Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Vi vil gerne takke Denis Lafontaine for protokoludvikling og Sergey Venev for bioinformatisk bistand. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program til JD (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. er en efterforsker af Howard Hughes Medical Institute.
Denne artikel er underlagt HHMI's Open Access to Publications-politik. HHMI-laboratorieledere har tidligere givet en ikke-eksklusiv CC BY 4.0-licens til offentligheden og en underlicenserbar licens til HHMI i deres forskningsartikler. I henhold til disse licenser kan det forfatteraccepterede manuskript til denne artikel gøres frit tilgængeligt under en CC BY 4.0-licens umiddelbart efter offentliggørelsen.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Kritiske trin til cellehåndtering Selvom det er muligt at bruge et lavere antal inputceller, er denne protokol optimeret til ~ 5 × 106 celler pr. sekventeringsbane (~ 400 M læser) for at sikre korrekt kompleksitet efter dyb sekventering. Celler tælles bedst inden fiksering. Til generering af ultradybe biblioteker multiplicerer vi generelt antallet af baner (og celler), indtil den ønskede læsedybde er nået. For at opnå optimal fiksering skal serumholdigt substrat erstattes med PBS før FA-fiksering, og fikseringsopløsninger skal tilsættes straks og uden koncentrationsgradienter15,22. Til cellehøst foretrækkes skrabning frem for trypsinisering, fordi overgangen fra en fladere til en sfærisk form efter trypsinisering kan påvirke den nukleare konformation. Efter tilsætning af DSG går løse og klumpede cellepiller let tabt. Vær forsigtig, når du håndterer celler på dette stadium, og tilføj op til 0,05% BSA for at mindske klumpning.
Ændringer af metoden Denne protokol blev udviklet ved hjælp af humane celler17. Men baseret på erfaring med indfangning af kromosomkonformation bør denne protokol fungere for de fleste eukaryote celler. For et betydeligt lavere input (~ 1 × 106 celler) anbefaler vi at bruge halvdelen af volumenerne til lysis- og konformationsindfangningsprocedurerne [trin 2.1-2.4]. Dette ville også gøre det muligt at udføre DNA-isolering [trin 2.5] i en bordpladecentrifuge med 1,7 ml rør, hvilket kunne forbedre pelletering for lave DNA-koncentrationer. Kvantificeringen af DNA (trin 2.6.6) angiver, hvordan man skal forholde sig. For lave mængder isoleret DNA (1-5 μg) foreslår vi at springe over størrelsesvalget (trin 3.3) og fortsætte med fjernelse af biotin efter at have reduceret volumenet fra 130 μL til ~ 45 μL med en CFU.
Denne protokol blev udviklet specielt for at sikre data af høj kvalitet efter efterfølgende tværbinding med FA og DSG og fordøjelse med DpnII og DdeI. Imidlertid kan alternative tværbindingsstrategier såsom FA efterfulgt af EGS (ethylenglycolbis (succinimidylsuccinat)), som også anvendes i ChIP-seq23 og ChIA-PET24, fungere lige så godt17. Tilsvarende kan forskellige enzymkombinationer, såsom DpnII og HinfI18 eller MboI, MseI og NlaIII19 , anvendes til fordøjelsen. Når du tilpasser enzymkombinationer, skal du sørge for at bruge biotinylerede nukleotider, der kan udfylde de specifikke 5 'udhæng og bruge de mest optimale buffere til hver cocktail. DpnII leveres med sin egen buffer, og enzymproducenten anbefaler en specifik buffer til DdeI-fordøjelsen. Men for dobbeltfordøjelsen med DpnII og DdeI i denne protokol anbefales Restriction Buffer, fordi den er vurderet til 100% aktivitet for begge enzymer.
Fejlfinding af konformationsregistrering De tre vigtigste trin i kromosomkonformationsfangst: tværbinding, fordøjelse og religation er alle blevet udført, før resultaterne kan visualiseres på gel. For at bestemme kvaliteten af hvert af disse tre trin og skelne, hvor der kunne være opstået problemer, tages og lægges aliquoter før (CI) og efter fordøjelsen (DC) på gelen sammen med den ligerede Hi-C-prøve (figur 2). Denne gel bruges til at bestemme kvaliteten af Hi-C-prøven, og om det vil være værd at fortsætte protokollen. Uden CI og DC er det vanskeligt at udpege potentielle suboptimale trin. Det er værd at bemærke, at suboptimal ligering kan skyldes et problem i selve ligeringen, udfyldningen eller et problem med tværbinding. Hvis du vil foretage fejlfinding af krydslinkning, skal du sørge for ikke at bruge mere end 1 × 107 celler pr. bibliotek og starte med friske tværbindingsreagenser og rene celler (dvs. skyllet med PBS). For ligering skal du sørge for, at celler og ligeringsblanding opbevares på is. Tilsæt T4 DNA-ligase lige før 4 timers inkubation ved 16 °C og bland godt.
Fejlfinding af biblioteksforberedelse Hvis der er behov for mere end 10 PCR-cyklusser, eller der ikke kan ses noget PCR-produkt på gel efter PCR-titrering (figur 4), er der et par muligheder for at gemme Hi-C-prøven. Når man arbejder tilbage fra PCR-titreringen, er den første mulighed at prøve PCR igen. Hvis der stadig ikke er nok produkt, er det muligt at forsøge endnu en omgang A-tailing og adapterligering (trin 3.6) efter vask af perlerne to gange med 1x TLE buffer. Efter denne ekstra A-tailing og adapterligering kan man fortsætte til PCR-titreringen som før. Hvis der stadig ikke er noget produkt, er den sidste mulighed at resonere 0,8x fraktionen fra trin 3,3 og fortsætte derfra.
Begrænsninger og fordele ved Hi-C3.0 Det er vigtigt at indse, at Hi-C er en populationsbaseret metode, der fanger den gennemsnitlige hyppighed af interaktioner mellem par loci i cellepopulationen. Nogle beregningsanalyser er designet til at adskille kombinationer af konformationer fra en population25, men i princippet er Hi-C blind for forskelle mellem celler. Selvom det er muligt at udføre enkeltcelle Hi-C26,27, og beregningsmæssige slutninger kan foretages28, er enkeltcelle Hi-C ikke egnet til at opnå 3C-information med ultrahøj opløsning. En yderligere begrænsning af Hi-C er, at den kun registrerer parvise interaktioner. For at opdage multikontaktinteraktioner kan man enten bruge hyppige fræsere kombineret med kortlæst sekventering (Illumina)16 eller udføre multikontakt 3C29 eller 4C30 ved hjælp af langlæst sekventering fra PacBio- eller Oxford Nanopore-platforme. Hi-C-derivater til specifikt at detektere kontakter mellem og langs søsterkromatider er også blevet udviklet31,32.
Selvom Hi-C19 og Micro-C33 kan bruges til at generere kontaktkort ved subkilobaseopløsninger, kræver begge en stor mængde sekventeringslæsninger, og dette kan blive en dyr opgave. For at komme til lignende eller endnu højere opløsning uden omkostningerne kan berigelse for specifikke genomiske regioner (capture-C34) eller specifikke proteininteraktioner (ChiA-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) anvendes. Styrken og ulempen ved disse berigelsesapplikationer er, at der kun udtages et begrænset antal interaktioner. Med sådanne berigelser går det globale aspekt af Hi-C (og muligheden for global normalisering) tabt.
Betydning og potentielle anvendelser af Hi-C3.0 Denne protokol blev designet til at muliggøre ultradeep 3C med høj opløsning, samtidig med at den registrerer store foldefunktioner såsom TAD'er og rum17 (figur 6). Denne protokol starter med 5 × 106 celler pr. rør for hvert Hi-C-bibliotek, hvilket skal være mere end nok materiale til at sekvensere en eller to baner på en flowcelle for at opnå op til 1 milliard parrede endelæsninger. Til ultradeep sekventering skal der fremstilles flere rør med 5 × 106 celler afhængigt af antallet af kortlagte læsninger og PCR-duplikater. Ved den højeste opløsning (<1 kb) findes looping-interaktioner for det meste mellem CTCF-websteder, men promotor-forstærkerinteraktioner kan også detekteres. Læsere kan henvise til Akgol Oksuz et al.17 for en detaljeret beskrivelse af dataanalysen.

Kromosomkonformationsoptagelse er blevet brugt siden 20021. Grundlæggende er enhver konformationsindfangningsvariant afhængig af fiksering af DNA-protein og protein-protein-interaktioner for at bevare 3D-kromatinorganisation. Dette efterfølges af DNA-fragmentering, normalt ved restriktionsfordøjelse, og endelig slutter religation af nærliggende DNA for at omdanne rumligt proksimale loci til unikke kovalente DNA-sekvenser. Indledende 3C-protokoller brugte PCR til at prøve specifikke, "en-til-en" interaktioner. Efterfølgende 4C-assays tillod påvisning af "en-til-alle" interaktioner2, mens 5C detekterede "mange-til-mange" interaktioner3. Kromosomkonformationsfangst kom til fuld frugt efter implementering af næste generations high-throughput-sekventering (NGS), som tillod påvisning af "alt-til-alle" genomiske interaktioner ved hjælp af genom-dækkende Hi-C4 og sammenlignelige teknikker såsom 3C-seq5, TCC6 og Micro-C 7,8 (se også anmeldelse af Denker og De Laat9).
I Hi-C anvendes biotinylerede nukleotider til at markere 5′ udhæng efter fordøjelsen og før ligering (figur 1). Dette giver mulighed for udvælgelse af korrekt fordøjede og religerede fragmenter ved hjælp af streptavidinbelagte perler, hvilket adskiller det fra GCC10. En vigtig opdatering af Hi-C-protokollen blev implementeret af Rao et al.11, der udførte fordøjelsen og religationen i intakte kerner (dvs. in situ) for at reducere falske ligeringsprodukter. Desuden reducerede udskiftning af HindIII-fordøjelse med MboI (eller DpnII) fordøjelsen fragmentstørrelsen og øgede opløsningspotentialet for Hi-C. Denne stigning tillod påvisning af relativt små strukturer og en mere præcis genomisk lokalisering af kontaktpunkter, såsom DNA-sløjfer mellem små cis-elementer, f.eks. sløjfer mellem CTCF-bundne steder genereret af loopekstrudering11,12. Dette potentiale har dog en pris. For det første kræver en dobbelt stigning i opløsning en firedobling (22) stigning i sekventeringslæsninger13. For det andet øger de små fragmentstørrelser muligheden for at forveksle ufordøjede nabofragmenter med fordøjede og religerede fragmenter14. Som nævnt adskiller fordøjede og religerede fragmenter sig i Hi-C fra ufordøjede fragmenter ved tilstedeværelsen af biotin ved ligeringskrydset. Imidlertid kræves korrekt fjernelse af biotin fra uligerede ender for at sikre, at kun ligeringskryds trækkes ned14,15.
Med de faldende omkostninger ved NGS bliver det muligt at studere kromosomfoldning mere detaljeret. For at mindske størrelsen af DNA-fragmenter og derved øge opløsningen kan Hi-C-protokollen tilpasses til hyppigere skærerestriktionsenzymer16 eller til at anvende kombinationer af restriktionsenzymer17,18,19. Alternativt kan MNase 7,8 i Micro-C og DNase i DNase Hi-C20 titreres for at opnå optimal fordøjelse.
En nylig systematisk evaluering af de grundlæggende elementer i 3C-metoder viste, at detektionen af kromosomfoldningsfunktioner ved hver længdeskala blev stærkt forbedret med sekventiel tværbinding med 1% FA efterfulgt af 3 mM DSG17. Desuden var Hi-C med HindIII-fordøjelse den bedste mulighed for at detektere store foldefunktioner, såsom rum, og at Micro-C var overlegen til at detektere småskala foldefunktioner såsom DNA-sløjfer. Disse resultater førte til udviklingen af en enkelt "Hi-C 3.0"-strategi med høj opløsning, der anvender kombinationen af FA- og DSG-tværbindinger efterfulgt af dobbeltfordøjelse med DpnII- og DdeI-endonukleaser21. Hi-C 3.0 giver en effektiv strategi til generel brug, fordi den nøjagtigt registrerer foldefunktioner på tværs af alle længdeskalaer17. Den eksperimentelle del af Hi-C 3.0-protokollen er detaljeret her, og typiske resultater, der kan forventes efter sekventering, vises.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figur 1: Hi-C-procedure i seks trin. Celler fastgøres først med FA og derefter DSG (1). Derefter går lysis forud for en dobbelt fordøjelse med DdeI og DpnII (2). Biotin tilsættes ved udhængsudfyldning, og proksimale stumpede ender ligeres (3) før DNA-oprensning (4). Biotin fjernes fra uligerede ender før sonikering og størrelsesvalg (5). Endelig giver pull-down af biotin mulighed for adapterligation og biblioteksforstærkning ved PCR (6). Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

Kromosomkonformationsindfangning (3C) bruges til at detektere tredimensionelle kromatininteraktioner. Typisk bruges kemisk tværbinding med formaldehyd (FA) til at fiksere kromatininteraktioner. Derefter omdanner kromatinfordøjelse med et restriktionsenzym og efterfølgende religation af fragmentender tredimensionel (3D) nærhed til unikke ligeringsprodukter. Endelig, efter vending af tværbindinger, proteinfjernelse og DNA-isolering, skæres DNA og forberedes til sekventering med høj kapacitet. Hyppigheden af nærhedsligation af par loci er et mål for hyppigheden af deres colokalisering i tredimensionelt rum i en cellepopulation.
Et sekventeret Hi-C-bibliotek giver genom-dækkende information om interaktionsfrekvenser mellem alle par loci. Opløsningen og præcisionen af Hi-C er afhængig af effektiv tværbinding, der opretholder kromatinkontakter og hyppig og ensartet fragmentering af kromatinen. Dette papir beskriver en forbedret in situ Hi-C-protokol, Hi-C 3.0, der øger effektiviteten af tværbinding ved at kombinere to tværbindinger (formaldehyd [FA] og disuccinimidylglutarat [DSG]), efterfulgt af finere fordøjelse ved hjælp af to restriktionsenzymer (DpnII og DdeI). Hi-C 3.0 er en enkelt protokol til nøjagtig kvantificering af genomfoldningsfunktioner i mindre skalaer såsom sløjfer og topologisk associerende domæner (TAD'er) samt funktioner i større kernebrede skalaer såsom rum.

Figurerne i dette manuskript blev genereret fra et separat, replikerende eksperiment af det, der tidligere blev offentliggjort af Lafontaine et al.21. Efter at have opnået sekventeringsdata med høj kapacitet blev Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) brugt til at behandle Hi-C-dataene. En lignende pipeline kan findes på dataportalen for 4D Nucleome-projektet (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kort fortalt blev Nextflow-rørledningsdestilleriet (https://github.com/open2c/distiller-nf) implementeret for at (1) justere sekvenserne af Hi-C-molekyler til referencegenomet, (2) analysere .sam-justering og danne filer med Hi-C-par, (3) filtrere PCR-duplikater og (4) aggregerede par i binnederede matricer af Hi-C-interaktioner. Disse HDF5-formaterede matricer, kaldet kølere, kan derefter (1) ses på en HiGlass-server (https://higlass.io/) og (2) analyseres ved hjælp af et stort sæt open source-beregningsværktøjer, der findes i "cooltools" -samlingen, der vedligeholdes af Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) for at udtrække og kvantificere foldefunktioner såsom rum, TAD'er og sløjfer.
Nogle kvalitetsindikatorer for Hi-C3.0-bibliotekerne kan vurderes umiddelbart efter kortlægning af læsepar til et referencegenom ved hjælp af nogle få enkle målinger / indikatorer. For det første kan typisk ~ 50% af sekventerede læsepar kortlægges entydigt for humane celler. På grund af kromosomernes polymere natur repræsenterer de fleste af disse kortlagte læsninger (~ 60% -90%) interaktioner inden for et kromosom (cis), hvor interaktionsfrekvenser hurtigt henfalder med stigende genomisk afstand (afstandsafhængig henfald). Det afstandsafhængige henfald kan visualiseres bedst i et "skaleringsplot", som viser kontaktsandsynligheden (pr. kromosomarm) som en funktion af genomisk afstand. Vi fandt ud af, at brugen af forskellige tværbindinger og enzymer kan ændre det afstandsafhængige henfald på lange og korte afstande17. Tilsætningen af DSG-tværbinding øger detekterbarheden af interaktioner på korte afstande, når de kombineres med enzymer såsom Mnase og kombinationer af DpnII-DdeI, der producerer mindre fragmenter (figur 6A).
Afstandsafhængigt henfald kan også observeres direkte fra 2D-interaktionsmatricer: interaktioner bliver mere sjældne, når de placeres længere væk fra den centrale diagonal (figur 6B). Derudover kan genomiske foldefunktioner, såsom rum, TAD'er og sløjfer, identificeres fra Hi-C-matricer og skaleringsplotter som afvigelser fra det generelle genom-dækkende gennemsnitlige afstandsafhængige henfald. Det er vigtigt, at tværbinding med DSG ud over FA reducerer tilfældige ligeringer, som er ubegrænsede på grund af kromosomernes polymernatur og derfor mere tilbøjelige til at forekomme mellem kromosomer (i trans) (figur 6C). Reduktion af tilfældig ligering fører til øgede signal-støj-forhold, især for interkromosomale og meget langtrækkende (>10-50 Mb) intrakromosomale interaktioner.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figur 6: Repræsentative resultater af kortlagte og filtrerede Hi-C-biblioteker. (A) Skalering af plots med kontaktsandsynlighed og dets derivat for forskellige enzymer, ordnet efter fragmentlængde (øverst) og tværbinding med enten FA eller FA + DSG (nederst). Fordøjelse med MNAse (microC) eller DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) øger kortdistancekontakter (øverst) betydeligt, ligesom tilføjelse af DSG til FA (nederst). (B) Kolonner viser Hi-C-varmekort over DpnII-fordøjelsen efter blot FA-tværbinding og DpnII- eller DdeI-fordøjelse efter FA+DSG-tværbinding. Hvide pile viser stigende styrke af "prikker" efter DSG-tværbinding og DdeI-fordøjelse, hvilket indebærer bedre påvisning af DNA-sløjfer. Rækker viser forskellige dele af kromosom 3 ved stigende opløsning, justeret med panel C: øverste række: hele kromosom 3 (0-198,295,559 Mb); midterste række: 186-196 Mb; nederste række: 191,0-191,5 Mb. (C) Dækningsgrafer for de regioner, der er afbildet i A. Sorte pile viser den lavere dækning (% cis læser) for tværbinding kun for FA. Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; Chr = kromosom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Ikke alle kortlagte læsninger er nyttige. En anden kvalitetsindikator er antallet af PCR-dubletter. Det er meget usandsynligt, at nøjagtige duplikatlæsninger forekommer tilfældigt efter ligering og sonikering. Således skyldes sådanne aflæsninger sandsynligvis PCR-forstærkning og skal filtreres ud. Duplikater opstår ofte, når der kræves for mange PCR-cyklusser for at forstærke biblioteker med lav kompleksitet. Generelt for Hi-C har de fleste biblioteker kun brug for 5-8 cyklusser med endelig PCR-forstærkning, som bestemt ved titrerings-PCR (se trin 3.9; Figur 4). Biblioteker med tilstrækkelig kompleksitet kan dog opnås selv efter 14 cyklusser med PCR-forstærkning.
En anden kategori af duplikatlæsninger, såkaldte optiske dubletter, kan opstå ved forstærkningsprocessen på Illumina-sekventeringsplatforme, der bruger mønstrede flowceller (såsom HiSeq4000). Optiske duplikater findes fra enten overbelastning af flowcellen, hvilket får (store) klynger til at blive kaldt to separate klynger eller fra lokal reclustering af det oprindelige parrede endemolekyle efter en første runde af PCR. Da begge typer optiske dubletter er lokale, kan de identificeres og skelnes fra PCR-dubletter ved deres placering på flowcellen. Mens biblioteker med >15% PCR-duplikater ville have brug for regenerering, kan biblioteker med optiske duplikater genindlæses efter optimering af indlæsningsprocessen.
Supplerende tabel S1: Buffere og opløsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 er en forbedret Hi-C-protokol, der kombinerer formaldehyd og disuccinimidylglutarat tværbindinger med en cocktail af DpnII- og DdeI-restriktionsenzymer for at øge signal-støj-forholdet og opløsningen af kromatininteraktionsdetektion.

Indfangning af kromosomkonformation på tværs af længdeskalaer

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Denne protokol registrerer nøjagtigt kromosomfoldefunktioner på tværs af flere længdeskalaer med et lavt baggrundssignal. For eksempel kan promotorforstærkerinteraktioner analyseres i forbindelse med kromosomrum. Brugen af begrænsningsendonukleaser omgår optimering af fordøjelsesniveauet for inputmateriale.Der kræves ingen valg ved gelisolering for at fange ligeringprodukter. Det mest almindelige problem er tab af celler efter DSG-fiksering og indfangning af nok DNA til at producere biblioteker af høj kvalitet. Til at begynde med skal du opsuge mediet med en Pasteur-pipette koblet til en vakuumfælde fra 150 millimeter-pladen indeholdende 5 x 10 til de sjette celler.Vask cellerne to gange med 10 ml HBSS. For at forbinde cellerne hældes 23.125 ml af 1%formaldehydopløsningen i 15 centimeter pladen. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter, og vug forsigtigt pladen i hånden hvert andet minut.Derefter tilsættes 1,25 ml 2,5-molær glycin og hvirvler forsigtigt pladen for at slukke tværbindingsreaktionen, inden den inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Fortsæt inkubation på is i 15 minutter for at stoppe tværbinding. Skrab cellerne fra pladen med en celleskraber eller gummipolitimand og overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør med en pipette.Centrifuger suspensionen ved 1.000 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten ved aspiration. Vask pelleten en gang med 10 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand eller DPBS. Derefter centrifuge igen, før du fortsætter til DSG-tværbinding.Til tværbinding med DSG resuspenderes pelleterede celler i 9,9 ml DPBS. Tilsæt derefter 100 mikroliter 300 millimolar DSG. Bland røret ved inversion og tværbinding af cellerne ved stuetemperatur i 40 minutter på en rotator.Efter tværbinding tilsættes 1.925 ml 2,5-molær glycin, inverteres for at blande og inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter centrifugeres cellerne ved 2.000 gange G i 15 minutter og resuspenderer pelleten i en milliliter 0,05% bovin serumalbumin DPBS, før den overføres til et 1,7 milliliter rør. Centrifuge cellerne ved 2.000 gange G i 15 minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten.Snap-frys pelleten i flydende nitrogen, inden du fortsætter til kromosombekræftelsesoptagelsen. Resuspender den tværbundne celle aliquot i en milliliter iskold lysisbuffer indeholdende 10 mikroliter proteasehæmmercocktail og overføres til en Dounce homogenisator i 15 minutters inkubation på is. Bevæg langsomt støder A op og ned 30 gange for at homogenisere cellerne og inkubere i et minut for at lade cellerne køle ned før yderligere 30 slag.Efter det sidste slag overføres lysatet til et 1,7 milliliter rør. Centrifuger den lyserede suspension ved 2.500 gange G i fem minutter. Kassér supernatanten og svirp eller hvirvel for at resuspendere den våde pille.Fjern så meget af supernatanten som muligt for at opnå et yoghurtlignende stof med minimale klumper. Resuspender pelleten i 500 mikroliter iskold restriktionsbuffer før centrifugering. Efter den anden vask resuspenderes pelleten i 360 mikroliter begrænsningsbuffer ved pipettering efter tilsætning af ca. 340 mikroliter til pelletens overførselsvolumen, afhængigt af cellestørrelsen.Afsæt 18 mikroliter lysat til test af kromatinintegriteten, eller CI.To det resterende lysat, tilsæt 38 mikroliter 1% natriumdodecylsulfat til hi-C-rør for at gøre et samlet volumen på 380 mikroliter og bland forsigtigt ved pipettering uden at indføre bobler. Inkuber prøverne ved 65 grader Celsius uden at ryste i 10 minutter for at åbne kromatinen. Placer derefter straks røret på is.Efter tilberedning af fordøjelsesblandingen med Triton X-100 tilsættes 107 mikroliter af denne blanding til hi-C-røret for at fremstille et samlet volumen på 487 mikroliter og fordøje kromatinen natten over ved 37 grader Celsius i en termomixer med intervalrystelser. Den næste dag overføres prøverne til 65 grader Celsius i 20 minutter for at deaktivere den resterende endonukleaseaktivitet. Efter at have lagt prøven på is, skal du afsætte 10 mikroliter fordøjelseskontrol eller DC og opbevare dem ved fire grader Celsius.Fjern kondensen fra låget med en pipette eller ved at dreje. Tilsæt derefter 58 mikroliter biotinudfyldningsblanding for at gøre et samlet volumen på 535 mikroliter. Pipetter forsigtigt uden at danne bobler, før den inkuberes ved 23 grader Celsius i fire timer i en termomixer.Efter inkubation tilsættes 665 mikroliter ligeringsblanding, hvilket gør prøvevolumenet 1.200 mikroliter. Prøven blandes ved pipettering og inkuberes ved 16 grader Celsius i fire timer i en termomixer. Derefter tilsættes 50 mikroliter proteinase-K i to fraktioner til hi-C-prøverøret og inkuberes natten over ved 65 grader Celsius med intervalomrystning.Til DNA-rensning tilsættes 100% iskold ethanol og centrifugerer rørene ved 18.000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Supernatanten fjernes helt fra den ikke-pilleholdige side, og prøven lufttørres i 10 minutter, eller indtil pelleterne er synligt tørre. Når pellets er tørre, opløses dem i 450 mikroliter Tris lav-EDTA ved at pipettere eller hvirvle.Overfør den opløste suspension til 0,5 millimeter centrifugalfilterenhed eller CFU med en molekylvægtsafskæring på tre kilodalton. Centrifuger CFU'en med maksimal hastighed i 10 minutter, og kassér gennemstrømningen. Efter den anden vask tilsættes 80 mikroliter Tris lav-EDTA til søjlen.Drej søjlen til et nyt opsamlingsrør i to minutters centrifugering ved maksimal hastighed. Til sidst indlæses prøverne på en 0,8% agarosegel. Agarosegel med PCR-titreringsresultater viste, at de fleste biblioteker kræver fem til otte cyklusser med endelig PCR-forstærkning.Cellefordøjelse af det endelige forstærkede PCR-bibliotek, som observeret af mindre fragmenter på en agarosegel, bekræfter tilstedeværelsen af korrekte ligeringskryds og tjener som en kvalitetskontrol inden sekventering. Efter sekventering viste de kortlagte data, at kombinationen af DpnII og DdeI signifikant øger kortdistancekontakter, da DSG tilføjes til den konventionelle formaldehydkrydsbinding. Et forbedret signal kunne også observeres på lange og korte afstande direkte fra 2D-interaktionsmatricer.Rumsignaler er CRISPR på lange afstande, og prikker dannet af kromatinsløjfer er mere fremtrædende på korte afstande. Ud over formaldehyd reducerer tværbinding med DSG tilfældige ligeringer, hvilket forbedrer den relative dækning i cis. Det er vigtigt ikke at miste celler under og efter tværbinding.Cellepiller kan være løse eller usynlige, og celler kan klæbe til pipettespidser i nogle af bufferne.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid-afledt metode til Transport gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Planter

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Fremskyndet stråling Biodosimetry automatiseret ved Dicentric kromosom identifikation (ADCI) og dosis estimering

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Poolet shRNA skærmen for reaktivering af MeCP2 på det inaktive X kromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation af Genome-wide kromatin kropsbygning Capture biblioteker fra stramt iscenesatte tidlige Drosophila embryoner

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

En ikke-tilfældig muse model for farmakologisk reaktivering af Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Forberedelse af meiotiske kromosomspreads fra zebrafisk spermatocytter

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikation af forstærker-promotor kontakter i embryolede organer ved kvantitative kromosom kropsbygning Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...