Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

ברצוננו להודות לדניס לפונטיין על פיתוח הפרוטוקול ולסרגיי ונב על הסיוע הביואינפורמטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות משותפת קרן 4D Nucleome תוכנית ל- J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). ג'יי.די הוא חוקר במכון הרפואי ע"ש הווארד יוז.
מאמר זה כפוף למדיניות הגישה הפתוחה לפרסומים של HHMI. ראשי המעבדות של HHMI העניקו בעבר רישיון CC BY 4.0 לא בלעדי לציבור ורישיון משנה ל-HHMI במאמרי המחקר שלהם. בהתאם לרישיונות אלה, ניתן להפוך את כתב היד המקובל על המחבר של מאמר זה לזמין באופן חופשי תחת רישיון CC BY 4.0 מיד עם פרסומו.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

שלבים קריטיים לטיפול בתאים למרות שניתן להשתמש במספר נמוך יותר של תאי קלט, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור ~ 5 × 106 תאים לכל נתיב ריצוף (~ 400 M קריאה) כדי להבטיח מורכבות נאותה לאחר ריצוף עמוק. התאים נספרים בצורה הטובה ביותר לפני הקיבוע. עבור הדור של ספריות אולטרה-עמוקות, אנו בדרך כלל מכפילים את מספר הנתיבים (והתאים) עד להגעה לעומק הקריאה הרצוי. לקיבוע אופטימלי, יש להחליף מדיום המכיל סרום ב- PBS לפני קיבוע FA, ולהוסיף פתרונות מקבעים באופן מיידי וללא שיפועי ריכוז15,22. עבור קצירת תאים, גירוד עדיף על פני טריפסיניזציה, מכיוון שהמעבר מצורה שטוחה יותר לצורה כדורית לאחר טריפסיניזציה עלול להשפיע על הקונפורמציה הגרעינית. לאחר תוספת של DSG, כדורי תאים רופפים ומגושמים הולכים לאיבוד בקלות. היזהר בעת טיפול בתאים בשלב זה והוסף עד 0.05% BSA כדי להפחית גושים.
שינויים בשיטה פרוטוקול זה פותח באמצעות תאים אנושיים17. עם זאת, בהתבסס על ניסיון עם לכידת קונפורמציה כרומוזומית, פרוטוקול זה אמור לעבוד עבור רוב התאים האאוקריוטים. עבור קלט נמוך משמעותית (~1 × 106 תאים), אנו ממליצים להשתמש במחצית מהנפחים עבור הליכי לכידת התזה והקונפורמציה [שלבים 2.1-2.4]. זה גם יאפשר לבצע בידוד דנ"א [שלב 2.5] בצנטריפוגה שולחנית עם צינורות של 1.7 מ"ל, מה שיכול לשפר את הכדוריות לריכוזי דנ"א נמוכים. כימות הדנ"א (שלב 2.6.6) יציין כיצד להמשיך. עבור כמויות נמוכות של דנ"א מבודד (1-5 מיקרוגרם), אנו מציעים לדלג על בחירת הגודל (שלב 3.3) ולהמשיך בהסרת ביוטין לאחר הקטנת הנפח מ-130 μL ל~45 μL עם CFU.
פרוטוקול זה פותח במיוחד כדי להבטיח נתונים באיכות גבוהה לאחר הצלבה לאחר קישור צולב עם FA ו- DSG ועיכול עם DpnII ו- DdeI. עם זאת, אסטרטגיות חלופיות של crosslinking כגון FA ואחריו EGS (אתילן גליקול ביס (succinimidyl succinate)), המשמש גם ב- ChIP-seq23 ו- ChIA-PET24, עשויות לעבוד באותה מידה17. באופן דומה, שילובי אנזימים שונים, כגון DpnII ו- HinfI18 או MboI, MseI ו- NlaIII19 יכולים לשמש לעיכול. כשאתם מתאימים שילובי אנזימים, הקפידו להשתמש בנוקלאוטידים שעברו ביוטינילציה שיכולים למלא את השלוחות הספציפיות של 5' ולהשתמש במאגרים האופטימליים ביותר לכל קוקטייל. DpnII מגיע עם מאגר משלו ויצרן האנזימים ממליץ על חיץ ספציפי לעיכול DdeI. עם זאת, עבור עיכול כפול עם DpnII ו- DdeI בפרוטוקול זה, מאגר ההגבלה מומלץ מכיוון שהוא מדורג ב- 100% פעילות עבור שני האנזימים.
פתרון בעיות בלכידת קונפורמציה שלושת השלבים המרכזיים בלכידת קונפורמציה של כרומוזומים: crosslinking, עיכול ו-religation בוצעו כולם לפני שניתן היה לדמיין את התוצאות על ג'ל. כדי לקבוע את האיכות של כל אחד משלושת השלבים האלה ולהבחין היכן היו יכולות להיווצר בעיות, אליקוטים לפני (CI) ואחרי העיכול (DC) נלקחים ונטענים על הג'ל יחד עם דגימת Hi-C קשירה (איור 2). ג'ל זה משמש לקביעת איכות מדגם Hi-C והאם יהיה כדאי להמשיך בפרוטוקול. ללא CI ו- DC, קשה לאתר שלבים תת-אופטימליים פוטנציאליים. ראוי לציין כי קשירת לא אופטימלית יכולה לנבוע מבעיה בקשירת עצמה, במילוי, או מבעיה בהצלבה. כדי לפתור בעיות של קישור צולב, הקפד לא להשתמש ביותר מ- 1 × 107 תאים לכל ספריה ולהתחיל עם ריאגנטים מוצלבים טריים ותאים נקיים (כלומר, שטופים עם PBS). לצורך קשירה, יש לוודא שהתאים ותערובת הקשירה נשמרים על הקרח. מוסיפים ליגאז DNA T4 ממש לפני הדגירה של 4 שעות ב-16 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב.
פתרון בעיות בהכנת ספרייה אם יש צורך ביותר מ-10 מחזורי PCR או אם לא ניתן לראות מוצר PCR על ג'ל לאחר טיטרציה של PCR (איור 4), יש כמה אפשרויות לשמור את דגימת ה-Hi-C. בעבודה חזרה מטיטרציית ה- PCR, האפשרות הראשונה היא לנסות את ה- PCR שוב. אם עדיין אין מספיק מוצר, ניתן לנסות סיבוב נוסף של זנב A וקשירת מתאם (שלב 3.6) לאחר שטיפת החרוזים פעמיים עם חיץ TLE 1x. לאחר קשירת A-tailing ומתאם נוספת זו, ניתן להמשיך לטיטרציית ה- PCR כמו קודם. אם עדיין אין מוצר, האפשרות האחרונה היא לשחזר את השבר 0.8x משלב 3.3 ולהמשיך משם.
מגבלות ויתרונות של Hi-C3.0 חשוב להבין כי Hi-C היא שיטה מבוססת אוכלוסייה הלוכדת את התדירות הממוצעת של אינטראקציות בין זוגות לוקוסים באוכלוסיית התא. חלק מהניתוחים החישוביים נועדו לנטרל שילובים של קונפורמציות מאוכלוסייה25, אך באופן עקרוני, Hi-C עיוור להבדלים בין תאים. למרות שניתן לבצע Hi-C חד-תאי26,27 וניתן להסיק מסקנות חישוביות 28, Hi-C חד-תאי אינו מתאים לקבלת מידע 3C ברזולוציה גבוהה במיוחד. מגבלה נוספת של Hi-C היא שהוא מזהה רק אינטראקציות זוגיות. כדי לזהות אינטראקציות רב-מגעיות, ניתן להשתמש בחותכים תכופים בשילוב עם ריצוף קריאה קצר (Illumina)16 או לבצע ריבוי מגעים 3C29 או 4C30, באמצעות רצף קריאה ארוך מפלטפורמות PacBio או Oxford Nanopore. נגזרות Hi-C לזיהוי ספציפי של מגעים בין ולאורך כרומטידים אחיות פותחו גםהן ב-31,32.
למרות שניתן להשתמש ב- Hi-C19 וב- Micro-C33 כדי ליצור מפות מגע ברזולוציות תת-קרקעיות, שתיהן דורשות כמות גדולה של קריאות רצף וזה יכול להפוך להתחייבות יקרה. כדי להגיע לרזולוציה דומה או אפילו גבוהה יותר ללא העלויות, ניתן ליישם העשרה עבור אזורים גנומיים ספציפיים (capture-C 34) או אינטראקציות חלבון ספציפיות (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). החוזק והחיסרון של יישומי העשרה אלה הוא שרק מספר מצומצם של אינטראקציות נדגמות. עם העשרה כזו, ההיבט הגלובלי של Hi-C (ואת האפשרות של נורמליזציה גלובלית) הוא איבד.
חשיבות ויישומים פוטנציאליים של Hi-C3.0 פרוטוקול זה תוכנן לאפשר רזולוציה גבוהה ואולטרה-עמוקה של 3C תוך זיהוי בו-זמני של תכונות קיפול בקנה מידה גדול כגון TADs ותאים17 (איור 6). פרוטוקול זה מתחיל עם 5 × 106 תאים לכל צינור עבור כל ספריית Hi-C, אשר אמור להיות יותר ממספיק חומר כדי לרצף נתיב אחד או שניים על תא זרימה כדי לקבל עד 1 מיליארד קריאות קצה זוגי. עבור ריצוף אולטרה-עמוק, יש להכין צינורות מרובים של 5 × 106 תאים, בהתאם למספר הקריאות הממופות וכפילויות PCR. ברזולוציה הגבוהה ביותר (<1 קילובייט), אינטראקציות לולאה נמצאות בעיקר בין אתרי CTCF, אך ניתן לזהות גם אינטראקציות מקדם-משפר. הקוראים יכולים לעיין ב- Akgol Oksuz et al.17 לתיאור מפורט של ניתוח הנתונים.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים נמצאת בשימוש מאז 20021. ביסודו של דבר, כל וריאנט לכידת קונפורמציה מסתמך על קיבוע של אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון כדי לשמר את ארגון הכרומטין התלת-ממדי. לאחר מכן מתבצע פיצול דנ"א, בדרך כלל על ידי הגבלת עיכול, ולבסוף, חיבור מחדש של קצוות דנ"א סמוכים כדי להמיר מוקדים פרוקסימליים מרחביים לרצפי דנ"א קוולנטיים ייחודיים. פרוטוקולי 3C ראשוניים השתמשו ב-PCR כדי לדגום אינטראקציות ספציפיות של "אחד על אחד". מבחני 4C מאוחרים יותר אפשרו זיהוי של אינטראקציות "אחד לכל"2, בעוד 5C זיהה אינטראקציות "רבים לרבים"3. לכידת קונפורמציית הכרומוזומים באה לידי ביטוי מלא לאחר יישום ריצוף הדור הבא בתפוקה גבוהה (NGS), שאיפשר זיהוי של אינטראקציות גנומיות "הכל לכל" באמצעות, Hi-C4 כלל-גנומי וטכניקות דומות כגון 3C-seq5, TCC6 ו- Micro-C 7,8 (ראו גם סקירה של Denker ו- De Laat9).
ב-Hi-C, נוקלאוטידים שעברו ביוטינילציה משמשים לסימון 5′ שלוחות לאחר העיכול ולפני הקשירה (איור 1). זה מאפשר בחירה של שברים מעוכלים כראוי religated באמצעות חרוזים מצופים streptavidin, מבדיל אותו GCC10. עדכון חשוב לפרוטוקול Hi-C יושם על ידי Rao et al.11, שביצעו את העיכול והחיבור מחדש בגרעינים שלמים (כלומר, באתרם) כדי להפחית תוצרי קשירת מזויפים. יתר על כן, החלפת עיכול HindIII בעיכול MboI (או DpnII) הפחיתה את גודל השבר והגדילה את פוטנציאל הרזולוציה של Hi-C. עלייה זו אפשרה זיהוי של מבנים בקנה מידה קטן יחסית ולוקליזציה גנומית מדויקת יותר של נקודות מגע, כגון לולאות DNA בין אלמנטים קטנים של ציס, למשל, לולאות בין אתרים הקשורים ל- CTCF שנוצרו על ידי שחול לולאה11,12. עם זאת, לפוטנציאל הזה יש מחיר. ראשית, עלייה של פי שניים ברזולוציה דורשת עלייה של פי ארבעה (22) בקריאות הרצף13. שנית, גודל השברים הקטנים מגדיל את האפשרות לטעות בניצול שגוי של שברים שכנים לא מעוכלים עבור שברים מעוכלים ורגישים14. כאמור, ב- Hi-C, שברים מעוכלים ומחוברים מחדש נבדלים משברים לא מעוכלים על ידי נוכחות ביוטין בצומת הקשירה. עם זאת, נדרשת הסרה נכונה של ביוטין מקצוות לא קשורים כדי להבטיח שרק צמתי קשירה יימשכו למטה14,15.
עם העלות הפוחתת של NGS, זה הופך להיות ריאלי לחקור קיפול כרומוזומים בפירוט רב יותר. כדי להקטין את גודל מקטעי הדנ"א, ובכך להגדיל את הרזולוציה, ניתן להתאים את פרוטוקול Hi-C לשימוש תכוף יותר באנזימי הגבלה16 או להשתמש בשילובים של אנזימי הגבלה17,18,19. לחלופין, ניתן לשרבט MNase 7,8 במיקרו-C ו-DNase ב-DNaseHi-C 20 כדי להשיג עיכול מיטבי.
הערכה שיטתית עדכנית של יסודות שיטות 3C הראתה כי הזיהוי של תכונות קיפול כרומוזומים בכל קנה מידה של אורך השתפר מאוד עם crosslinking רציף עם 1% FA ואחריו 3 mM DSG17. יתר על כן, Hi-C עם עיכול HindIII היה האפשרות הטובה ביותר לזיהוי תכונות קיפול בקנה מידה גדול, כגון תאים, וכי Micro-C היה מעולה בזיהוי תכונות קיפול בקנה מידה קטן כגון לולאות DNA. תוצאות אלה הובילו לפיתוח אסטרטגיה אחת ברזולוציה גבוהה "Hi-C 3.0", המשתמשת בשילוב של קרוסלינקרים של FA ו- DSG ולאחר מכן עיכול כפול עם DpnII ו- DdeI endonucleases21. Hi-C 3.0 מספק אסטרטגיה יעילה לשימוש כללי מכיוון שהוא מזהה במדויק תכונות קיפול בכל קני המידה באורך17. החלק הניסיוני של פרוטוקול Hi-C 3.0 מפורט כאן ותוצאות אופייניות שניתן לצפות לאחר ריצוף מוצגות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> איור 1: הליך Hi-C בשישה שלבים. התאים קבועים תחילה באמצעות FA ולאחר מכן DSG (1). לאחר מכן, ליזיס מקדים עיכול כפול עם DdeI ו- DpnII (2). ביוטין מתווסף על ידי מילוי תקרה וקצוות קהים פרוקסימליים נקשרים (3) לפני טיהור DNA (4). ביוטין מוסר מקצוות לא מחוברים לפני סוניקציה ובחירת גודל (5). לבסוף, משיכת ביוטין מאפשרת קשירת מתאם והגברה של הספרייה על ידי PCR (6). קיצורים: FA = פורמלדהיד; DSG = דיסוצ'ינימידיל גלוטראט; B = ביוטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) משמשת לזיהוי אינטראקציות כרומטין תלת-ממדיות. בדרך כלל, קישור צולב כימי עם פורמלדהיד (FA) משמש לתיקון אינטראקציות כרומטין. לאחר מכן, עיכול כרומטין עם אנזים הגבלה וחיבור מחדש של קצות השבר לאחר מכן ממיר קרבה תלת-ממדית (3D) לתוצרי קשירה ייחודיים. לבסוף, לאחר היפוך של קישורים צולבים, הסרת חלבונים ובידוד דנ"א, הדנ"א נגזל ומוכן לריצוף בתפוקה גבוהה. תדירות קשירת הקרבה של זוגות לוקוסים היא מדד לתדירות הקולוקליזציה שלהם במרחב תלת-ממדי באוכלוסיית התא.
ספריית Hi-C ברצף מספקת מידע כלל-גנומי על תדרי אינטראקציה בין כל זוגות הלוקים. הרזולוציה והדיוק של Hi-C מסתמכים על הצלבה יעילה השומרת על מגעי כרומטין ועל פיצול תכוף ואחיד של הכרומטין. מאמר זה מתאר פרוטוקול Hi-C משופר באתרו , Hi-C 3.0, המגביר את היעילות של crosslinking על ידי שילוב של שני crosslinkers (פורמלדהיד [FA] ו disuccinimidyl גלוטראט [DSG]), ולאחר מכן עיכול עדין יותר באמצעות שני אנזימי הגבלה (DpnII ו- DdeI). Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול יחיד לכימות מדויק של תכונות קיפול גנום בקני מידה קטנים יותר כגון לולאות ותחומים המשויכים טופולוגית (TADs), כמו גם תכונות בקנה מידה גדול יותר של גרעין כגון תאים.

הדמויות בכתב יד זה נוצרו מניסוי נפרד, משוכפל, של זה שפורסם בעבר על ידי Lafontaine et al.21. לאחר קבלת נתוני רצף בתפוקה גבוהה, קולקטיב הכרומטין הפתוח (Open2C: https://github.com/open2c) שימש לעיבוד נתוני Hi-C. צינור דומה ניתן למצוא בפורטל הנתונים של פרויקט נוקלאום 4D (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). בקצרה, מזקקת צינור Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) יושמה כדי (1) ליישר את הרצפים של מולקולות Hi-C לגנום הייחוס, (2) לנתח קבצי יישור .sam וליצור קבצים עם זוגות Hi-C, (3) לסנן כפילויות PCR, ו-(4) זוגות מצטברים למטריצות משולבות של אינטראקציות Hi-C. מטריצות בפורמט HDF5 אלה, הנקראות צידניות, ניתנות לצפייה (1) בשרת HiGlass (https://higlass.io/) ו-(2) לניתוח באמצעות קבוצה גדולה של כלים חישוביים בקוד פתוח הנמצאים באוסף "cooltools" המתוחזק על ידי קולקטיב הכרומטין הפתוח (https://github.com/open2c/cooltools) כדי לחלץ ולכמת תכונות קיפול כגון תאים, TADs ולולאות.
ניתן להעריך כמה מדדי איכות של ספריות Hi-C3.0 מיד לאחר מיפוי זוגות קריאה לגנום ייחוס, באמצעות כמה מדדים / אינדיקטורים פשוטים. ראשית, בדרך כלל ~50% מזוגות הקריאה המרוצפים ניתנים למיפוי ייחודי עבור תאים אנושיים. בשל האופי הפולימרי של הכרומוזומים, רוב הקריאות הממופות הללו (~60%-90%) מייצגות אינטראקציות בתוך כרומוזום (cis), כאשר תדרי האינטראקציה מתפוררים במהירות עם הגדלת המרחק הגנומי (דעיכה תלוית מרחק). ניתן לדמיין את הדעיכה התלויה במרחק בצורה הטובה ביותר ב"חלקת קנה מידה", המציגה את הסתברות המגע (לכל זרוע כרומוזום) כפונקציה של מרחק גנומי. מצאנו ששימוש בקישורים ואנזימים שונים יכול לשנות את הדעיכה התלויה במרחק במרחקים ארוכים וקצרים17. התוספת של קישור צולב DSG מגבירה את יכולת הגילוי של אינטראקציות במרחקים קצרים בשילוב עם אנזימים כגון Mnase ושילובים של DpnII-DdeI שמייצרים שברים קטנים יותר (איור 6A).
ניתן גם לצפות בדעיכה תלוית מרחק ישירות ממטריצות אינטראקציה דו-ממדיות: אינטראקציות נעשות נדירות יותר כאשר הן ממוקמות רחוק יותר מהאלכסון המרכזי (איור 6B). בנוסף, ניתן לזהות תכונות קיפול גנומיות, כגון תאים, TADs ולולאות ממטריצות Hi-C ומזימות קנה מידה כסטיות מהדעיכה הממוצעת התלויה במרחק הממוצע של הגנום הכללי. חשוב לציין שהצלבה עם DSG בנוסף ל-FA מפחיתה קשירה אקראית, שאינה מוגבלת בשל האופי הפולימרי של הכרומוזומים, ולכן סביר יותר שתתרחש בין כרומוזומים (בטרנס) (איור 6C). הפחתת קשירת אקראיות מובילה ליחסי אות לרעש מוגברים, במיוחד עבור אינטראקציות תוך-כרומוזומליות בין-כרומוזומליות וארוכות טווח מאוד (>10-50 מגה-בתים).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות של ספריות Hi-C ממופות ומסוננות. (A) עלילות קנה מידה עם הסתברות מגע ונגזרתה עבור אנזימים שונים, מסודרים לפי אורך השבר (למעלה) והצלבה עם FA או FA + DSG (למטה). עיכול עם MNAse (microC) או DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) מגדיל באופן משמעותי את המגעים לטווח קצר (למעלה) וכך גם הוספת DSG ל-FA (למטה). (B) עמודות מציגות מפות חום Hi-C של עיכול DpnII לאחר הצלבת FA בלבד ועיכול DpnII או DdeI לאחר קישור צולב של FA+DSG. חיצים לבנים מראים חוזק הולך וגובר של "נקודות" לאחר הצלבת DSG ועיכול DdeI, מה שמרמז על זיהוי טוב יותר של לולאות DNA. שורות מציגות חלקים שונים של כרומוזום 3 ברזולוציה הולכת וגדלה, תוך יישור עם לוח C: שורה עליונה: כרומוזום שלם 3 (0-198,295,559 Mb); שורה אמצעית: 186-196 מגהבייט; שורה תחתונה: 191.0-191.5 Mb. (C) גרפי כיסוי עבור האזורים המתוארים ב-A. חצים שחורים מציגים את הכיסוי הנמוך יותר (%cis reads) עבור קישור צולב של FA בלבד. קיצורים: FA = פורמלדהיד; DSG = דיסוצ'ינימידיל גלוטראט; chr = כרומוזום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
לא כל הקריאות הממופות שימושיות. מחוון איכות שני הוא מספר כפילויות PCR. קריאות כפולות מדויקות אינן סבירות מאוד להתרחש במקרה לאחר קשירה וסוניקציה. לפיכך, קריאות כאלה ככל הנראה נבעו מהגברת PCR וצריך לסנן אותן. כפילויות מתעוררות לעתים קרובות כאשר נדרשים מחזורי PCR רבים מדי כדי להגביר ספריות בעלות מורכבות נמוכה. באופן כללי, עבור Hi-C, רוב הספריות זקוקות רק ל-5-8 מחזורים של הגברה סופית של PCR, כפי שנקבע על-ידי טיטרציה PCR (ראה שלב 3.9; איור 4). עם זאת, ספריות עם מורכבות מספקת ניתן להשיג גם לאחר 14 מחזורים של הגברת PCR.
קטגוריה נוספת של קריאות כפולות, מה שמכונה כפילויות אופטיות, יכולה לנבוע מתהליך ההגברה בפלטפורמות ריצוף Illumina המשתמשות בתאי זרימה מעוצבים (כגון HiSeq4000). כפילויות אופטיות מתגלות כתוצאה מעומס יתר על תא הזרימה, מה שגורם לצבירים (גדולים) להיקרא שני צבירים נפרדים, או מקיבוץ מחדש מקומי של המולקולה הזוגית המקורית לאחר סיבוב ראשון של PCR. מכיוון ששני סוגי הכפילויות האופטיות הם מקומיים, ניתן לזהות אותם ולהבחין בינם לבין כפילויות PCR לפי מיקומם בתא הזרימה. בעוד שספריות עם כפילויות PCR של >15% יזדקקו לשחזור, ספריות עם כפילויות אופטיות יכולות להיטען מחדש לאחר אופטימיזציה של תהליך הטעינה.
טבלה משלימה S1: מאגרים ופתרונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

פרוטוקול זה מזהה במדויק תכונות קיפול כרומוזומים על פני סקאלות אורך מרובות עם אות רקע נמוך. לדוגמה, ניתן לנתח אינטראקציות משפרות מקדם בהקשר של תאי כרומוזומים. השימוש באנדונוקלזות הגבלה עוקף אופטימיזציה של רמת העיכול של חומר הקלט.אין צורך בבחירה על ידי בידוד ג'ל כדי ללכוד מוצרי קשירה. הבעיה הנפוצה ביותר היא אובדן תאים לאחר קיבוע DSG ולכידת מספיק דנ"א כדי לייצר ספריות באיכות גבוהה. כדי להתחיל, שאפו את המדיום עם פיפטה פסטר המוצמד למלכודת ואקום מצלחת 150 המילימטר המכילה 5 על 10 לתאים השישיים.לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS. כדי להצליב את התאים, לשפוך 23.125 מיליליטר של תמיסת 1% פורמלדהיד לתוך צלחת 15 ס"מ. דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מנדנדים בעדינות את הצלחת ביד כל שתי דקות.לאחר מכן, מוסיפים 1.25 מיליליטר של גליצין טוחן 2.5 ומערבבים בעדינות את הצלחת כדי להרוות את תגובת ההצלבה, לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. המשיכו את הדגירה על הקרח במשך 15 דקות כדי להפסיק את הקישור הצולב. מגרדים את התאים מהצלחת עם מגרד תאים או שוטר גומי ומעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עם פיפטה.צנטריפוגה המתלה ב 1, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להשליך את supernatant על ידי שאיפה. שטפו את הכדור פעם אחת עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח עם פוספט של דולבקו, או DPBS. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב לפני שתמשיך לקישור צולב DSG.להצלבה עם DSG, יש להשעות את התאים הכדוריים ב-9.9 מיליליטר של DPBS. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של 300-millimolar DSG. מערבבים את הצינור על ידי היפוך ומקשרים את התאים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות על סיבוב.לאחר קישור צולב, מוסיפים 1.925 מיליליטר של 2.5-טוחנות גליצין, הופכים לתערובת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב 2, 000 פעמים G במשך 15 דקות ולהשהות את הכדור במיליליטר אחד של 0.05% סרום בקר אלבומין DPBS לפני העברתו לצינור 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים ב 2, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.הקפיא את הכדור בחנקן נוזלי לפני שתמשיך ללכידת אישור הכרומוזום. יש להשעות את אליקוט התאים הצולבים במיליליטר אחד של חיץ ליזיס קר כקרח המכיל 10 מיקרוליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאז ולהעביר להומוגנייזר של Dounce למשך 15 דקות של דגירה על קרח. הזיזו באיטיות את הדברה A למעלה ולמטה 30 פעמים כדי ליצור הומוגניזציה של התאים ולדגור במשך דקה אחת כדי לאפשר לתאים להתקרר לפני 30 משיכות נוספות.לאחר השבץ האחרון, להעביר את ליזאט לצינור 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה המתלה lysed ב 2, 500 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נאטנט ותנופפו או מערבולת כדי להשהות את הכדור הרטוב.הסר כמה שיותר מהסופרנטנט כדי להשיג חומר דמוי יוגורט עם מינימום גושים. יש להשעות את הכדור ב-500 מיקרוליטרים של חיץ הגבלה קר כקרח לפני הצנטריפוגה. לאחר השטיפה השנייה, יש להשעות את הכדור ב-360 מיקרוליטרים של חיץ הגבלה על ידי פיפטינג לאחר הוספת כ-340 מיקרוליטר לנפח הנשיאה של הכדור, בהתאם לגודל התא.מניחים בצד 18 מיקרוליטרים של ליזאט לבדיקת שלמות הכרומטין, או CI.To את הליזאט הנותר, מוסיפים 38 מיקרוליטרים של 1% נתרן דודציל סולפט לצינור Hi-C כדי ליצור נפח כולל של 380 מיקרוליטר ומערבבים בזהירות על ידי פיפטינג מבלי להכניס בועות. דגירה של הדגימות ב-65 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 10 דקות כדי לפתוח את הכרומטין. לאחר מכן, מיד להניח את הצינור על קרח.לאחר הכנת תערובת העיכול עם Triton X-100, להוסיף 107 microliters של תערובת זו לצינור hi-C כדי ליצור נפח כולל של 487 microliters ולעכל את הכרומטין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב thermomixer עם רעידות מרווח. למחרת, העבירו את הדגימות ל-65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את פעילות האנדונוקלאז שנותרה. לאחר הנחת הדגימה על קרח, להפריש 10 microliters של בקרת העיכול, או DC, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס.הסר את העיבוי מהמכסה עם פיפטה או על ידי סיבוב. לאחר מכן, הוסיפו 58 מיקרוליטרים של תערובת מילוי ביוטין כדי ליצור נפח כולל של 535 מיקרוליטרים. פיפטה בעדינות מבלי ליצור בועות לפני הדגירה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בתרמומיקסר.לאחר הדגירה, להוסיף 665 microliters של תערובת קשירה, מה שהופך את נפח המדגם 1, 200 microliters. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג ודוגרים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות בתרמומיקסר. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פרוטאינאז-K בשני שברים לצינור הדגימה Hi-C ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עם רעידות מרווח.לטיהור DNA, להוסיף 100% אתנול קר כקרח צנטריפוגה את הצינורות ב 18, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להסיר את הסופרנאט לחלוטין מהצד שאינו כדורי ולייבש את הדגימה באוויר למשך 10 דקות או עד שהכדורים יבשים באופן נראה לעין. לאחר שהכדורים יבשים, יש לבודד אותם ב-450 מיקרוליטרים של Tris low-EDTA על ידי פיפטינג או מערבולת.העבר את המתלה המסולסל ליחידת מסנן צנטריפוגלית של 0.5 מילימטר, או CFU, עם ניתוק משקל מולקולרי של שלושה קילודלטון. צנטריפוגה של CFU במהירות מקסימלית למשך 10 דקות והשלכת הזרימה דרך. לאחר השטיפה השנייה, הוסיפו 80 מיקרוליטרים של Tris low-EDTA לעמודה.הפוך את העמוד לצינור איסוף חדש לשתי דקות של צנטריפוגה במהירות המרבית. לבסוף, טען את הדגימות על ג'ל אגרוז של 0.8%. ג'ל אגרוז עם תוצאות טיטרציה של PCR הראה שרוב הספריות דורשות חמישה עד שמונה מחזורים של הגברה סופית של PCR.עיכול התאים של ספריית ה- PCR המוגברת הסופית, כפי שנצפה על ידי שברים קטנים יותר על ג'ל אגרוז, מאשר את נוכחותם של צמתי קשירה מתאימים ומשמש כבדיקת איכות לפני הרצף. לאחר הרצף, הנתונים הממופים הראו כי השילוב של DpnII ו- DdeI מגדיל באופן משמעותי את המגעים לטווח קצר, כמו הוספת DSG לקישור הצולב הקונבנציונלי של פורמלדהיד. ניתן היה לצפות באות משופר גם במרחקים ארוכים וקצרים ישירות ממטריצות אינטראקציה דו-ממדיות.אותות התא הם קריספר במרחקים ארוכים ונקודות הנוצרות על ידי לולאות כרומטין בולטות יותר במרחקים קצרים. בנוסף לפורמלדהיד, קישור צולב עם DSG מקטין קשירת אקראיות, ומשפר את הכיסוי היחסי בציס. חשוב לא לאבד תאים במהלך ואחרי crosslinking.כדורי התא יכולים להיות רופפים או בלתי נראים, ותאים יכולים להידבק לקצות פיפטה בחלק מהמאגרים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

קרינה מזורז Biodosimetry אוטומטית על ידי כרומוזום Dicentric זיהוי (ADCI) והשערוך מינון

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...