Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Nous tenons à remercier Denis Lafontaine pour le développement du protocole et Sergey Venev pour l’assistance bioinformatique. Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program à J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. est un chercheur du Howard Hughes Medical Institute.
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Étapes critiques pour la manipulation des cellules Bien qu’il soit possible d’utiliser un nombre inférieur de cellules d’entrée, ce protocole a été optimisé pour ~5 × 106 cellules par voie de séquençage (~400 M de lectures) pour assurer une complexité appropriée après un séquençage profond. Il est préférable de compter les cellules avant la fixation. Pour la génération de bibliothèques ultraprofondes, nous multiplions généralement le nombre de voies (et de cellules) jusqu’à ce que la profondeur de lecture souhaitée soit atteinte. Pour une fixation optimale, le milieu contenant du sérum doit être remplacé par du PBS avant la fixation par FA, et des solutions fixatrices doivent être ajoutées immédiatement et sans gradients de concentration15,22. Pour la récolte cellulaire, le grattage est préféré à la trypsinisation, car le passage d’une forme plus plate à une forme sphérique après trypsinisation pourrait affecter la conformation nucléaire. Après l’ajout de DSG, les granulés cellulaires lâches et grumeleux sont facilement perdus. Soyez prudent lorsque vous manipulez des cellules à ce stade et ajoutez jusqu’à 0,05% de BSA pour diminuer l’agglutination.
Modifications de la méthode Ce protocole a été développé à partir de cellules humaines17. Pourtant, sur la base de l’expérience avec la capture de conformation chromosomique, ce protocole devrait fonctionner pour la plupart des cellules eucaryotes. Pour une entrée significativement plus faible (~1 × 106 cellules), nous conseillons d’utiliser la moitié des volumes pour les procédures de lyse et de capture de conformation [étapes 2.1-2.4]. Cela permettrait également d’isoler l’ADN [étape 2.5] dans une centrifugeuse de table avec des tubes de 1,7 mL, ce qui pourrait améliorer la granulation pour de faibles concentrations d’ADN. La quantification de l’ADN (étape 2.6.6) indiquera comment procéder. Pour de faibles quantités d’ADN isolé (1-5 μg), nous suggérons de sauter la sélection de la taille (étape 3.3) et de procéder à l’élimination de la biotine après avoir réduit le volume de 130 μL à ~45 μL avec une UFC.
Ce protocole a été développé spécifiquement pour garantir des données de haute qualité après réticulation ultérieure avec FA et DSG et digestion avec DpnII et DdeI. Cependant, d’autres stratégies de réticulation telles que l’AF suivie de l’EGS (éthylène glycol bis(succinimidyl succinate)), qui est également utilisé dans ChIP-seq23 et-PET24, pourraient fonctionner tout aussi bien17. De même, différentes combinaisons d’enzymes, telles que DpnII et HinfI18 ou MboI, MseI et NlaIII19 peuvent être utilisées pour la digestion. Lors de l’adaptation des combinaisons d’enzymes, assurez-vous d’utiliser des nucléotides biotinylés qui peuvent remplir les surplombs spécifiques de 5' et utilisez les tampons les plus optimaux pour chaque cocktail. DpnII est livré avec son propre tampon et le fabricant d’enzymes recommande un tampon spécifique pour la digestion DdeI. Pourtant, pour la double digestion avec DpnII et DdeI dans ce protocole, Restriction Buffer est recommandé car il est évalué à 100% d’activité pour les deux enzymes.
Résolution des problèmes liés à la capture de conformation Les trois étapes clés de la capture de la conformation chromosomique: la réticulation, la digestion et la ligature ont toutes été effectuées avant que les résultats puissent être visualisés sur gel. Pour déterminer la qualité de chacune de ces trois étapes et discerner où des problèmes auraient pu survenir, des aliquotes avant (IC) et après digestion (DC) sont prélevées et chargées sur le gel avec l’échantillon de Hi-C ligaturé (Figure 2). Ce gel est utilisé pour déterminer la qualité de l’échantillon Hi-C et s’il vaut la peine de poursuivre le protocole. Sans l’IC et le CD, il est difficile d’identifier les étapes sous-optimales potentielles. Il convient de noter que la ligature sous-optimale peut être due à un problème de ligature elle-même, au remplissage ou à un problème de réticulation. Pour résoudre les problèmes de réticulation, veillez à ne pas utiliser plus de 1 × 10 à7 cellules par bibliothèque et commencez par de nouveaux réactifs de réticulation et des cellules propres (c’est-à-dire rincées avec du PBS). Pour la ligature, assurez-vous que les cellules et le mélange de ligature sont conservés sur la glace. Ajouter l’ADN ligase T4 juste avant l’incubation de 4 h à 16 °C et bien mélanger.
Dépannage de la préparation de la bibliothèque Si plus de 10 cycles de PCR sont nécessaires ou si aucun produit PCR ne peut être vu sur le gel après titrage PCR (Figure 4), il existe quelques options pour enregistrer l’échantillon Hi-C. En revenant au titrage PCR, la première option consiste à réessayer la PCR. S’il n’y a toujours pas assez de produit, il est possible de tenter une autre série de ligature de queue A et d’adaptateur (étape 3.6) après avoir lavé les billes deux fois avec 1x tampon TLE. Après cette ligature supplémentaire de la queue A et de l’adaptateur, on peut procéder au titrage PCR comme précédemment. S’il n’y a toujours pas de produit, la dernière option consiste à résoniser la fraction 0,8x de l’étape 3.3 et à partir de là.
Limitations et avantages de Hi-C3.0 Il est important de réaliser que Hi-C est une méthode basée sur la population qui capture la fréquence moyenne des interactions entre les paires de loci dans la population cellulaire. Certaines analyses informatiques sont conçues pour démêler les combinaisons de conformations d’une population25, mais en principe, Hi-C est aveugle aux différences entre les cellules. Bien qu’il soit possible d’effectuer une Hi-C monocellulaire26,27 et que des inférences informatiques puissent être faites28, la Hi-C monocellulaire ne convient pas pour obtenir des informations 3C à ultrahaute résolution. Une limitation supplémentaire de Hi-C est qu’il ne détecte que les interactions par paires. Pour détecter les interactions multicontacts, on peut soit utiliser des couteaux fréquents combinés avec un séquençage à lecture courte (Illumina)16 ou effectuer des multicontacts 3C29 ou 4C30, en utilisant le séquençage à lecture longue des plateformes PacBio ou Oxford Nanopore. Des dérivés Hi-C pour détecter spécifiquement les contacts entre et le long des chromatides sœurs ont également été développés31,32.
Bien que Hi-C19 et Micro-C33 puissent être utilisés pour générer des cartes de contact à des résolutions inférieures à la kilobase, les deux nécessitent une grande quantité de lectures de séquençage, ce qui peut devenir une entreprise coûteuse. Pour obtenir une résolution similaire ou même supérieure sans les coûts, l’enrichissement pour des régions génomiques spécifiques (capture-C34) ou des interactions protéiques spécifiques (-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) peuvent être appliqués. La force et l’inconvénient de ces applications d’enrichissement sont que seul un nombre limité d’interactions sont échantillonnées. Avec de tels enrichissements, l’aspect global de Hi-C (et l’option de normalisation globale) est perdu.
Importance et applications potentielles de Hi-C3.0 Ce protocole a été conçu pour permettre une 3C ultraprofonde haute résolution tout en détectant simultanément les caractéristiques de pliage à grande échelle telles que les TAD et les compartiments17 (Figure 6). Ce protocole commence avec 5 × 106 cellules par tube pour chaque bibliothèque Hi-C, ce qui devrait être plus que suffisant pour séquencer une ou deux voies sur une cellule d’écoulement pour obtenir jusqu’à 1 milliard de lectures d’extrémité appariée. Pour le séquençage ultraprofond, plusieurs tubes de 5 × 106 cellules doivent être préparés, en fonction du nombre de lectures cartographiées et de doublons PCR. À la résolution la plus élevée (<1 kb), les interactions en boucle se trouvent principalement entre les sites CTCF, mais les interactions promoteur-amplificateur peuvent également être détectées. Les lecteurs peuvent consulter Akgol Oksuz et coll.17 pour une description détaillée de l’analyse des données.

La capture de conformation chromosomique est utilisée depuis 20021. Fondamentalement, chaque variante de capture de conformation repose sur la fixation des interactions ADN-protéine et protéine-protéine pour préserver l’organisation de la chromatine 3D. Ceci est suivi par la fragmentation de l’ADN, généralement par la digestion de restriction, et, enfin, la ligature des extrémités d’ADN proches pour convertir les loci spatialement proximaux en séquences d’ADN covalentes uniques. Les protocoles 3C initiaux utilisaient la PCR pour échantillonner des interactions spécifiques « un-à-un ». Les tests 4C ultérieurs ont permis de détecter les interactions « un-à-tous »2, tandis que 5C a détecté les interactions « plusieurs-à-plusieurs »3. La capture de la conformation chromosomique a porté ses fruits après la mise en œuvre du séquençage à haut débit (NGS) de nouvelle génération, qui a permis de détecter des interactions génomiques « tout-à-tous » en utilisant Hi-C4 à l’échelle du génome et des techniques comparables telles que 3C-seq5, TCC6 et Micro-C 7,8 (voir également l’examen de Denker et De Laat9).
Dans Hi-C, des nucléotides biotinylés sont utilisés pour marquer les surplombs 5' après digestion et avant ligature (Figure 1). Cela permet de sélectionner des fragments correctement digérés et religués à l’aide de billes enrobées de streptavidine, ce qui les distingue de GCC10. Une mise à jour importante du protocole Hi-C a été mise en œuvre par Rao et coll.11, qui ont effectué la digestion et la ligature dans des noyaux intacts (c.-à-d. in situ) afin de réduire les faux produits de ligature. De plus, le remplacement de la digestion HindIII par la digestion MboI (ou DpnII) a réduit la taille des fragments et augmenté le potentiel de résolution de l’Hi-C. Cette augmentation a permis la détection de structures à relativement petite échelle et une localisation génomique plus précise des points de contact, tels que les boucles d’ADN entre petits éléments cis, par exemple les boucles entre les sites liés à la CTCF générées par l’extrusion de boucles11,12. Cependant, ce potentiel a un coût. Premièrement, une multiplication par deux de la résolution nécessite une multiplication par quatre (22) des lectures de séquençage13. Deuxièmement, les petites tailles de fragments augmentent la possibilité de confondre les fragments voisins non digérés avec les fragments digérés et relidés14. Comme mentionné, dans Hi-C, les fragments digérés et religués diffèrent des fragments non digérés par la présence de biotine à la jonction de ligature. Cependant, une élimination appropriée de la biotine des extrémités non ligaturées est nécessaire pour s’assurer que seules les jonctions de ligature sont abaissées14,15.
Avec la diminution du coût du NGS, il devient possible d’étudier le repliement des chromosomes plus en détail. Pour diminuer la taille des fragments d’ADN, et ainsi augmenter la résolution, le protocole Hi-C peut être adapté pour utiliser plus fréquemment des enzymes de restriction de coupe16 ou pour utiliser des combinaisons d’enzymes de restriction17,18,19. Alternativement, MNase 7,8 dans Micro-C et DNase dans DNase Hi-C20 peuvent être titrés pour obtenir une digestion optimale.
Une évaluation systématique récente des principes fondamentaux des méthodes 3C a montré que la détection des caractéristiques de repliement des chromosomes à chaque échelle de longueur s’améliorait considérablement avec la réticulation séquentielle avec 1% FA suivi de 3 mM DSG17. De plus, Hi-C avec digestion HindIII était la meilleure option pour détecter les caractéristiques de pliage à grande échelle, telles que les compartiments, et que Micro-C était supérieur pour détecter les caractéristiques de repliement à petite échelle telles que les boucles d’ADN. Ces résultats ont conduit au développement d’une stratégie unique et haute résolution « Hi-C 3.0 », qui utilise la combinaison de réticulateurs FA et DSG suivie d’une double digestion avec les endonucléases DpnII et DdeI21. Hi-C 3.0 fournit une stratégie efficace pour une utilisation générale car il détecte avec précision les caractéristiques de pliage sur toutes les échelles de longueur17. La partie expérimentale du protocole Hi-C 3.0 est détaillée ici et les résultats typiques auxquels on peut s’attendre après le séquençage sont présentés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figure 1 : Procédure Hi-C en six étapes. Les cellules sont fixées d’abord avec FA, puis DSG (1). Ensuite, la lyse précède une double digestion avec DdeI et DpnII (2). La biotine est ajoutée par remplissage en surplomb et les extrémités émoussées proximales sont ligaturées (3) avant la purification de l’ADN (4). La biotine est retirée des extrémités non ligaturées avant la sonication et la sélection de la taille (5). Enfin, l’extraction de la biotine permet la ligature de l’adaptateur et l’amplification de la bibliothèque par PCR (6). Abréviations : FA = formaldéhyde; DSG = glutarate de disuccinimidyl; B = Biotine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

La capture de conformation chromosomique (3C) est utilisée pour détecter les interactions tridimensionnelles de la chromatine. Typiquement, la réticulation chimique avec le formaldéhyde (FA) est utilisée pour fixer les interactions de la chromatine. Ensuite, la digestion de la chromatine avec une enzyme de restriction et la ligature subséquente des extrémités des fragments convertissent la proximité tridimensionnelle (3D) en produits de ligature uniques. Enfin, après l’inversion des réticulations, l’élimination des protéines et l’isolement de l’ADN, l’ADN est cisaillé et préparé pour le séquençage à haut débit. La fréquence de ligature de proximité des paires de loci est une mesure de la fréquence de leur colocalisation dans l’espace tridimensionnel dans une population cellulaire.
Une bibliothèque Hi-C séquencée fournit des informations à l’échelle du génome sur les fréquences d’interaction entre toutes les paires de loci. La résolution et la précision de Hi-C reposent sur une réticulation efficace qui maintient les contacts de la chromatine et la fragmentation fréquente et uniforme de la chromatine. Cet article décrit un protocole Hi-C in situ amélioré, Hi-C 3.0, qui augmente l’efficacité de la réticulation en combinant deux agents de réticulation (formaldéhyde [FA] et glutarate de disuccinimidyl [DSG]), suivi d’une digestion plus fine à l’aide de deux enzymes de restriction (DpnII et DdeI). Hi-C 3.0 est un protocole unique pour la quantification précise des caractéristiques de repliement du génome à des échelles plus petites telles que les boucles et les domaines d’association topologique (TAD), ainsi que des caractéristiques à des échelles plus grandes à l’échelle du noyau telles que les compartiments.

Les figures de ce manuscrit ont été générées à partir d’une expérience distincte et répliquée de celle publiée précédemment par Lafontaine et al.21. Après avoir obtenu des données de séquençage à haut débit, l’Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) a été utilisé pour traiter les données Hi-C. Un pipeline similaire peut être trouvé sur le portail de données du projet 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). En bref, le distillateur de pipeline Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) a été mis en œuvre pour (1) aligner les séquences de molécules Hi-C sur le génome de référence, (2) analyser l’alignement .sam et les fichiers de formulaire avec des paires Hi-C, (3) filtrer les doublons de PCR et (4) agréger les paires dans des matrices groupées d’interactions Hi-C. Ces matrices formatées HDF5, appelées refroidisseurs, peuvent ensuite être (1) visualisées sur un serveur HiGlass (https://higlass.io/) et (2) analysées à l’aide d’un grand ensemble d’outils de calcul open source présents dans la collection « cooltools » maintenue par l’Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) pour extraire et quantifier les caractéristiques de pliage telles que les compartiments, les TAD et les boucles.
Certains indicateurs de qualité des bibliothèques Hi-C3.0 peuvent être évalués immédiatement après avoir mappé des paires de lecture à un génome de référence, à l’aide de quelques mesures/indicateurs simples. Tout d’abord, ~50% des paires de lecture séquencées peuvent être mappées de manière unique pour les cellules humaines. En raison de la nature polymérique des chromosomes, la plupart de ces lectures cartographiées (~60%-90%) représentent des interactions au sein d’un chromosome (cis), avec des fréquences d’interaction décroissant rapidement avec l’augmentation de la distance génomique (désintégration dépendante de la distance). La désintégration dépendante de la distance peut être mieux visualisée dans un « diagramme d’échelle », qui montre la probabilité de contact (par bras chromosomique) en fonction de la distance génomique. Nous avons constaté que l’utilisation de différents agents de réticulation et enzymes peut modifier la désintégration dépendante de la distance à des distances à longue et à courte distance17. L’ajout de la réticulation DSG augmente la détectabilité des interactions à courte distance lorsqu’il est combiné avec des enzymes telles que la Mnase et des combinaisons de DpnII-DdeI qui produisent des fragments plus petits (Figure 6A).
La décroissance dépendante de la distance peut également être observée directement à partir des matrices d’interaction 2D : les interactions deviennent plus rares lorsqu’elles sont situées plus loin de la diagonale centrale (Figure 6B). De plus, les caractéristiques de repliement génomique, telles que les compartiments, les TAD et les boucles, peuvent être identifiées à partir de matrices Hi-C et de diagrammes de mise à l’échelle comme des écarts par rapport à la désintégration moyenne dépendant de la distance à l’échelle du génome. Il est important de noter que la réticulation avec la DSG en plus de l’AF diminue les ligatures aléatoires, qui ne sont pas restreintes en raison de la nature polymère des chromosomes et, par conséquent, plus susceptibles de se produire entre les chromosomes (en trans) (Figure 6C). La réduction de la ligature aléatoire entraîne une augmentation des rapports signal/bruit, en particulier pour les interactions intrachromosomiques et intrachromosomiques à très longue portée (>10-50 Mb).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figure 6 : Résultats représentatifs des bibliothèques Hi-C cartographiées et filtrées. (A) Tracés de mise à l’échelle avec probabilité de contact et son dérivé pour diverses enzymes, classés par longueur de fragment (en haut) et réticulation avec FA ou FA + DSG (en bas). La digestion avec la MNAse (microC) ou le DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) augmente considérablement les contacts à courte portée (en haut), tout comme l’ajout de DSG à FA (en bas). (B) Les colonnes montrent les cartes thermiques Hi-C de la digestion DpnII après réticulation FA et de la digestion DpnII ou DdeI après réticulation FA + DSG. Les flèches blanches montrent une force croissante des « points » après la réticulation DSG et la digestion DdeI, ce qui implique une meilleure détection des boucles d’ADN. Les rangées montrent différentes parties du chromosome 3 à une résolution croissante, alignées sur le panneau C: rangée supérieure: chromosome 3 entier (0-198,295,559 Mb); rangée du milieu : 186-196 Mb; rangée du bas : 191,0-191,5 Mo. (C) Graphiques de couverture pour les régions représentées en A. Les flèches noires indiquent la couverture inférieure (%cis en lecture) pour la réticulation FA uniquement. Abréviations : FA = formaldéhyde; DSG = glutarate de disuccinimidyl; chr = chromosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Toutes les lectures mappées ne sont pas utiles. Un deuxième indicateur de qualité est le nombre de doublons PCR. Il est très peu probable que des lectures exactes en double se produisent par hasard après la ligature et la sonication. Ainsi, ces lectures résultent probablement de l’amplification de la PCR et doivent être filtrées. Les doublons surviennent souvent lorsque trop de cycles de PCR sont nécessaires pour amplifier les bibliothèques de faible complexité. En général, pour Hi-C, la plupart des bibliothèques n’ont besoin que de 5 à 8 cycles d’amplification finale de la PCR, comme déterminé par la PCR de titrage (voir étape 3.9 ; Graphique 4). Cependant, des bibliothèques suffisamment complexes peuvent être obtenues même après 14 cycles d’amplification PCR.
Une autre catégorie de lectures de doublons, appelées duplications optiques, peut découler du processus d’amplification sur les plates-formes de séquençage Illumina qui utilisent des cellules de flux à motifs (telles que HiSeq4000). Les doublons optiques sont trouvés soit en surchargeant la cellule d’écoulement, ce qui fait que les (grands) clusters sont appelés deux clusters distincts, soit en regroupant localement la molécule d’origine appariée après un premier cycle de PCR. Parce que les deux types de duplications optiques sont locaux, ils peuvent être identifiés et distingués des doublons PCR par leur emplacement sur la cellule d’écoulement. Alors que les bibliothèques avec >15% de duplications PCR auraient besoin d’être régénérées, les bibliothèques avec des doublons optiques peuvent être rechargées après avoir optimisé le processus de chargement.
Tableau supplémentaire S1 : Tampons et solutions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 est un protocole Hi-C amélioré qui combine des agents de réticulation du formaldéhyde et du glutarate de disuccinimidyl avec un cocktail d’enzymes de restriction DpnII et DdeI pour augmenter le rapport signal sur bruit et la résolution de la détection des interactions chromatines.

Capture de la conformation chromosomique à travers les échelles de longueur

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Ce protocole détecte avec précision les caractéristiques de repliement des chromosomes sur plusieurs échelles de longueur avec un signal de fond faible. Par exemple, les interactions des amplificateurs promoteurs peuvent être analysées dans le contexte des compartiments chromosomiques. L’utilisation d’endonucléases de restriction contourne l’optimisation du niveau de digestion des matières premières.Aucune sélection par isolement de gel n’est requise pour capturer les produits de ligature. Le problème le plus courant est la perte de cellules après la fixation du DSG et la capture de suffisamment d’ADN pour produire des bibliothèques de haute qualité. Pour commencer, aspirez le milieu avec une pipette Pasteur couplée à un piège à vide de la plaque de 150 millimètres contenant 5 par 10 aux sixièmes cellules.Lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de HBSS. Pour réticuler les cellules, versez 23,125 millilitres de la solution de formaldéhyde à 1% dans la plaque de 15 centimètres. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, en berçant doucement l’assiette à la main toutes les deux minutes.Ensuite, ajoutez 1,25 millilitre de glycine 2,5 molaires et agitez doucement la plaque pour éteindre la réaction de réticulation, avant d’incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Poursuivre l’incubation sur la glace pendant 15 minutes pour arrêter la réticulation. Grattez les cellules de la plaque avec un grattoir de cellule ou un policier en caoutchouc et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres avec une pipette.Centrifuger la suspension à 1 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant par aspiration. Lavez la pastille une fois avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS. Ensuite, centrifugez à nouveau avant de procéder à la réticulation DSG.Pour la réticulation avec DSG, remettre en suspension les cellules granulées dans 9,9 millilitres de DPBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de DSG 300 millimolaires. Mélanger le tube par inversion et réticuler les cellules à température ambiante pendant 40 minutes sur un rotateur.Après la réticulation, ajoutez 1,925 millilitre de glycine 2,5 molaire, inversez pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les cellules à 2 000 fois G pendant 15 minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’albumine sérique bovine à 0,05% de DPBS avant de la transférer dans un tube de 1,7 millilitre. Centrifuger les cellules à 2 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.Congeler la pastille dans de l’azote liquide avant de procéder à la capture de confirmation chromosomique. Resuspendre l’aliquote cellulaire réticulée dans un millilitre de tampon de lyse glacée contenant 10 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase et transférer dans un homogénéisateur Dounce pendant 15 minutes d’incubation sur glace. Déplacez lentement le pilon A de haut en bas 30 fois pour homogénéiser les cellules et incuber pendant une minute pour permettre aux cellules de refroidir avant 30 autres coups.Après le dernier coup, transférez le lysat dans un tube de 1,7 millilitre. Centrifuger la suspension lysée à 2 500 fois G pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et agiter ou vortex pour remettre en suspension la pastille humide.Retirez autant de surnageant que possible pour obtenir une substance semblable à celle du yogourt avec un minimum de gruteaux. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de restriction glacé avant la centrifugation. Après le deuxième lavage, remettre en suspension la pastille dans 360 microlitres de tampon de restriction par pipetage après avoir ajouté environ 340 microlitres au volume de transfert de la pastille, selon la taille de la cellule.Mettez de côté 18 microlitres de lysat pour tester l’intégrité de la chromatine, ou CI.To le lysat restant, ajoutez 38 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 1% dans un tube de hi-C pour obtenir un volume total de 380 microlitres et mélangez soigneusement par pipetage sans introduire de bulles. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius sans agiter pendant 10 minutes pour ouvrir la chromatine. Ensuite, placez immédiatement le tube sur de la glace.Après avoir préparé le mélange de digestion avec Triton X-100, ajoutez 107 microlitres de ce mélange dans le tube hi-C pour obtenir un volume total de 487 microlitres et digérez la chromatine pendant une nuit à 37 degrés Celsius dans un thermomélangeur avec agitation par intervalle. Le lendemain, transférer les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour désactiver l’activité endonucléase restante. Après avoir placé l’échantillon sur de la glace, mettez de côté 10 microlitres de contrôle de la digestion, ou DC, et conservez-les à quatre degrés Celsius.Retirez la condensation du couvercle à l’aide d’une pipette ou en faisant tourner. Ensuite, ajoutez 58 microlitres de mélange de remplissage de biotine pour obtenir un volume total de 535 microlitres. Pipeter doucement sans former de bulles avant d’incuber à 23 degrés Celsius pendant quatre heures dans un thermomélangeur.Après l’incubation, ajoutez 665 microlitres de mélange de ligature, ce qui fait que le volume de l’échantillon est de 1 200 microlitres. Mélanger l’échantillon par pipetage et incuber à 16 degrés Celsius pendant quatre heures dans un thermomélangeur. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de protéinase-K en deux fractions dans le tube d’échantillon hi-C et incuber pendant la nuit à 65 degrés Celsius avec agitation par intervalle.Pour la purification de l’ADN, ajoutez de l’éthanol glacé à 100% et centrifugez les tubes à 18 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer complètement le surnageant du côté non granulé et sécher l’échantillon à l’air pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les granulés soient visiblement secs. Une fois les granulés secs, solubilisez-les dans 450 microlitres de Tris à faible teneur en EDTA par pipetage ou tourbillonnage.Transférer la suspension solubilisée dans une unité de filtration centrifuge de 0,5 millimètre, ou UFC, avec une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons. Centrifuger le CFU à la vitesse maximale pendant 10 minutes et jeter l’écoulement. Après le deuxième lavage, ajoutez 80 microlitres de Tris à faible EDTA dans la colonne.Transformez la colonne en un nouveau tube de collecte pour deux minutes de centrifugation à vitesse maximale. Enfin, chargez les échantillons sur un gel d’agarose à 0,8%. Le gel d’agarose avec les résultats du titrage PCR a démontré que la plupart des bibliothèques nécessitent cinq à huit cycles d’amplification finale de la PCR.La digestion cellulaire de la bibliothèque finale de PCR amplifiée, observée par des fragments plus petits sur un gel d’agarose, confirme la présence de jonctions de ligature appropriées et sert de contrôle de qualité avant le séquençage. Après séquençage, les données cartographiées ont montré que la combinaison de DpnII et de DdeI augmente considérablement les contacts à courte portée, comme l’ajout de DSG à la réticulation conventionnelle du formaldéhyde. Un signal amélioré a également pu être observé à de longues et courtes distances directement à partir de matrices d’interaction 2D.Les signaux compartimentés sont CRISPR à longue distance et les points formés par les boucles de chromatine sont plus importants à courte distance. En plus du formaldéhyde, la réticulation avec le DSG diminue les ligatures aléatoires, améliorant ainsi la couverture relative dans le cis. Il est important de ne pas perdre de cellules pendant et après la réticulation.Les granulés cellulaires peuvent être lâches ou invisibles, et les cellules peuvent adhérer aux extrémités des pipettes dans certains tampons.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Recherche

Génétique

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

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Rayonnement accéléré biodosimétrie automatisé par Identification des chromosomes dicentriques (ADCI) et l’Estimation de la Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

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Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

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