>
		<li>Use pinça # 5 para transferir as artérias limpas para um novo tubo com tampão HEPES fresco e manter no gelo até que esteja pronto para a digestão.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Digestão de artérias isoladas para isolamento de células endoteliais
NOTA: Consulte a Figura 2 para o esquema da digestão e isolamento tecidual das células endoteliais e a Tabela de Materiais para obter uma lista completa dos suprimentos necessários para o protocolo.
<ol><li>Adicionar 1 mg cada de dispase e elastase a cada tubo de microcentrífuga de 2 ml. Adicionar 2 ml de solução de dissociação a cada tubo. Vórtice e incubar a 37 °C até se dissolver completamente. Use pinça # 5 para transferir as artérias limpas (passo 1.5.5.) para os respectivos tubos de amostra. A concentração final de cada enzima é de 0,5 mg/mL.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 1 h com agitação suave por inversão a cada 10-15 min, de modo a que as artérias fiquem suspensas em solução para manter um contacto consistente e uniforme entre as enzimas e artérias.</li>
	<li>Pesar 1 mg de colagenase tipo I por amostra e adicioná-lo a novos tubos.</li>
	<li>Permita que as artérias se instalem no fundo do tubo. Remova 500 μL do tampão do topo sem perturbar as artérias e transfira-o para tubos designados contendo colagenase. Vórtice e devolver a solução às respectivas amostras nos tubos de amostra originais. A concentração final de colagenase tipo I é de 0,5 mg/mL.</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante 15 min. Certifique-se de que as artérias se separam em pedaços após uma breve agitação do tubo de amostra. Se as artérias não se separarem em pedaços após a perturbação, incube em incrementos de 5 minutos até que a degradação arterial seja visível.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro, triturar vigorosamente o tecido digerido 10x-15x para dissociar mecanicamente as células.</li>
	<li>Passar a solução e o tecido digerido através de um filtro celular de 70 μm ou de um filtro de tubo de citometria de fluxo para obter suspensões de célula única.</li>
</ol>3. Coloração das células endoteliais antes da citometria de fluxo
NOTA: A coloração e o processamento das células endoteliais são realizados no gelo para melhorar a viabilidade celular, a menos que instruído. Os tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL são centrifugados a 1.163 x g por 3 min à temperatura ambiente (RT).
<ol><li>Centrifugar as suspensões de célula única a 1.163 x g por 3 min em RT.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de PBS + BSA a 5% por 30 min no RT. NOTA: Os pesquisadores devem considerar o bloqueio dos receptores FC dependendo do tipo de célula, alvo de interesse e anticorpo utilizado18,19.</li>
	<li>Adicionar 1 μL de coloração de viabilidade celular (excitação de 405 nm) (Tabela de Materiais) e incubar no escuro por 30 min no RT.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 1.163 x g por 3 min no RT. Ressuspender o pellet celular em 200 μL de PBS + 1% BSA.</li>
	<li>Às amostras, adicionar anticorpos primários conjugados a CD31 (CD31-PE, 0,75 μg/amostra) e CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg/amostra) e incubar em um balancim na geladeira por 15 min após cobrir as amostras com papel alumínio. NOTA: Para identificar e/ou obter uma população pura de células endoteliais, sondar CD31 e CD45 usando anticorpos primários conjugados com CD31 e CD45 com fluorescência de excitação/emissão distintas e células gate/sort com um perfil de expressão CD31+CD45−. A compensação pode ser necessária dependendo dos fluoróforos utilizados 18,20,21.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA diretamente à suspensão celular.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 1.163 x g por 3 min no RT. Retirar o sobrenadante e ressuspender em 200 μL de formaldeído a 1% com BSA a 0,1%. Armazenar na geladeira coberta com papel alumínio até ficar pronto para a citometria de fluxo. NOTA: Os rendimentos das células são melhorados reduzindo as etapas de lavagem e centrifugação. Estes podem precisar ser alterados dependendo da abordagem do resultado. A amostra em fixador deve ser analisada em até 24 h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kr&#252;ger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+biology:+An+update.">Vascular endothelial cell biology: An update.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).</li><li>Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice.">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> The Korean Journal of Physiology &amp; Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).</li><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. 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Os autores não têm conflitos de interesse.

A disfunção endotelial é precursora de estados graves da doença, provavelmente impulsionando o desenvolvimento de aterosclerose, hipertensão e acidente vascular cerebral 3,23. Embora os mecanismos identificados subjacentes à disfunção endotelial em uma determinada condição patológica sejam muitos, leitos vasculares distintos provavelmente serão diferencialmente influenciados por condições patológicas 4,24. Além disso, diferentes fatores de risco cardiovascular (por exemplo, obesidade, hipertensão, dislipidemia, tabagismo, diabetes) induzem disfunção por meio de uma variedade de mecanismos distintos23,25. Portanto, é fundamental isolar populações de células endoteliais de modelos animais estabelecidos de doença ou tecido humano acessível e realizar ensaios em células imediatamente removidas do ambiente in vivo. O isolamento de células dessa maneira tem uma vantagem única sobre o estudo de células em cultura, na medida em que elas são vazias de alterações fenotípicas induzidas pela cultura 5,6. Além disso, a inclusão de uma população heterogênea de células endoteliais, como observado in vivo 26,27 (e que pode ser separada ainda mais usando a classificação celular assistida por fluxo), de um organismo vivo informa melhor o ambiente in vivo. Finalmente, este método é aplicável à investigação de numerosos modelos animais e tecidos potencialmente humanos e pode ser usado para gerar linhagens de cultura celular primária, se tal necessidade for justificada.
A etapa crítica deste protocolo, e a etapa que mais precisará de ajustes para diferentes leitos vasculares ou tipos de células não apresentados aqui, é a digestão do tecido vascular. Esta etapa deve ser otimizada para a saúde celular sem diminuir o rendimento celular. As enzimas específicas utilizadas e a duração da digestão são fundamentais para otimizar a saúde celular e o rendimento para poder realizar adequadamente os ensaios a jusante. Para a identificação da expressão de membrana de CD36, detectada por citometria de fluxo em células endoteliais subcutâneas e mesentéricas (Figura 4), foi desenvolvida uma versão modificada do protocolo de digestão originalmente projetado para a eletrofisiologia patch-clamp28 . Isso incluiu uma extensão do tempo de digestão da colagenase I para 30 minutos para aumentar o rendimento celular para melhor atender às demandas de citometria de fluxo versus o que é necessário para estudos de patch-clamp. Como essa modificação pode afetar a saúde celular até certo ponto, uma coloração de viabilidade celular foi utilizada nas análises de citometria de fluxo para garantir que apenas células endoteliais viáveis fossem avaliadas seguindo esse protocolo (Figura 3). Recomenda-se que os estudos destinados a isolar células do tecido vascular incluam um marcador de viabilidade celular antes de avaliar a abordagem desejada.
O protocolo descrito é suficiente para liberar células endoteliais viáveis para análise e aplicações a jusante de amostras arteriais de ≤1 mg derivadas de camundongos; no entanto, se as artérias de interesse fossem isoladas de diferentes tecidos ou organismos (por exemplo, humanos) que resultariam em massas arteriais significativamente diferentes, seria necessário otimizar o conteúdo de enzimas de digestão e a duração da incubação para isolar eficientemente a população celular de interesse. Para alguns leitos vasculares que começam com quantidades ainda menores de tecido inicial do que os leitos subcutâneos e mesentéricos apresentados aqui (por exemplo, artérias coronárias), o agrupamento de artérias de vários camundongos pode ser necessário por amostra. De fato, este pode ser um passo necessário para qualquer leito vascular, uma vez que a abordagem de resultado requer um rendimento celular relativamente alto. Uma grande limitação é que, devido à natureza das variações por digestão da amostra, os rendimentos celulares às vezes podem ser significativamente diferentes entre os lotes, mesmo quando do mesmo leito vascular. Isso pode causar problemas ao analisar dados e deve ser contabilizado por meio da normalização, quando apropriado. Por exemplo, a expressão de CD36 foi extremamente variável nos dados brutos devido a alterações nos rendimentos celulares em amostras individuais de artérias adiposas subcutâneas e mesentéricas. Portanto, os dados brutos foram normalizados para a intensidade média de fluorescência CD31+CD45− com a suposição de que esse método corrigiria as diferenças de lote (Figura 4). É claro que, dependendo da abordagem, análises estatísticas mais sofisticadas e métodos de normalização podem ser necessários.
Em resumo, este trabalho apresenta um método para dissecar, isolar e digerir artérias subcutâneas e mesentéricas de camundongos para investigar a expressão e/ou função de alvos endoteliais de interesse. Com modificações no protocolo apresentado, diferentes leitos vasculares e tipos de células (por exemplo, células musculares lisas) podem ser investigados. Este protocolo, como base para uma infinidade de abordagens experimentais disponíveis, tem o potencial de avançar a compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

As células endoteliais são bem reconhecidas por seus papéis importantes em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo funções de barreira, angiogênese e regulação do tônus vascular 1,2. Embora a disfunção das células endoteliais esteja bem documentada na promoção da aterosclerose, hipertensão, diabetes, etc., os mecanismos subjacentes que impulsionam a disfunção endotelial permanecem pouco compreendidos e provavelmente diferem entre leitos vasculares distintos 2,3,4. O esforço para desvendar esses mecanismos patológicos de disfunção das células endoteliais é desafiado pelo acesso limitado a uma população pura de células endoteliais a partir de tecidos e/ou pelas alterações fenotípicas das células endoteliais em cultura 5,6. Portanto, ser capaz de isolar e realizar análises em células endoteliais de vários leitos vasculares em sua forma nativa dará uma visão sobre os processos de doença cardiovascular.
Este protocolo apresenta o procedimento de dissecação dos tecidos adiposos subcutâneo e mesentérico de camundongos, seguido do isolamento de suas respectivas vasculaturas arteriais. Células endoteliais funcionalmente viáveis que revestem as paredes arteriais são liberadas usando um coquetel específico de enzimas. Cuidados especiais foram tomados para otimizar as condições do protocolo de digestão para obter um rendimento suficiente de células endoteliais a partir de <1 mg de tecido inicial, mantendo os marcadores biomoleculares intactos para análise. As células endoteliais isoladas são identificadas em seguida usando citometria de fluxo. A presença de CD31 (PECAM) é usada principalmente para identificar células endoteliais. Devido à expressão de CD31 em outros tipos celulares, incluindo várias de origem hematopoiética que também expressam CD45, a pureza das células endoteliais isoladas foi ainda aumentada pela exclusão de células que expressam CD31 e CD45 5,6,7,8. Além disso, dependendo da questão de pesquisa e das aplicações a jusante a serem empregadas, os pesquisadores devem considerar a seleção de um extenso painel de marcadores de seleção positivos e negativos para otimizar a pureza da população celular de interesse.
Embora a técnica de dissecação e isolamento de artérias adiposas tenha sido utilizada nas publicações anteriores 9,10,11,12,13, um protocolo detalhado descrevendo o isolamento de artérias embutidas ainda não foi apresentado. Demonstrar a técnica para o isolamento e digestão de artérias de diferentes leitos vasculares de uma determinada espécie de interesse fornecerá opções para os pesquisadores avaliarem células vasculares recém-isoladas de artérias de interesse e permitir-lhes realizar uma ampla gama de testes funcionais em tipos específicos de células. Os testes podem incluir, mas não estão limitados a, citometria de fluxo para classificação celular e expressão de proteínas de membrana5,8, eletrofisiologia para atividade de canais iônicos9, perfil molecular (análises proteômicas/genômicas, etc.) 14,15 e a geração de linhagens celulares primárias para triagem de fármacos in vitro16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue dissection tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 forceps (2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 forceps (2)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For parenchymal adipose removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Bonn scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td>For isolation of mesenteric adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Bonn scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope with light source</td>
			<td>Laxco</td>
			<td>Z230PT40</td>
			<td>For parenchymal adipose removal and artery isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestive enzymes for Artery Digestion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS004194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase (Neutral Protease)</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS02110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Wothington-BioChem</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0005</td>
			<td>145 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation Solution, pH 7.30-7.40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>56 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0005</td>
			<td>55 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Glutamate monohydrate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>G0188</td>
			<td>80 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-119-653</td>
			<td>0.75&#181;g/sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD36-APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2519</td>
			<td>2.5&#181;g/ sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103108</td>
			<td>2.5&#181;g/ sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34955</td>
			<td>1&#181;L/sample</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of vascular endothelial cells from distinct adipose depots for downstream applications

As células endoteliais vasculares que revestem a parede do sistema vascular desempenham papéis importantes em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo regulação do tônus vascular, funções de barreira e angiogênese. A disfunção das células endoteliais é um preditor característico e um dos principais impulsionadores da progressão de doenças cardiovasculares graves, mas os mecanismos subjacentes permanecem pouco compreendidos. A capacidade de isolar e realizar análises em células endoteliais de vários leitos vasculares em sua forma nativa dará uma visão sobre os processos de doenças cardiovasculares. Este protocolo apresenta o procedimento para a dissecção dos tecidos adiposos subcutâneo e mesentérico de camundongos, seguido do isolamento de suas respectivas vasculaturas arteriais. As artérias isoladas são então digeridas usando um coquetel específico de enzimas digestivas focadas na liberação de células endoteliais funcionalmente viáveis. O tecido digerido é avaliado por análise de citometria de fluxo utilizando células CD31+/CD45− como marcadores para identificação positiva de células endoteliais. As células podem ser classificadas para ensaios funcionais imediatos a jusante ou usadas para gerar linhas celulares primárias. A técnica de isolar e digerir artérias de diferentes leitos vasculares fornecerá opções para os pesquisadores avaliarem células vasculares recém-isoladas de artérias de interesse e permitir que eles realizem uma ampla gama de testes funcionais em tipos específicos de células.

Um esquema do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1. O esquema destaca as etapas do protocolo descritas com mais detalhes no texto do protocolo. A Figura 2 mostra imagens de tecido adiposo subcutâneo (Figura 2A, esquerda) após dissecção e uma arcada arterial subcutânea (Figura 2A, direita) após limpeza do tecido parenquimatoso. A Figura 2 também mostra o tecido adiposo mesentérico (Figura 2B, à esquerda) após a dissecção e a arcada arterial mesentérica (Figura 2B, à direita) após a limpeza do tecido parenquimatoso.
O protocolo aqui apresentado destina-se a auxiliar pesquisadores potencialmente interessados em a) comparar leitos distintos de vasculatura de depósitos adiposos em abordagens científicas básicas e/ou modelos de doenças, b) a digestão de leitos vasculares antes do isolamento de células vasculares de interesse para aplicação a jusante e c) o uso de citometria de fluxo para identificar células vasculares de interesse (Figura 3 ) para uma variedade de aplicações, incluindo, mas não se limitando a, análises de expressão de proteínas, conforme realizado aqui (Figura 4). A Figura 3 detalha um exemplo de nossa abordagem para identificar células endoteliais de artérias de camundongos digeridas usando citometria de fluxo. As preparações celulares obtidas de artérias adiposas subcutâneas digeridas (Figura 3A) ou mesentéricas (Figura 3B) foram coradas com CD31-PE, CD45-FITC e corante de viabilidade celular antes da fixação e identificação de células endoteliais CD31+CD45− viáveis por citometria de fluxo, como similarmente realizado em outros lugares8. A coloração de viabilidade celular permitiu a identificação apenas das células viáveis que sobreviveram ao protocolo de isolamento e digestão antes da fixação. O uso deste método permitirá que os pesquisadores avaliem a expressão ou função de células vasculares viáveis de interesse.
Para determinar se as células endoteliais isoladas de vasculatura distinta do depósito adiposo exibiam diferenças na expressão proteica da membrana, células isoladas foram sondadas para a translocase de ácidos graxos, CD36 (Figura 4), uma vez que esta proteína de membrana mostrou-se recentemente essencial na distribuição de ácidos graxos mediada endotelial para os tecidos22 . Portanto, determinar as diferenças de expressão relativa entre os CD36 da membrana, por exemplo, em leitos vasculares distintos pode a) apoiar os dados existentes sobre a preferência diferencial pela utilização de ácidos graxos entre diferentes tecidos e/ou b) revelar potenciais novas diferenças na distribuição tecidual de ácidos graxos na saúde e na doença. A partir das mesmas preparações de células vasculares digeridas exemplificadas na Figura 3, foram identificadas células endoteliais CD31+CD45−CD36+ em tecido adiposo subcutâneo (Figura 4A) e mesentérico (Figura 4B), e a expressão de CD36 foi quantificada nessa população em cada leito vascular. A Figura 4C e a Figura 4D revelam que tanto a porcentagem de células endoteliais expressando CD36 quanto a intensidade de expressão de CD36 foram maiores nas células endoteliais subcutâneas em comparação com a observada nas células endoteliais mesentéricas. Esses achados preliminares apoiam o uso de nossa metodologia para identificar diferenças distintas entre leitos vasculares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de trabalho para isolar células endoteliais dos tecidos adiposos subcutâneo e visceral para aplicações a jusante . (A)camundongos C57BL/6J de 10-12 semanas de idade foram eutanasiados e utilizados para demonstrar esse procedimento. (Bi) Primeiro, o tecido adiposo subcutâneo é removido. (Bii) Em seguida, o tecido adiposo mesentérico (visceral) é subsequentemente removido. As linhas tracejadas brancas indicam a localização dos depósitos adiposos subcutâneos (esquerda) e mesentérica (direita) após a dissecção e remoção. As respectivas artérias são isoladas para aplicações a jusante. (C) Neste protocolo, as artérias isoladas são digeridas em seguida usando um coquetel enzimático específico como primeiro passo na liberação de células endoteliais funcionalmente viáveis. (D) As células endoteliais isoladas são identificadas por sondagem de células CD31+ e CD45− usando anticorpos conjugados antes da análise da citometria de fluxo. Células com um perfil de expressão de CD31+/CD45− são as células endoteliais de interesse para análises adicionais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig02.jpg"> Figura 2: Tecidos adiposos subcutâneos e viscerais isolados e respectivas artérias. (A) Esquerda: Tecido adiposo subcutâneo isolado em forma de C dos membros posteriores. Um ramo importante da artéria adiposa subcutânea, denotado por seta (1), é revelado quando o tecido adiposo parenquimatoso é removido. Direita: Artérias adiposas subcutâneas isoladas. (B) Esquerda: O tecido adiposo mesentérico (visceral) é isolado do intestino. Direita: A respectiva arcada arterial é isolada através da remoção do tecido parenquimatoso. Diferentes escalas são utilizadas entre as figuras de adiposo (5 mm) e artérias (1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig03.jpg"> Figura 3: Identificação de células endoteliais após digestão do tecido arterial via citometria de fluxo. Gráficos representativos mostrando células liberadas de artérias adiposas isoladas (A) subcutâneas ou (B) mesentéricas. As células foram expostas a anticorpos conjugados que tinham como alvo epítopos extracelulares de CD31 (PE) e CD45 (FITC) antes da fixação. A citometria de fluxo foi utilizada para identificar a população de células endoteliais CD31+CD45−. Uma coloração de viabilidade celular foi utilizada para selecionar apenas as células que sobreviveram aos protocolos de isolamento e digestão para análises subsequentes. Além disso, o confinamento adequado nesta fase separará ainda mais uma população celular pretendida das células contaminantes, caso o tamanho do tipo de célula de interesse seja conhecido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63999/63999fig04.jpg"> Figura 4: Análise da expressão da membrana CD36 em células endoteliais da artéria adiposa subcutânea vs. mesentérica via citometria de fluxo. Gráficos populacionais representativos e histogramas mostrando a expressão da membrana CD36 endotelial (APC) nas artérias adiposas (A) subcutânea ou (B) mesentérica. (C) Porcentagem de células endoteliais (CE) expressando CD36 em CEs subcutâneas vs. mesentéricas (n = 5, 3 homens, 2 mulheres; *p < 0,05 após o teste t de Student). (D) Expressão normalizada de CD36 da membrana EC nas artérias adiposas subcutâneas vs. mesentéricas (n = 5, 3 homens, 2 mulheres; *p < 0,05 após o teste t de Student). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63999/63999fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Este protocolo permitirá ao pesquisador dissecar artérias de interesse e isolar células vasculares para realizar uma ampla gama de testes funcionais. O pesquisador pode investigar diferentes leitos vasculares e tipo de célula para expandir o conhecimento da biologia celular vascular e do mecanismo da disfunção vascular. Este método é mais aplicável a pesquisadores que investigam a biologia celular vascular básica, bem como a disfunção celular vascular em modelos animais de doença.Cuidados especiais devem ser tomados para otimizar o protocolo de digestão, especialmente quando os leitos vasculares de interesse diferem dos aqui apresentados. Para começar, prenda o mouse usando pinos de dissecção e pulverize a superfície ventral com etanol a 70%. Use fórceps para levantar a pele logo acima dos órgãos genitais e faça uma pequena incisão de aproximadamente dois milímetros na pele.Insira a ponta da tesoura no local da incisão e faça uma incisão de quatro a cinco centímetros de comprimento na linha média, começando na incisão inicial e dissecando cranialmente até a base do esterno. Faça uma incisão de um centímetro que se estenda lateralmente a partir da linha média imediatamente abaixo do membro dianteiro. Faça uma incisão diagonal de um centímetro entre o membro posterior e os genitais.Faça pequenos cortes ao longo das incisões da pele da linha média para descascar o tecido conjuntivo associado e expor o depósito adiposo subcutâneo. Identifique o tecido adiposo subcutâneo em forma de C e a artéria ou veia que corre perpendicularmente à cavidade abdominal. Comece a partir da parte inferior da forma de C perto dos órgãos genitais e segure suavemente o tecido adiposo para expor os tecidos conjuntivos.Faça pequenos cortes no tecido conjuntivo para separar a gordura da pele e evite perturbar a vasculatura exposta. Continue dissecando o tecido conjuntivo até que o tecido adiposo subcutâneo possa ser removido intacto. Separe cuidadosamente a artéria exposta do tecido conjuntivo circundante.Armazenar o adiposo subcutâneo isolado no tampão HEPES no gelo. Repita a dissecção para o depósito adiposo subcutâneo posterior restante. Para isolar o depósito adiposo mesentérico, use Graefe Forceps para levantar a fina parede da cavidade peritoneal acima da bexiga urinária e faça uma pequena incisão usando uma tesoura reta.Levante lentamente a parede da cavidade peritoneal e insira a tesoura reta da íris no local da incisão. Faça uma incisão de quatro a cinco centímetros da bexiga urinária até o esterno. Em seguida, faça duas incisões horizontais de um centímetro com a tesoura reta da íris estendendo-se lateralmente da linha média até imediatamente acima do membro posterior e abaixo do membro dianteiro.Use a pinça Graefe para descascar a musculatura abdominal e expor as vísceras peritoneais. Use um par de pinças número cinco para levantar os intestinos para fora da cavidade visceral para revelar o tecido adiposo mesentérico. Use a tesoura curva e a pinça número cinco para separar o tecido adiposo ao longo do cólon, começando do ceco até onde o cólon desce da vista.Em seguida, separe o tecido adiposo ao longo do intestino delgado para o pâncreas. Remova uma pequena parte do pâncreas para isolar completamente o tecido adiposo mesentérico. Armazenar o adiposo mesentérico isolado no tampão HEPES no gelo.Para isolar as artérias, primeiro transfira o tecido adiposo para um prato dissecante contendo 10 mililitros de tampão HEPES frio. Sob um microscópio estéreo, posicione o tecido adiposo subcutâneo para expor o par de veias arteriais. Posicione o tecido adiposo visceral para expor a forma da couve-flor e o respectivo par de veias arteriais.Use o número 55 fórceps para remover cuidadosamente o tecido adiposo parenquimatoso da artéria. Remova pequenos pedaços de tecido adiposo de cada vez sem danificar a vasculatura de interesse. Continue até que as artérias estejam completamente vazias de tecido adiposo parenquimatoso.Use a pinça número cinco para transferir as artérias limpas para um novo tubo com tampão HEPES fresco e mantenha-se no gelo até que esteja pronto para a digestão. Primeiro, adicione um miligrama cada de dispase e elastase a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Adicione dois mililitros de solução de dissociação, vórtice, e incube a 37 graus Celsius até dissolver completamente.Use a pinça número cinco para transferir as artérias limpas para os respectivos tubos de amostra. Incubar os tubos a 37 graus Celsius durante uma hora com agitação suave por inversão a cada 10 a 15 minutos. Enquanto isso, adicione um miligrama de colagenase tipo um por amostra a novos tubos.Após a incubação, deixe as artérias se instalarem na parte inferior do tubo e transfira 500 microlitros do tampão do topo para os tubos contendo colagenase. Vórtice e devolver esta solução aos respectivos tubos de amostragem. Incubar as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.Certifique-se de que as artérias se separam em pedaços ao agitar o tubo de amostra. Usando uma pipeta de vidro, triturar vigorosamente o tecido digerido 10 a 15 vezes para dissociar mecanicamente as células. Passar as amostras digeridas através de um filtro de células de 70 mícrons ou de um filtro de tubo de citometria de fluxo para obter suspensões de célula única.Centrifugar a suspensão de célula única e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet celular em um mililitro de PBS com 5% BSA por 30 minutos. Adicione um microlitro de mancha de viabilidade celular e incube no escuro por 30 minutos.Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet celular em 200 microlitros de PBS com 1%BSA. Adicione anticorpos primários conjugados a CD31 e CD45 e incube em um balancim na geladeira por 15 minutos. Lave as células adicionando um mililitro de PBS com 1% de BSA diretamente à suspensão celular.Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em 200 microlitros de formaldeído a 1% com BSA a 0,1%. Cubra os tubos com papel alumínio e guarde no frigorífico até estar pronto para a citometria de fluxo. Preparações celulares obtidas de artérias adiposas subcutâneas digeridas foram utilizadas para identificar as populações de células endoteliais por citometria de fluxo.Células CD31 CD31 positivas CD45 negativas foram identificadas como células endoteliais. A coloração de viabilidade celular permitiu a identificação apenas das células viáveis que sobreviveram ao protocolo de isolamento e digestão antes da fixação. Para identificar as diferenças na expressão de proteínas de membrana e células endoteliais de vasculatura distinta de depósito adiposo, as células isoladas foram sondadas para translocase de ácidos graxos CD36.Células endoteliais CD36 positivas foram identificadas no tecido adiposo subcutâneo e mesentérico. A quantificação da expressão de CD36 e das células endoteliais subcutâneas e mesentéricas revelou que tanto a porcentagem de células endoteliais expressando CD36 quanto a intensidade de expressão de CD36 foram maiores nas células endoteliais subcutâneas. É crucial dissecar, identificar e limpar cuidadosamente as artérias.Mais importante ainda, o protocolo de digestão deve produzir um rendimento suficiente de células viáveis para aplicações a jusante. Após este procedimento, a população de células isoladas pode ser usada para aplicações, incluindo, mas não se limitando a, eletrofisiologia, perfil molecular e geração de linhagem celular primária para triagem de drogas in vitro.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...