Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

نود أن نشكر دينيس لافونتين على تطوير البروتوكول وسيرجي فينيف على المساعدة المعلوماتية الحيوية. تم دعم هذا العمل بمنحة من برنامج 4D Nucleome التابع للصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة إلى JD (U54-DK107980 ، UM1-HG011536). جي دي هو محقق في معهد هوارد هيوز الطبي.
تخضع هذه المقالة لسياسة الوصول المفتوح إلى المنشورات الخاصة ب HHMI. منح رؤساء مختبرات HHMI سابقا ترخيص CC BY 4.0 غير حصري للجمهور وترخيص من الباطن ل HHMI في مقالاتهم البحثية. وفقا لهذه التراخيص، يمكن إتاحة مخطوطة هذه المقالة المقبولة من قبل المؤلف مجانا بموجب ترخيص CC BY 4.0 فور نشرها.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

الخطوات الحاسمة للتعامل مع الخلايا على الرغم من أنه من الممكن استخدام عدد أقل من خلايا الإدخال ، فقد تم تحسين هذا البروتوكول ل ~ 5 × 106 خلايا لكل حارة تسلسل (~ 400 M قراءة) لضمان التعقيد المناسب بعد التسلسل العميق. من الأفضل حساب الخلايا قبل التثبيت. لإنشاء مكتبات فائقة العمق ، نضرب بشكل عام عدد الممرات (والخلايا) حتى يتم الوصول إلى عمق القراءة المطلوب. للتثبيت الأمثل ، يجب استبدال الوسط المحتوي على المصل ب PBS قبل تثبيت FA ، ويجب إضافة المحاليل المثبتة على الفور وبدون تدرجات تركيز15,22. بالنسبة لحصاد الخلايا ، يفضل الكشط على التربسين ، لأن الانتقال من الشكل المسطح إلى الشكل الكروي بعد التربسين يمكن أن يؤثر على التشكل النووي. بعد إضافة DSG ، تضيع كريات الخلايا السائبة والمتكتلة بسهولة. كن حذرا عند التعامل مع الخلايا في هذه المرحلة وأضف ما يصل إلى 0.05٪ BSA لتقليل التكتل.
تعديلات على الطريقة تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام الخلايا البشرية17. ومع ذلك ، بناء على الخبرة في التقاط تكوين الكروموسوم ، يجب أن يعمل هذا البروتوكول مع معظم الخلايا حقيقية النواة. للحصول على مدخلات أقل بكثير (~ 1 × 106 خلايا) ، ننصح باستخدام نصف وحدات التخزين لإجراءات التحلل والتقاط التشكيل [الخطوات 2.1-2.4]. سيسمح هذا أيضا بإجراء عزل الحمض النووي [الخطوة 2.5] في جهاز طرد مركزي منضدية مع أنابيب سعة 1.7 مل ، مما قد يحسن التكوير لتركيزات الحمض النووي المنخفضة. سيشير القياس الكمي للحمض النووي (الخطوة 2.6.6) إلى كيفية المضي قدما. بالنسبة للكميات المنخفضة من الحمض النووي المعزول (1-5 ميكروغرام) ، نقترح تخطي اختيار الحجم (الخطوة 3.3) والمضي قدما في إزالة البيوتين بعد تقليل الحجم من 130 ميكرولتر إلى ~ 45 ميكرولتر باستخدام CFU.
تم تطوير هذا البروتوكول خصيصا لضمان بيانات عالية الجودة بعد التشابك اللاحق مع FA و DSG والهضم مع DpnII و DdeI. ومع ذلك ، فإن استراتيجيات التشابك البديلة مثل FA متبوعة ب EGS (إيثيلين جلايكول مكرر (سكسينيميديل سكسينات)) ، والتي تستخدم أيضا في ChIP-seq23 و ChIA-PET24 ، قد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة17. وبالمثل ، يمكن استخدام تركيبات إنزيمية مختلفة ، مثل DpnII و HinfI18 أو MboI و MseI و NlaIII19 للهضم. عند تكييف مجموعات الإنزيم ، تأكد من استخدام النيوكليوتيدات البيوتينيل التي يمكنها ملء الأجزاء المتدلية المحددة بطول 5 بوصات واستخدام أفضل المخازن المؤقتة لكل كوكتيل. يأتي DpnII مع المخزن المؤقت الخاص به وتوصي الشركة المصنعة للإنزيم بمخزن مؤقت محدد لهضم DdeI. ومع ذلك ، بالنسبة للهضم المزدوج مع DpnII و DdeI في هذا البروتوكول ، يوصى باستخدام Restriction Buffer لأنه مصنف بنشاط 100٪ لكلا الإنزيمين.
استكشاف أخطاء التقاط التشكل وإصلاحها تم تنفيذ الخطوات الرئيسية الثلاث في التقاط التشكل الكروموسومي: التشابك ، والهضم ، والربط قبل أن يتم تصور النتائج على الهلام. لتحديد جودة كل خطوة من هذه الخطوات الثلاث وتمييز المكان الذي يمكن أن تنشأ فيه المشاكل ، يتم أخذ القسمة قبل (CI) وبعد الهضم (DC) وتحميلها على الجل جنبا إلى جنب مع عينة Hi-C المربوطة (الشكل 2). يستخدم هذا الجل لتحديد جودة عينة Hi-C وما إذا كان الأمر يستحق الاستمرار في البروتوكول. بدون CI و DC ، من الصعب تحديد الخطوة (الخطوات) المحتملة دون المستوى الأمثل. تجدر الإشارة إلى أن الربط دون المستوى الأمثل قد يكون بسبب مشكلة في الربط نفسه ، أو التعبئة ، أو مشكلة في الربط المتشابك. لاستكشاف أخطاء الارتباط المتشابك وإصلاحها ، تأكد من عدم استخدام أكثر من 1 × 107 خلايا لكل مكتبة وابدأ بكواشف ربط جديدة وخلايا نظيفة (أي شطفها باستخدام PBS). للربط ، تأكد من حفظ الخلايا وخليط الربط على الجليد. أضف T4 DNA ligase قبل حضانة 4 ساعات عند 16 درجة مئوية واخلطه جيدا.
استكشاف أخطاء إعداد المكتبة وإصلاحها إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من 10 دورات PCR أو لا يمكن رؤية منتج PCR على الجل بعد معايرة PCR (الشكل 4) ، فهناك بعض الخيارات لحفظ عينة Hi-C. بالعودة من معايرة PCR ، فإن الخيار الأول هو تجربة PCR مرة أخرى. إذا كان لا يزال هناك منتج غير كاف ، فمن الممكن تجربة جولة أخرى من ربط الذيل والمحول (الخطوة 3.6) بعد غسل الخرز مرتين باستخدام 1x TLE buffer. بعد هذا الربط الإضافي للذيل A والمحول، يمكن للمرء المتابعة إلى معايرة تفاعل البوليميراز المتسلسل كما كان من قبل. إذا لم يكن هناك منتج حتى الآن ، فإن الخيار الأخير هو صدى الكسر 0.8x من الخطوة 3.3 والمتابعة من هناك.
حدود ومزايا Hi-C3.0 من المهم أن ندرك أن Hi-C هي طريقة قائمة على السكان تلتقط متوسط تكرار التفاعلات بين أزواج المواقع في مجتمع الخلية. تم تصميم بعض التحليلات الحسابية لفصل مجموعات المطابقات عن السكان25 ، ولكن من حيث المبدأ ، فإن Hi-C أعمى عن الاختلافات بين الخلايا. على الرغم من أنه من الممكن إجراء Hi-C 26,27 أحادي الخلية ويمكن إجراء الاستدلالات الحسابية28 ، إلا أن Hi-C أحادي الخلية غير مناسب للحصول على معلومات 3C فائقة الدقة. هناك قيد إضافي على Hi-C وهو أنه يكتشف فقط التفاعلات الزوجية. للكشف عن تفاعلات جهات الاتصال المتعددة ، يمكن للمرء إما استخدام قواطع متكررة مقترنة بتسلسل القراءة القصيرة (Illumina)16 أو إجراء اتصالات متعددة 3C29 أو 4C30 ، باستخدام تسلسل القراءة الطويلة من منصات PacBio أو Oxford Nanopore . كما تم تطوير مشتقات Hi-C للكشف على وجه التحديد عن الاتصالات بين وعلى طول الكروماتيدات الشقيقة31,32.
على الرغم من أنه يمكن استخدام Hi-C19 و Micro-C33 لإنشاء خرائط اتصال بدقة subkilobase ، إلا أن كلاهما يتطلب قدرا كبيرا من قراءات التسلسل ويمكن أن يصبح هذا مهمة مكلفة. للوصول إلى دقة مماثلة أو حتى أعلى دون تكاليف ، يمكن تطبيق التخصيب لمناطق جينومية محددة (capture-C 34) أو تفاعلات بروتينية محددة (ChiA-PET 35 ، PLAC-seq36 ، Hi-ChIP37). تكمن قوة وسلبيات تطبيقات التخصيب هذه في أنه يتم أخذ عينات من عدد محدود فقط من التفاعلات. مع مثل هذه التخصيب ، يتم فقدان الجانب العالمي من Hi-C (وخيار التطبيع العالمي).
الأهمية والتطبيقات المحتملة ل Hi-C3.0 تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين 3C عالي الدقة وعميق للغاية مع اكتشاف ميزات الطي واسعة النطاق في نفس الوقت مثل TADs والمقصورات17 (الشكل 6). يبدأ هذا البروتوكول ب 5 × 106 خلايا لكل أنبوب لكل مكتبة Hi-C ، والتي يجب أن تكون أكثر من مادة كافية لتسلسل ممر واحد أو ممرين على خلية تدفق للحصول على ما يصل إلى 1 مليار قراءة نهاية مزدوجة. للتسلسل فائق العمق ، يجب تحضير أنابيب متعددة من 5 × 106 خلايا ، اعتمادا على عدد القراءات المعينة ونسخ PCR. عند أعلى دقة (<1 كيلوبايت) ، توجد تفاعلات التكرار في الغالب بين مواقع CTCF ، ولكن يمكن أيضا اكتشاف تفاعلات المروج والمحسن. يمكن للقراء الرجوع إلى Akgol Oksuz et al.17 للحصول على وصف مفصل لتحليل البيانات.

تم استخدام التقاط تشوه الكروموسوم منذ عام 20021. بشكل أساسي ، يعتمد كل متغير التقاط التشكل على تثبيت تفاعلات بروتين الحمض النووي والبروتين للحفاظ على تنظيم الكروماتين 3D. يتبع ذلك تجزئة الحمض النووي ، عادة عن طريق الهضم المقيد ، وأخيرا ، ربط نهايات الحمض النووي القريبة لتحويل المواضع القريبة مكانيا إلى تسلسلات الحمض النووي التساهمية الفريدة. استخدمت بروتوكولات 3C الأولية تفاعل البوليميراز المتسلسل لأخذ عينات من تفاعلات محددة "واحد لواحد". سمحت فحوصات 4C اللاحقة باكتشاف التفاعلات "واحد إلى الجميع"2 ، بينما اكتشفت 5C تفاعلات "متعدد إلى متعدد"3. جاء التقاط تكوين الكروموسوم إلى ثماره الكاملة بعد تنفيذ الجيل التالي من التسلسل عالي الإنتاجية (NGS) ، والذي سمح باكتشاف التفاعلات الجينومية "الكل إلى الكل" باستخدام Hi-C4 على مستوى الجينوم وتقنيات مماثلة مثل 3C-seq5 و TCC6 و Micro-C 7,8 (انظر أيضا مراجعة Denker و De Laat9).
في Hi-C ، تستخدم النيوكليوتيدات البيوتينيلية لتمييز 5 ′ متدلية بعد الهضم وقبل الربط (الشكل 1). وهذا يسمح باختيار الأجزاء المهضومة والمهذبة بشكل صحيح باستخدام الخرز المطلي بالستربتافيدين ، مما يميزها عن GCC10. تم تنفيذ تحديث مهم لبروتوكول Hi-C بواسطة Rao et al.11 ، الذي أجرى عملية الهضم والربط في نوى سليمة (أي في الموقع) لتقليل منتجات الربط الزائفة. علاوة على ذلك ، أدى استبدال هضم HindIII بهضم MboI (أو DpnII) إلى تقليل حجم الشظية وزيادة إمكانات دقة Hi-C. سمحت هذه الزيادة بالكشف عن الهياكل الصغيرة نسبيا وتحديد الموقع الجينومي الأكثر دقة لنقاط الاتصال ، مثل حلقات الحمض النووي بين عناصر رابطة الدول المستقلة الصغيرة ، على سبيل المثال ، الحلقات بين المواقع المرتبطة ب CTCF الناتجة عن بثق الحلقة11,12. ومع ذلك ، فإن هذه الإمكانية تأتي بتكلفة. أولا ، تتطلب الزيادة المزدوجة في الدقة زيادة أربعة أضعاف (22) في التسلسل يقرأ13. ثانيا ، تزيد أحجام الأجزاء الصغيرة من إمكانية الخلط بين الأجزاء المجاورة غير المهضومة والأجزاء المهضومة والمتدينة14. كما ذكرنا ، في Hi-C ، تختلف الأجزاء المهضومة والمهضومة عن الأجزاء غير المهضومة من خلال وجود البيوتين عند تقاطع الربط. ومع ذلك ، يلزم إزالة البيوتين المناسبة من الأطراف غير المربوطة لضمان سحب تقاطعات الربط فقطإلى أسفل 14,15.
مع انخفاض تكلفة NGS ، يصبح من الممكن دراسة طي الكروموسوم بمزيد من التفصيل. لتقليل حجم شظايا الحمض النووي ، وبالتالي زيادة الدقة ، يمكن تكييف بروتوكول Hi-C لاستخدام إنزيمات تقييد القطع بشكل متكرر16 أو لاستخدام مجموعات من إنزيمات التقييد17،18،19. بدلا من ذلك ، يمكن معايرة MNase 7,8 في Micro-C و DNase في DNase Hi-C20 لتحقيق الهضم الأمثل.
أظهر تقييم منهجي حديث لأساسيات طرق 3C أن الكشف عن ميزات طي الكروموسوم عند كل مقياس طول تحسن بشكل كبير مع التشابك المتسلسل مع 1٪ FA متبوعا ب 3 mM DSG17. علاوة على ذلك ، كان Hi-C مع هضم HindIII هو الخيار الأفضل للكشف عن ميزات الطي على نطاق واسع ، مثل المقصورات ، وأن Micro-C كان متفوقا في اكتشاف ميزات الطي على نطاق صغير مثل حلقات الحمض النووي. أدت هذه النتائج إلى تطوير استراتيجية واحدة عالية الدقة "Hi-C 3.0" ، والتي تستخدم مزيجا من الروابط المتشابكة FA و DSG متبوعة بهضم مزدوج مع DpnII و DdeI endonucleases21. يوفر Hi-C 3.0 إستراتيجية فعالة للاستخدام العام لأنه يكتشف بدقة ميزات الطي عبر جميع مقاييس الطول17. يتم تفصيل الجزء التجريبي من بروتوكول Hi-C 3.0 هنا ويتم عرض النتائج النموذجية التي يمكن توقعها بعد التسلسل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> الشكل 1: إجراء Hi-C في ست خطوات. يتم إصلاح الخلايا أولا باستخدام FA ، ثم DSG (1). ثم ، يسبق التحلل الهضم المزدوج مع DdeI و DpnII (2). يضاف البيوتين عن طريق ملء الأجزاء المتدلية ويتم ربط الأطراف الحادة القريبة (3) قبل تنقية الحمض النووي (4). تتم إزالة البيوتين من نهايات غير مرتبطة قبل صوتنة واختيار الحجم (5). أخيرا ، يسمح سحب البيوتين بربط المحول وتضخيم المكتبة بواسطة PCR (6). الاختصارات: FA = الفورمالديهايد ؛ DSG = غلوتارات ديسوسينيميديل ؛ ب = البيوتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

يستخدم التقاط شكل الكروموسوم (3C) للكشف عن تفاعلات الكروماتين ثلاثية الأبعاد. عادة ، يتم استخدام التشابك الكيميائي مع الفورمالديهايد (FA) لإصلاح تفاعلات الكروماتين. بعد ذلك ، فإن هضم الكروماتين مع إنزيم التقييد والربط اللاحق لنهايات الشظايا يحول القرب ثلاثي الأبعاد (3D) إلى منتجات ربط فريدة. أخيرا ، بعد عكس الروابط المتقاطعة وإزالة البروتين وعزل الحمض النووي ، يتم قص الحمض النووي وإعداده للتسلسل عالي الإنتاجية. تواتر ربط القرب لأزواج من المواقع هو مقياس لتكرار تمركزها المشترك في الفضاء ثلاثي الأبعاد في مجموعة الخلايا.
توفر مكتبة Hi-C المتسلسلة معلومات على مستوى الجينوم حول ترددات التفاعل بين جميع أزواج المواقع. تعتمد دقة ودقة Hi-C على التشابك الفعال الذي يحافظ على ملامسات الكروماتين والتجزئة المتكررة والموحدة للكروماتين. تصف هذه الورقة بروتوكولا محسنا في الموقع Hi-C ، Hi-C 3.0 ، يزيد من كفاءة التشابك من خلال الجمع بين اثنين من الروابط المتشابكة (الفورمالديهايد [FA] وغلوتارات disuccinimidyl [DSG]) ، يليه الهضم الدقيق باستخدام اثنين من إنزيمات التقييد (DpnII و DdeI). Hi-C 3.0 هو بروتوكول واحد للقياس الكمي الدقيق لميزات طي الجينوم على نطاقات أصغر مثل الحلقات والمجالات المرتبطة طوبولوجيا (TADs) ، بالإضافة إلى الميزات الموجودة على نطاقات أكبر على مستوى النواة مثل المقصورات.

تم إنشاء الأشكال في هذه المخطوطة من تجربة منفصلة ومكررة للتجربة التي نشرها سابقا لافونتين وآخرون 21. بعد الحصول على بيانات تسلسل عالية الإنتاجية ، تم استخدام Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) لمعالجة بيانات Hi-C. يمكن العثور على خط أنابيب مماثل على بوابة البيانات لمشروع 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). باختصار ، تم تنفيذ جهاز تقطير خط أنابيب Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) من أجل (1) محاذاة تسلسل جزيئات Hi-C مع الجينوم المرجعي ، (2) تحليل محاذاة .sam وملفات النموذج مع أزواج Hi-C ، (3) تصفية تكرارات PCR ، و (4) تجميع الأزواج في مصفوفات bined لتفاعلات Hi-C. يمكن بعد ذلك عرض هذه المصفوفات المنسقة HDF5 ، والتي تسمى المبردات ، (1) على خادم HiGlass (https://higlass.io/) و (2) تحليلها باستخدام مجموعة كبيرة من الأدوات الحسابية مفتوحة المصدر الموجودة في مجموعة "cooltools" التي تحتفظ بها Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) لاستخراج وقياس ميزات الطي مثل المقصورات و TADs والحلقات.
يمكن تقييم بعض مؤشرات الجودة لمكتبات Hi-C3.0 مباشرة بعد تعيين أزواج القراءة إلى جينوم مرجعي ، باستخدام بعض المقاييس / المؤشرات البسيطة. أولا ، عادة ~ 50٪ من أزواج القراءة المتسلسلة يمكن تعيينها بشكل فريد للخلايا البشرية. نظرا للطبيعة البوليمرية للكروموسومات ، فإن معظم هذه القراءات المعينة (~ 60٪ -90٪) تمثل تفاعلات داخل كروموسوم (رابطة الدول المستقلة) ، مع ترددات التفاعل تتحلل بسرعة مع زيادة المسافة الجينومية (الاضمحلال المعتمد على المسافة). يمكن تصور الاضمحلال المعتمد على المسافة بشكل أفضل في "مخطط التحجيم" ، والذي يوضح احتمال التلامس (لكل ذراع كروموسوم) كدالة للمسافة الجينومية. وجدنا أن استخدام روابط متشابكة وإنزيمات مختلفة يمكن أن يغير الاضمحلال المعتمد على المسافة على مسافات طويلة وقصيرة المدى17. تزيد إضافة تشابك DSG من إمكانية اكتشاف التفاعلات على مسافات قصيرة عند دمجها مع إنزيمات مثل Mnase ومجموعات من DpnII-DdeI التي تنتج شظايا أصغر (الشكل 6 أ).
يمكن أيضا ملاحظة الاضمحلال المعتمد على المسافة مباشرة من مصفوفات التفاعل 2D: تصبح التفاعلات أكثر تواترا عندما تقع بعيدا عن القطر المركزي (الشكل 6B). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد ميزات الطي الجينومية ، مثل المقصورات ، و TADs ، والحلقات من مصفوفات Hi-C ومخططات القياس كانحرافات عن متوسط الاضمحلال العام المعتمد على المسافة على مستوى الجينوم. الأهم من ذلك ، أن التشابك مع DSG بالإضافة إلى FA يقلل من الروابط العشوائية ، والتي تكون غير مقيدة بسبب طبيعة البوليمر للكروموسومات ، وبالتالي ، من المرجح أن تحدث بين الكروموسومات (عبر) (الشكل 6C). يؤدي تقليل الربط العشوائي إلى زيادة نسب الإشارة إلى الضوضاء ، خاصة بالنسبة للتفاعلات داخل الكروموسومات والتفاعلات طويلة المدى جدا (>10-50 ميجا بايت).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> الشكل 6: النتائج التمثيلية لمكتبات Hi-C المعينة والمفلترة. (أ) مخططات القياس مع احتمال الاتصال ومشتقاته لمختلف الإنزيمات ، مرتبة حسب طول الجزء (أعلى) والتشابك مع FA أو FA + DSG (أسفل). الهضم مع MNAse (microC) أو DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) يزيد بشكل كبير من جهات الاتصال قصيرة المدى (أعلى) كما تفعل إضافة DSG إلى FA (أسفل). (B) تظهر الأعمدة خرائط حرارية Hi-C لهضم DpnII بعد تشابك FA فقط وهضم DpnII أو DdeI بعد الارتباط المتشابك FA + DSG. تظهر الأسهم البيضاء قوة متزايدة من "النقاط" بعد التشابك DSG وهضم DdeI ، مما يعني الكشف بشكل أفضل عن حلقات الحمض النووي. تظهر الصفوف أجزاء مختلفة من الكروموسوم 3 بدقة متزايدة ، محاذاة مع اللوحة C: الصف العلوي: الكروموسوم 3 بأكمله (0-198,295,559 ميجا بايت) ؛ الصف الأوسط: 186-196 ميجا بايت ؛ الصف السفلي: 191.0-191.5 ميجا بايت. (ج) الرسوم البيانية لتغطية المناطق الموضحة في A. تظهر الأسهم السوداء التغطية الأقل (٪ قراءات رابطة الدول المستقلة) للربط المتشابك FA فقط. الاختصارات: FA = الفورمالديهايد ؛ DSG = غلوتارات ديسوسينيميديل ؛ CHR = كروموسوم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
ليست كل القراءات المعينة مفيدة. مؤشر الجودة الثاني هو عدد تكرارات PCR. من غير المرجح أن تحدث القراءات المكررة الدقيقة عن طريق الصدفة بعد الربط والصوتنة. وبالتالي ، من المحتمل أن تكون هذه القراءات ناتجة عن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحتاج إلى تصفية. غالبا ما تنشأ التكرارات عندما تكون هناك حاجة إلى عدد كبير جدا من دورات PCR لتضخيم المكتبات منخفضة التعقيد. بشكل عام ، بالنسبة إلى Hi-C ، تحتاج معظم المكتبات فقط إلى 5-8 دورات من تضخيم PCR النهائي ، على النحو الذي يحدده تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتحليل الحجمي (انظر الخطوة 3.9 ؛ الشكل 4). ومع ذلك ، يمكن الحصول على مكتبات ذات تعقيد كاف حتى بعد 14 دورة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.
يمكن أن تنشأ فئة أخرى من القراءات المكررة ، ما يسمى بالتكرارات الضوئية ، من عملية التضخيم على منصات تسلسل Illumina التي تستخدم خلايا تدفق منقوشة (مثل HiSeq4000). تم العثور على التكرارات الضوئية إما من التحميل الزائد لخلية التدفق ، مما يتسبب في تسمية المجموعات (الكبيرة) بمجموعتين منفصلتين ، أو من إعادة التجميع المحلي للجزيء الأصلي المزدوج بعد الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل. نظرا لأن كلا النوعين من التكرارات الضوئية محليان ، يمكن تحديدهما وتمييزهما عن تكرارات PCR من خلال موقعهما على خلية التدفق. في حين أن المكتبات التي تحتوي على >15٪ من نسخ PCR المكررة ستحتاج إلى تجديد ، يمكن إعادة تحميل المكتبات ذات التكرارات الضوئية بعد تحسين عملية التحميل.
الجدول التكميلي S1: المخازن المؤقتة والحلول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 هو بروتوكول Hi-C محسن يجمع بين روابط الغلوتارات الفورمالديهايد و disuccinimidyl glutarate مع مزيج من إنزيمات تقييد DpnII و DdeI لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ودقة اكتشاف تفاعل الكروماتين.

التقاط تشكل الكروموسوم عبر مقاييس الطول

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

يكتشف هذا البروتوكول بدقة ميزات طي الكروموسوم عبر مقاييس طول متعددة مع إشارة خلفية منخفضة. على سبيل المثال ، يمكن تحليل تفاعلات محسن المروج في سياق مقصورات الكروموسوم. استخدام endonucleases تقييد التحايل على تحسين مستوى الهضم من المواد المدخلة.لا يلزم الاختيار عن طريق عزل الجل لالتقاط منتجات الربط. المشكلة الأكثر شيوعا هي فقدان الخلايا بعد تثبيت DSG والتقاط ما يكفي من الحمض النووي لإنتاج مكتبات عالية الجودة. للبدء ، قم بشفط الوسط باستخدام ماصة باستور مقترنة بمصيدة فراغ من لوحة 150 ملم تحتوي على 5 × 10 إلى الخلايا السادسة.اغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من HBSS. لربط الخلايا ، صب 23.125 ملليلتر من محلول الفورمالديهايد 1٪ في لوحة 15 سم. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، هز بلطف لوحة باليد كل دقيقتين.بعد ذلك، أضف 1.25 ملليلتر من 2.5 مولار من الجلايسين وحرك اللوح برفق لإخماد تفاعل الربط المتقاطع، قبل التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. استمر في الحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة لإيقاف الربط المتقاطع. كشط الخلايا من اللوحة باستخدام مكشطة خلية أو شرطي مطاطي ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مع ماصة.الطرد المركزي التعليق في 1،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل الطافية عن طريق الشفط. اغسل الحبيبات مرة واحدة ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS. ثم ، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى قبل المتابعة إلى DSG عبر الربط.للربط المتقاطع مع DSG ، أعد تعليق الخلايا المحببة في 9.9 ملليلتر من DPBS. ثم أضف 100 ميكرولتر من 300 ملليمولار DSG. امزج الأنبوب عن طريق الانعكاس وقم بربط الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة على جهاز دوار.بعد الربط المتقاطع ، أضف 1.925 ملليلتر من 2.5 مولار جليكاين ، واقلب للخلط ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي بمعدل 2،000 مرة G لمدة 15 دقيقة وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من ألبومين مصل الأبقار 0.05٪ DPBS قبل نقله إلى أنبوب سعة 1.7 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في 2،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية.قم بتجميد الحبيبات في النيتروجين السائل قبل المتابعة إلى التقاط تأكيد الكروموسوم. أعد تعليق القسمة الخلوية المتشابكة في ملليلتر واحد من محلول التحلل البارد بالثلج الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني وانقله إلى خالط Dounce لمدة 15 دقيقة من الحضانة على الثلج. حرك المدقة A ببطء لأعلى ولأسفل 30 مرة لتجانس الخلايا واحتضانها لمدة دقيقة واحدة للسماح للخلايا بالتبريد قبل 30 ضربة أخرى.بعد السكتة الدماغية الأخيرة ، انقل المحللة إلى أنبوب سعة 1.7 ملليلتر. الطرد المركزي التعليق المحلل في 2،500 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ونفض الغبار أو الدوامة لإعادة تعليق الحبيبات المبللة.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية للحصول على مادة تشبه الزبادي مع الحد الأدنى من الكتل. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد الجليد البارد قبل الطرد المركزي. بعد الغسيل الثاني, أعد تعليق الحبيبات في 360 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد عن طريق السحب بعد إضافة ما يقرب من 340 ميكرولتر إلى حجم ترحيل الحبيبات, اعتمادا على حجم الخلية.ضع جانبا 18 ميكرولتر من المحللة لاختبار سلامة الكروماتين ، أو CI.To المحللة المتبقية ، أضف 38 ميكرولترا من كبريتات دوديسيل الصوديوم 1٪ إلى أنبوب hi-C لعمل حجم إجمالي قدره 380 ميكرولتر واخلطه بعناية عن طريق السحب دون إدخال فقاعات. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية دون رجها لمدة 10 دقائق لفتح الكروماتين. ثم ضع الأنبوب على الفور على الثلج.بعد تحضير خليط الهضم باستخدام Triton X-100 ، أضف 107 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب hi-C لتكوين حجم إجمالي قدره 487 ميكرولتر وهضم الكروماتين طوال الليل عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري مع اهتزاز الفاصل الزمني. في اليوم التالي ، انقل العينات إلى 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإلغاء تنشيط نشاط النوكلياز المتبقي. بعد وضع العينة على الثلج ، ضع جانبا 10 ميكرولتر من التحكم في الهضم ، أو DC ، وتخزينها في أربع درجات مئوية.قم بإزالة التكثيف من الغطاء باستخدام ماصة أو عن طريق الدوران. بعد ذلك ، أضف 58 ميكرولترا من مزيج تعبئة البيوتين ليصبح الحجم الكلي 535 ميكرولتر. ماصة بلطف دون تشكيل فقاعات قبل الحضانة عند 23 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في خلاط حراري.بعد الحضانة ، أضف 665 ميكرولتر من مزيج الربط ، مما يجعل حجم العينة 1،200 ميكرولتر. امزج العينة عن طريق السحب واحتضانها عند 16 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في خلاط حراري. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من البروتيناز-K في جزأين إلى أنبوب عينة hi-C واحتضانه طوال الليل عند 65 درجة مئوية مع اهتزاز الفاصل الزمني.لتنقية الحمض النووي ، أضف الإيثانول المثلج بنسبة 100٪ وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 18،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما من الجانب غير الحبيبي وجفف العينة في الهواء لمدة 10 دقائق أو حتى تجف الكريات بشكل واضح. بمجرد أن تجف الكريات ، قم بإذابتها في 450 ميكرولتر من Tris low-EDTA عن طريق السحب أو الدوامة.انقل التعليق القابل للذوبان إلى وحدة مرشح طرد مركزي 0.5 مم ، أو CFU ، مع قطع الوزن الجزيئي بمقدار ثلاثة كيلودالتون. قم بالطرد المركزي لوحدة CFU بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق وتخلص من التدفق. بعد الغسيل الثاني ، أضف 80 ميكرولتر من Tris low-EDTA إلى العمود.حول العمود إلى أنبوب تجميع جديد لمدة دقيقتين من الطرد المركزي بأقصى سرعة. أخيرا ، قم بتحميل العينات على جل أغاروز 0.8٪. أظهر جل الأغاروز مع نتائج معايرة PCR أن معظم المكتبات تتطلب خمس إلى ثماني دورات من تضخيم PCR النهائي.يؤكد هضم الخلايا في مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم النهائي ، كما لوحظ من خلال شظايا أصغر على هلام الأغاروز ، وجود تقاطعات ربط مناسبة ويعمل كفحص للجودة قبل التسلسل. بعد التسلسل ، أظهرت البيانات المعينة أن الجمع بين DpnII و DdeI يزيد بشكل كبير من جهات الاتصال قصيرة المدى ، مثل إضافة DSG إلى الربط المتقاطع التقليدي للفورمالديهايد. يمكن أيضا ملاحظة إشارة محسنة على مسافات طويلة وقصيرة مباشرة من مصفوفات التفاعل 2D.إشارات المقصورة هي كريسبر على مسافات طويلة والنقاط التي تشكلها حلقات الكروماتين تكون أكثر بروزا على مسافات قصيرة. بالإضافة إلى الفورمالديهايد ، يقلل الربط المتقاطع مع DSG من الروابط العشوائية ، مما يحسن التغطية النسبية في رابطة الدول المستقلة. من المهم ألا تفقد الخلايا أثناء وبعد التشابك.يمكن أن تكون كريات الخلايا فضفاضة أو غير مرئية ، ويمكن أن تلتصق الخلايا بأطراف الماصة في بعض المخازن المؤقتة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

الببتيد المستمدة من طريقة لنقل الجينات والبروتينات عبر الخلوي والحواجز Organellar في النباتات

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

بيودوسيميتري الإشعاع المعجل الآلي تحديد الكروموسوم ديسينتريك (أدسي) وتقدير الجرعة

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

نموذج ماوس غير عشوائي لأعاده تنشيط الدوائية من Mecp2 علي كروموسوم X غير نشط

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...