Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
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Wir danken Denis Lafontaine für die Protokollentwicklung und Sergey Venev für die bioinformatische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program an J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536) unterstützt. J.D. ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute.
Dieser Artikel unterliegt der HHMI-Richtlinie Open Access to Publications. HHMI-Laborleiter haben HHMI in ihren Forschungsartikeln zuvor eine nicht-exklusive CC BY 4.0-Lizenz und HHMI eine unterlizenzierbare Lizenz gewährt. Gemäß diesen Lizenzen kann das vom Autor akzeptierte Manuskript dieses Artikels unmittelbar nach der Veröffentlichung unter einer CC BY 4.0-Lizenz frei verfügbar gemacht werden.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Kritische Schritte für das Zellhandling Obwohl es möglich ist, eine geringere Anzahl von Eingangszellen zu verwenden, wurde dieses Protokoll für ~5 × 106 Zellen pro Sequenzierungsspur (~400 M Lesevorgänge) optimiert, um eine angemessene Komplexität nach der tiefen Sequenzierung zu gewährleisten. Zellen werden am besten vor der Fixierung gezählt. Für die Generierung von Ultradeep-Bibliotheken multiplizieren wir in der Regel die Anzahl der Lanes (und Zellen), bis die gewünschte Lesetiefe erreicht ist. Für eine optimale Fixierung sollte das serumhaltige Medium vor der FA-Fixierung durch PBS ersetzt werden, und Fixierlösungen sollten sofort und ohne Konzentrationsgradienten15,22 hinzugefügt werden. Für die Zellernte wird das Schaben der Trypsinisierung vorgezogen, da der Übergang von einer flacheren zu einer kugelförmigen Form nach der Trypsinisierung die Kernkonformation beeinflussen könnte. Nach der Zugabe von DSG gehen lose und klumpige Zellpellets leicht verloren. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Zellen in diesem Stadium und fügen Sie bis zu 0,05% BSA hinzu, um die Verklumpung zu verringern.
Änderungen an der Methode Dieses Protokoll wurde unter Verwendung menschlicher Zellenentwickelt 17. Basierend auf Erfahrungen mit der Erfassung von Chromosomen sollte dieses Protokoll jedoch für die meisten eukaryotischen Zellen funktionieren. Für einen signifikant geringeren Input (~1 × 106 Zellen) empfehlen wir, die Hälfte der Volumina für die Lyse- und Exterieurerfassungsverfahren zu verwenden [Schritte 2.1-2.4]. Dies würde auch die DNA-Isolierung [Schritt 2.5] in einer Tischzentrifuge mit 1,7-ml-Röhrchen ermöglichen, was die Pelletierung bei niedrigen DNA-Konzentrationen verbessern könnte. Die Quantifizierung der DNA (Schritt 2.6.6) zeigt das weitere Vorgehen an. Für geringe Mengen isolierter DNA (1-5 μg) empfehlen wir, die Größenauswahl (Schritt 3.3) zu überspringen und mit der Biotinentfernung fortzufahren, nachdem das Volumen mit einer KBE von 130 μL auf ~45 μL reduziert wurde.
Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um qualitativ hochwertige Daten nach anschließender Vernetzung mit FA und DSG und Aufschluss mit DpnII und DdeI zu gewährleisten. Alternative Vernetzungsstrategien wie FA gefolgt von EGS (Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat)), das auch in ChIP-seq23 und ChIA-PET24 verwendet wird, könnten jedoch ebenso gut funktionieren17. Ebenso können verschiedene Enzymkombinationen wie DpnII und HinfI18 oder MboI, MseI und NlaIII19 für die Verdauung verwendet werden. Achten Sie bei der Anpassung von Enzymkombinationen darauf, biotinylierte Nukleotide zu verwenden, die die spezifischen 5'-Überhänge ausfüllen können, und verwenden Sie die optimalen Puffer für jeden Cocktail. DpnII wird mit einem eigenen Puffer geliefert und der Enzymhersteller empfiehlt einen speziellen Puffer für die DdeI-Verdauung. Für die Doppelverdauung mit DpnII und DdeI in diesem Protokoll wird jedoch Restriction Buffer empfohlen, da es für beide Enzyme mit 100% Aktivität bewertet wird.
Fehlerbehebung bei der Konformationserfassung Die drei wichtigsten Schritte bei der Erfassung der Chromosomenkonformation: Crosslinking, Verdauung und Religation wurden alle durchgeführt, bevor die Ergebnisse auf Gel visualisiert werden können. Um die Qualität jedes dieser drei Schritte zu bestimmen und zu erkennen, wo Probleme aufgetreten sein könnten, werden Aliquots vor (CI) und nach dem Aufschluss (DC) entnommen und zusammen mit der ligierten Hi-C-Probe auf das Gel geladen (Abbildung 2). Dieses Gel wird verwendet, um die Qualität der Hi-C-Probe zu bestimmen und ob es sich lohnt, das Protokoll fortzusetzen. Ohne CI und DC ist es schwierig, potenzielle suboptimale Schritte zu lokalisieren. Es ist erwähnenswert, dass eine suboptimale Ligatur auf ein Problem in der Ligatur selbst, das Ausfüllen oder ein Problem mit der Vernetzung zurückzuführen sein kann. Um Probleme bei der Vernetzung zu beheben, achten Sie darauf, nicht mehr als 1 × 107 Zellen pro Bibliothek zu verwenden, und beginnen Sie mit frischen Vernetzungsreagenzien und sauberen Zellen (d. h. mit PBS gespült). Stellen Sie für die Ligatur sicher, dass Zellen und Ligationsmischung auf Eis gehalten werden. T4-DNA-Ligase kurz vor der 4-stündigen Inkubation bei 16 °C hinzufügen und gut mischen.
Problembehandlung bei der Bibliotheksvorbereitung Wenn mehr als 10 PCR-Zyklen erforderlich sind oder nach der PCR-Titration kein PCR-Produkt auf Gel zu sehen ist (Abbildung 4), gibt es einige Möglichkeiten, die Hi-C-Probe zu speichern. Nach der PCR-Titration besteht die erste Möglichkeit darin, die PCR erneut zu versuchen. Wenn immer noch nicht genügend Produkt vorhanden ist, ist es möglich, nach zweimaligem Waschen der Perlen mit 1x TLE-Puffer eine weitere Runde A-Tailing und Adapterligation (Schritt 3.6) zu versuchen. Nach dieser zusätzlichen A-Tailing und Adapterligatur kann man wie bisher zur PCR-Titration übergehen. Wenn immer noch kein Produkt vorhanden ist, besteht die letzte Option darin, den 0,8x-Anteil aus Schritt 3.3 zu wiederholen und von dort aus fortzufahren.
Einschränkungen und Vorteile von Hi-C3.0 Es ist wichtig zu wissen, dass Hi-C eine populationsbasierte Methode ist, die die durchschnittliche Häufigkeit von Interaktionen zwischen Loci-Paaren in der Zellpopulation erfasst. Einige Computeranalysen sind darauf ausgelegt, Kombinationen von Konformationen aus einer Population25 zu entwirren, aber im Prinzip ist Hi-C blind für Unterschiede zwischen Zellen. Obwohl es möglich ist, Einzelzell-Hi-C26,27 durchzuführen und rechnerische Schlussfolgerungen28 zu ziehen, ist Einzelzell-Hi-C nicht geeignet, ultrahochauflösende 3C-Informationen zu erhalten. Eine weitere Einschränkung von Hi-C besteht darin, dass es nur paarweise Wechselwirkungen erkennt. Um Multikontakt-Interaktionen zu erkennen, kann man entweder häufige Cutter in Kombination mit Short-Read-Sequenzierung (Illumina)16 verwenden oder Multicontact 3C29 oder 4C30 mit Long-Read-Sequenzierung von PacBio- oder Oxford Nanopore-Plattformen durchführen. Hi-C-Derivate zur spezifischen Detektion von Kontakten zwischen und entlang von Schwesterchromatiden wurden ebenfalls entwickelt31,32.
Obwohl Hi-C19 und Micro-C33 verwendet werden können, um Kontaktkarten mit Subkilobasenauflösungen zu erstellen, erfordern beide eine große Menge an Sequenzierungslesevorgängen, was zu einem kostspieligen Unterfangen werden kann. Um ohne Kosten eine ähnliche oder sogar höhere Auflösung zu erreichen, kann eine Anreicherung für bestimmte genomische Regionen (capture-C 34) oder spezifische Proteininteraktionen (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37) angewendet werden. Die Stärke und der Nachteil dieser Anreicherungsanwendungen besteht darin, dass nur eine begrenzte Anzahl von Interaktionen untersucht wird. Mit solchen Anreicherungen geht der globale Aspekt von Hi-C (und die Option der globalen Normalisierung) verloren.
Bedeutung und Einsatzmöglichkeiten von Hi-C3.0 Dieses Protokoll wurde entwickelt, um hochauflösendes, ultratiefes 3C zu ermöglichen und gleichzeitig großflächige Faltmerkmale wie TADs und Fächer17 zu erkennen (Abbildung 6). Dieses Protokoll beginnt mit 5 × 106 Zellen pro Röhre für jede Hi-C-Bibliothek, was mehr als genug Material sein sollte, um eine oder zwei Bahnen auf einer Flusszelle zu sequenzieren, um bis zu 1 Milliarde Paired-End-Lesevorgänge zu erhalten. Für die ultratiefe Sequenzierung sollten mehrere Röhrchen mit 5 × 106 Zellen vorbereitet werden, abhängig von der Anzahl der kartierten Reads und PCR-Duplikate. Bei der höchsten Auflösung (<1 kb) werden Looping-Interaktionen meist zwischen CTCF-Stellen gefunden, aber auch Promotor-Enhancer-Interaktionen können nachgewiesen werden. Leser können sich auf Akgol Oksuz et al.17 für eine detaillierte Beschreibung der Datenanalyse beziehen.

Chromosomenkonformationserfassung wird seit 2002 verwendet1. Grundsätzlich beruht jede Konformationserfassungsvariante auf der Fixierung von DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen, um die 3D-Chromatinorganisation zu erhalten. Es folgt eine DNA-Fragmentierung, in der Regel durch Restriktionsverdauung, und schließlich endet die Religation der nahe gelegenen DNA, um räumlich proximale Loci in einzigartige kovalente DNA-Sequenzen umzuwandeln. Anfängliche 3C-Protokolle verwendeten PCR, um spezifische "Eins-zu-Eins"-Interaktionen abzutasten. Nachfolgende 4C-Assays ermöglichten den Nachweis von "One-to-all"-Interaktionen2, während 5C "many-to-many"-Interaktionen3 detektierten. Die Erfassung von Chromosomenkonformationen kam nach der Implementierung der Hochdurchsatzsequenzierung (NGS) der nächsten Generation, die den Nachweis von "all-to-all" genomischen Interaktionen mit genomweitem Hi-C4 und vergleichbaren Techniken wie 3C-seq5, TCC6 und Micro-C7,8 ermöglichte, vollständig zum Tragen (siehe auch Review von Denker und De Laat9).
In Hi-C werden biotinylierte Nukleotide verwendet, um 5′-Überhänge nach dem Verdauung und vor der Ligation zu markieren (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Auswahl von richtig verdauten und religierten Fragmenten mit Streptavidin-beschichteten Perlen und unterscheidet sie von GCC10. Eine wichtige Aktualisierung des Hi-C-Protokolls wurde von Rao et al.11 implementiert, die die Verdauung und Religation in intakten Kernen (d.h. in situ) durchführten, um falsche Ligaturprodukte zu reduzieren. Darüber hinaus reduzierte der Ersatz des HindIII-Aufschlusses durch den MboI- (oder DpnII-) Aufschluss die Fragmentgröße und erhöhte das Auflösungspotenzial von Hi-C. Dieser Anstieg ermöglichte den Nachweis relativ kleiner Strukturen und eine genauere genomische Lokalisierung von Kontaktpunkten, wie z.B. DNA-Schleifen zwischen kleinen cis-Elementen, z.B. Schleifen zwischen CTCF-gebundenen Stellen, die durch Schleifenextrusionerzeugt werden 11,12. Dieses Potenzial hat jedoch seinen Preis. Erstens erfordert eine zweifache Erhöhung der Auflösung eine vierfache (22) Erhöhung der Sequenzierungslesevorgänge13. Zweitens erhöhen die kleinen Fragmentgrößen die Möglichkeit, unverdaute benachbarte Fragmente mit verdauten und religierten Fragmenten zu verwechseln14. Wie bereits erwähnt, unterscheiden sich bei Hi-C verdaute und religierte Fragmente von unverdauten Fragmenten durch die Anwesenheit von Biotin an der Ligationsverbindung. Es ist jedoch eine ordnungsgemäße Biotinentfernung von unligierten Enden erforderlich, um sicherzustellen, dass nur Ligationsverbindungen nach unten gezogenwerden 14,15.
Mit den sinkenden Kosten von NGS wird es möglich, die Chromosomenfaltung genauer zu untersuchen. Um die Größe von DNA-Fragmenten zu verringern und dadurch die Auflösung zu erhöhen, kann das Hi-C-Protokoll angepasst werden, um häufiger schneidende Restriktionsenzyme16 oder Kombinationen von Restriktionsenzymen 17,18,19 zu verwenden. Alternativ können MNase 7,8 in Micro-C und DNase in DNase Hi-C20 titriert werden, um eine optimale Verdauung zu erreichen.
Eine kürzlich durchgeführte systematische Auswertung der Grundlagen von 3C-Methoden zeigte, dass sich die Detektion von Chromosomenfaltungsmerkmalen auf jeder Längenskala mit sequentieller Vernetzung mit 1% FA gefolgt von 3 mM DSG17 stark verbesserte. Darüber hinaus war Hi-C mit HindIII-Aufschluss die beste Option zum Nachweis großräumiger Faltungsmerkmale wie Kompartimente, und Micro-C war bei der Erkennung kleiner Faltungsmerkmale wie DNA-Schleifen überlegen. Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung einer einzigen, hochauflösenden "Hi-C 3.0"-Strategie, die die Kombination von FA- und DSG-Vernetzern gefolgt von einem Doppelaufschluss mit DpnII- und DdeI-Endonukleasen verwendet21. Hi-C 3.0 bietet eine effektive Strategie für den allgemeinen Gebrauch, da es Faltmerkmale über alle Längenskalen hinweg genau erkennt17. Der experimentelle Teil des Hi-C 3.0-Protokolls wird hier detailliert beschrieben und typische Ergebnisse, die nach der Sequenzierung zu erwarten sind, werden gezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Abbildung 1: Hi-C-Verfahren in sechs Schritten. Die Zellen werden zuerst mit FA und dann mit DSG fixiert (1). Dann geht die Lyse einer Doppelverdauung mit DdeI und DpnII voraus (2). Biotin wird durch Überhangfüllung hinzugefügt und proximal abgestumpfte Enden werden vor der DNA-Reinigung ligiert (3). Biotin wird vor der Beschallung und Größenauswahl von unligierten Enden entfernt (5). Schließlich ermöglicht das Pull-down von Biotin eine Adapterligation und Bibliotheksamplifikation durch PCR (6). Abkürzungen: FA = Formaldehyd; DSG = Disuccinimidylglutarat; B = Biotin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

Chromosomenkonformationserfassung (3C) wird verwendet, um dreidimensionale Chromatin-Wechselwirkungen zu erkennen. Typischerweise wird chemische Vernetzung mit Formaldehyd (FA) verwendet, um Chromatinwechselwirkungen zu fixieren. Dann wandelt der Chromatinaufschluss mit einem Restriktionsenzym und die anschließende Religation der Fragmentenden dreidimensionale (3D) Nähe in einzigartige Ligationsprodukte um. Schließlich wird die DNA nach der Umkehrung der Vernetzungen, der Proteinentfernung und der DNA-Isolierung geschert und für die Hochdurchsatzsequenzierung vorbereitet. Die Häufigkeit der Annäherungsligation von Loci-Paaren ist ein Maß für die Häufigkeit ihrer Kolokalisation im dreidimensionalen Raum in einer Zellpopulation.
Eine sequenzierte Hi-C-Bibliothek liefert genomweite Informationen über Interaktionsfrequenzen zwischen allen Loci-Paaren. Die Auflösung und Präzision von Hi-C beruht auf einer effizienten Vernetzung, die Chromatinkontakte und eine häufige und gleichmäßige Fragmentierung des Chromatins aufrechterhält. Dieser Artikel beschreibt ein verbessertes In-situ-Hi-C-Protokoll, Hi-C 3.0, das die Effizienz der Vernetzung durch Kombination von zwei Vernetzern (Formaldehyd [FA] und Disuccinimidylglutarat [DSG]) erhöht, gefolgt von einem feineren Aufschluss mit zwei Restriktionsenzymen (DpnII und DdeI). Hi-C 3.0 ist ein einziges Protokoll für die genaue Quantifizierung von Genomfaltungsmerkmalen auf kleineren Skalen wie Schleifen und topologisch assoziierenden Domänen (TADs) sowie von Merkmalen auf größeren kernweiten Skalen wie Kompartimenten.

Die Abbildungen in diesem Manuskript stammen aus einem separaten, replizierten Experiment des zuvor von Lafontaine et al.21 veröffentlichten. Nach der Gewinnung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten wurde das Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) zur Verarbeitung der Hi-C-Daten verwendet. Eine ähnliche Pipeline findet sich auf dem Datenportal des Projekts 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kurz gesagt, der Nextflow Pipeline Distiller (https://github.com/open2c/distiller-nf) wurde implementiert, um (1) die Sequenzen von Hi-C-Molekülen auf das Referenzgenom auszurichten, (2) .sam Alignment und Formulardateien mit Hi-C-Paaren zu analysieren, (3) PCR-Duplikate zu filtern und (4) Paare in binned Matrices von Hi-C-Interaktionen zu aggregieren. Diese HDF5-formatierten Matrizen, die als Kühler bezeichnet werden, können dann (1) auf einem HiGlass-Server (https://higlass.io/) angezeigt und (2) mit einem großen Satz von Open-Source-Berechnungswerkzeugen analysiert werden, die in der vom Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) verwalteten Sammlung "cooltools" vorhanden sind, um Faltmerkmale wie Fächer, TADs und Schleifen zu extrahieren und zu quantifizieren.
Einige Qualitätsindikatoren der Hi-C3.0-Bibliotheken können unmittelbar nach der Zuordnung von Lesepaaren zu einem Referenzgenom mit wenigen einfachen Metriken/Indikatoren bewertet werden. Erstens können typischerweise ~50% der sequenzierten Lesepaare eindeutig für menschliche Zellen abgebildet werden. Aufgrund der polymeren Natur von Chromosomen stellen die meisten dieser kartierten Lesevorgänge (~60%-90%) Interaktionen innerhalb eines Chromosoms (cis) dar, wobei die Interaktionsfrequenzen mit zunehmender genomischer Entfernung (entfernungsabhängiger Zerfall) schnell abnehmen. Der entfernungsabhängige Zerfall lässt sich am besten in einem "Skalierungsdiagramm" visualisieren, das die Kontaktwahrscheinlichkeit (pro Chromosomenarm) als Funktion der genomischen Distanz zeigt. Wir fanden heraus, dass die Verwendung verschiedener Vernetzer und Enzyme den entfernungsabhängigen Zerfall auf Lang- und Kurzstreckenentfernungen verändern kann17. Die Zugabe von DSG-Vernetzung erhöht die Detektierbarkeit von Wechselwirkungen auf kurze Distanzen, wenn sie mit Enzymen wie Mnase und Kombinationen von DpnII-DdeI kombiniert wird, die kleinere Fragmente erzeugen (Abbildung 6A).
Entfernungsabhängiger Zerfall kann auch direkt aus 2D-Interaktionsmatrizen beobachtet werden: Wechselwirkungen werden seltener, wenn sie weiter von der zentralen Diagonale entfernt sind (Abbildung 6B). Darüber hinaus können genomische Faltungsmerkmale wie Kompartimente, TADs und Schleifen aus Hi-C-Matrizen und Skalierungsdiagrammen als Abweichungen vom allgemeinen genomweiten durchschnittlichen entfernungsabhängigen Zerfall identifiziert werden. Wichtig ist, dass die Vernetzung mit DSG zusätzlich zu FA die zufälligen Ligaturen verringert, die aufgrund der Polymernatur der Chromosomen uneingeschränkt sind und daher eher zwischen Chromosomen (in trans) auftreten (Abbildung 6C). Die Reduzierung der zufälligen Ligatur führt zu erhöhten Signal-Rausch-Verhältnissen, insbesondere bei interchromosomalen und intrachromosomalen Interaktionen mit sehr großer Reichweite (>10-50 Mb).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von kartierten und gefilterten Hi-C-Bibliotheken. (A) Skalierungsdiagramme mit Kontaktwahrscheinlichkeit und deren Ableitung für verschiedene Enzyme, geordnet nach Fragmentlänge (oben) und Vernetzung mit FA oder FA + DSG (unten). Der Aufschluss mit MNAse (microC) oder DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) erhöht die Kurzstreckenkontakte (oben) signifikant, ebenso wie die Zugabe von DSG zu FA (unten). (B) Spalten zeigen Hi-C-Heatmaps der DpnII-Vergärung nach FA-Vernetzung und der DpnII- oder DdeI-Verdauung nach FA+DSG-Vernetzung. Weiße Pfeile zeigen eine zunehmende Stärke der "Punkte" nach DSG-Vernetzung und DdeI-Verdauung, was eine bessere Erkennung von DNA-Schleifen impliziert. Die Zeilen zeigen verschiedene Teile von Chromosom 3 mit zunehmender Auflösung, ausgerichtet mit Panel C: obere Reihe: gesamtes Chromosom 3 (0-198,295,559 Mb); mittlere Reihe: 186-196 Mb; untere Reihe: 191.0-191.5 Mb. (C) Erfassungsdiagramme für die in A dargestellten Regionen. Schwarze Pfeile zeigen die geringere Abdeckung (%cis-Lesevorgänge) für die reine FA-Vernetzung. Abkürzungen: FA = Formaldehyd; DSG = Disuccinimidylglutarat; CHR = Chromosom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Nicht alle zugeordneten Lesevorgänge sind nützlich. Ein zweiter Qualitätsindikator ist die Anzahl der PCR-Duplikate. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass exakte doppelte Lesevorgänge zufällig nach Ligatur und Beschallung auftreten. Daher resultierten solche Messwerte wahrscheinlich aus der PCR-Amplifikation und müssen herausgefiltert werden. Duplikate entstehen oft, wenn zu viele PCR-Zyklen erforderlich sind, um Bibliotheken mit geringer Komplexität zu amplifizieren. Im Allgemeinen benötigen die meisten Bibliotheken für Hi-C nur 5-8 Zyklen der endgültigen PCR-Amplifikation, wie durch Titrations-PCR bestimmt (siehe Schritt 3.9; Abbildung 4). Bibliotheken mit ausreichender Komplexität können jedoch auch nach 14 Zyklen der PCR-Amplifikation erhalten werden.
Eine weitere Kategorie von Duplicate Reads, sogenannte optische Duplikate, kann durch den Verstärkungsprozess auf Illumina-Sequenzierungsplattformen entstehen, die strukturierte Flusszellen verwenden (wie HiSeq4000). Optische Duplikate werden entweder durch Überlastung der Flusszelle gefunden, wodurch (große) Cluster als zwei separate Cluster bezeichnet werden, oder durch lokale Reclusterung des ursprünglichen gepaarten Moleküls nach einer ersten Runde der PCR. Da beide Arten von optischen Duplikaten lokal sind, können sie identifiziert und von PCR-Duplikaten durch ihre Position auf der Flusszelle unterschieden werden. Während Bibliotheken mit >15% PCR-Duplikaten regeneriert werden müssten, können Bibliotheken mit optischen Duplikaten nach Optimierung des Ladevorgangs neu geladen werden.
Zusatztabelle S1: Puffer und Lösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Dieses Protokoll erkennt präzise Chromosomenfaltungsmerkmale über mehrere Längenskalen mit einem niedrigen Hintergrundsignal. So können beispielsweise Promotor-Enhancer-Interaktionen im Kontext von Chromosomenkompartimenten analysiert werden. Durch die Verwendung von Restriktionsendonukleasen wird die Optimierung des Verdauungsniveaus des Eingangsmaterials umgangen.Es ist keine Auswahl durch Gelisolierung erforderlich, um Ligationsprodukte zu erfassen. Das häufigste Problem ist der Verlust von Zellen nach DSG-Fixierung und der Erfassung von genügend DNA, um qualitativ hochwertige Bibliotheken zu produzieren. Um zu beginnen, saugen Sie das Medium mit einer Pasteur-Pipette gekoppelt an eine Vakuumfalle von der 150-Millimeter-Platte mit 5 x 10 zu den sechsten Zellen ab.Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Milliliter HBSS. Um die Zellen zu vernetzen, gießen Sie 23,125 Milliliter der 1%igen Formaldehydlösung in die 15-Zentimeter-Platte. Bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren und die Platte alle zwei Minuten vorsichtig von Hand schaukeln.Als nächstes fügen Sie 1,25 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Vernetzungsreaktion zu löschen, bevor Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Setzen Sie die Inkubation auf Eis für 15 Minuten fort, um die Vernetzung zu beenden. Schaben Sie die Zellen mit einem Zellschaber oder Gummipolizisten von der Platte ab und geben Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand durch Aspiration. Waschen Sie das Pellet einmal mit 10 Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Dann zentrifugieren Sie erneut, bevor Sie mit der DSG-Vernetzung fortfahren.Zur Vernetzung mit DSG resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 9,9 Milliliter DPBS. Dann fügen Sie 100 Mikroliter 300-Millimolar-DSG hinzu. Mischen Sie das Rohr durch Inversion und vernetzen Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 40 Minuten auf einem Rotator.Nach der Vernetzung 1,925 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzufügen, zum Mischen invertieren und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.000 mal G für 15 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 0,05% Rinderserumalbumin DPBS, bevor Sie es in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.Frieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff ein, bevor Sie mit der Chromosomenbestätigung fortfahren. Resuspendieren Sie das vernetzte Zellaliquot in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer, der 10 Mikroliter Proteaseinhibitor-Cocktail enthält, und überführen Sie es für 15 Minuten Inkubation auf Eis in einen Dounce-Homogenisator. Bewegen Sie Stößel A langsam 30 Mal auf und ab, um die Zellen zu homogenisieren, und inkubieren Sie für eine Minute, damit die Zellen vor weiteren 30 Schlägen abkühlen können.Nach dem letzten Hub das Lysat in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die lysierte Suspension bei 2.500 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und streichen Sie oder Wirbel, um das nasse Pellet zu resuspendieren.Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, um eine joghurtähnliche Substanz mit minimalen Klumpen zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet vor der Zentrifugation in 500 Mikroliter eiskaltem Restriktionspuffer. Nach dem zweiten Waschgang wird das Pellet in 360 Mikroliter Restriktionspuffer durch Pipettieren resuspendiert, nachdem das Verschleppungsvolumen des Pellets je nach Zellgröße um ca. 340 Mikroliter erhöht wurde.Legen Sie 18 Mikroliter Lysat beiseite, um die Chromatinintegrität zu testen, oder CI.To Sie das verbleibende Lysat, fügen Sie 38 Mikroliter 1% Natriumdodecylsulfat zu Hi-C-Röhrchen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 380 Mikrolitern zu erhalten, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren ohne Blaseneinführung. Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius ohne Schütteln für 10 Minuten, um das Chromatin zu öffnen. Dann legen Sie die Tube sofort auf Eis.Nach der Zubereitung der Aufschlussmischung mit Triton X-100 107 Mikroliter dieser Mischung in das Hi-C-Rohr geben, um ein Gesamtvolumen von 487 Mikrolitern zu erhalten, und das Chromatin über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer mit Intervallschütteln verdauen. Am nächsten Tag werden die Proben für 20 Minuten auf 65 Grad Celsius überführt, um die verbleibende Endonukleaseaktivität zu deaktivieren. Nachdem Sie die Probe auf Eis gelegt haben, legen Sie 10 Mikroliter Verdauungskontrolle (DC) beiseite und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie das Kondenswasser mit einer Pipette oder durch Schleudern vom Deckel. Dann fügen Sie 58 Mikroliter Biotin-Füllmischung hinzu, um ein Gesamtvolumen von 535 Mikrolitern zu erhalten. Pipettieren Sie vorsichtig, ohne Blasen zu bilden, bevor Sie vier Stunden lang bei 23 Grad Celsius in einem Thermomixer inkubieren.Nach der Inkubation fügen Sie 665 Mikroliter Ligationsmischung hinzu, so dass das Probenvolumen 1, 200 Mikroliter beträgt. Die Probe wird durch Pipettieren gemischt und vier Stunden lang bei 16 Grad Celsius in einem Thermomischer inkubiert. Als nächstes werden 50 Mikroliter Proteinase-K in zwei Fraktionen in das Hi-C-Probenröhrchen gegeben und über Nacht bei 65 Grad Celsius mit Intervallschütteln inkubiert.Für die DNA-Reinigung fügen Sie 100% eiskaltes Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vollständig von der Nichtpelletseite und trocknen Sie die Probe 10 Minuten lang an der Luft oder bis die Pellets sichtbar trocken sind. Sobald die Pellets trocken sind, lösen Sie sie in 450 Mikroliter Tris low-EDTA durch Pipettieren oder Wirbeln.Die gelöste Suspension wird in eine 0,5-Millimeter-Zentrifugalfiltereinheit (CFU) mit einer Molekulargewichtsgrenze von drei Kilodaltonnen überführt. Zentrifugieren Sie die KBE 10 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss. Nach dem zweiten Waschgang 80 Mikroliter Tris Low-EDTA in die Säule geben.Verwandeln Sie die Säule in ein neues Sammelrohr für zwei Minuten Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit. Zum Schluss laden Sie die Proben auf ein 0,8%iges Agarose-Gel. Agarose-Gel mit PCR-Titrationsergebnissen zeigte, dass die meisten Bibliotheken fünf bis acht Zyklen der endgültigen PCR-Amplifikation benötigen.Der Zellverdau der endgültigen amplifizierten PCR-Bibliothek, wie er von kleineren Fragmenten auf einem Agarosegel beobachtet wird, bestätigt das Vorhandensein geeigneter Ligationsverbindungen und dient als Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung. Nach der Sequenzierung zeigten die abgebildeten Daten, dass die Kombination von DpnII und DdeI die Kurzstreckenkontakte signifikant erhöht, da DSG zur konventionellen Formaldehydvernetzung hinzugefügt wird. Ein verbessertes Signal konnte auch auf lange und kurze Entfernungen direkt aus 2D-Interaktionsmatrizen beobachtet werden.Kompartimentsignale sind CRISPR auf große Entfernungen und Punkte, die durch Chromatinschleifen gebildet werden, sind bei kurzen Entfernungen stärker ausgeprägt. Zusätzlich zu Formaldehyd verringert die Vernetzung mit DSG die zufälligen Ligaturen und verbessert die relative Abdeckung in cis. Es ist wichtig, während und nach der Vernetzung keine Zellen zu verlieren.Zellpellets können lose oder unsichtbar sein, und Zellen können in einigen der Puffer an Pipettenspitzen haften.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Beschleunigten Strahlung Biodosimetry automatisiert durch dizentrische Chromosom Identifikation (ADCI) und Abschätzung der Dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...