Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
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हम प्रोटोकॉल विकास के लिए डेनिस लाफोंटेन और जैव सूचना विज्ञान सहायता के लिए सर्गेई वेनेव को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ कॉमन फंड 4 डी न्यूक्लियोम प्रोग्राम से जेडी (यू 54-डीके 107980, यूएम 1-एचजी 011536) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। जेडी हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के एक अन्वेषक हैं।
यह लेख HHMI की प्रकाशनों के लिए खुली पहुँच नीति के अधीन है। एचएचएमआई प्रयोगशाला प्रमुखों ने पहले अपने शोध लेखों में जनता को एक गैर-विशिष्ट सीसी बीवाई 4.0 लाइसेंस और एचएचएमआई को एक उप-लाइसेंस योग्य लाइसेंस दिया है। उन लाइसेंसों के अनुसार, इस लेख की लेखक-स्वीकृत पांडुलिपि को प्रकाशन के तुरंत बाद सीसी बीवाई 4.0 लाइसेंस के तहत स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराया जा सकता है।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

सेल हैंडलिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम यद्यपि इनपुट कोशिकाओं की कम संख्या का उपयोग करना संभव है, इस प्रोटोकॉल को गहन अनुक्रमण के बाद उचित जटिलता सुनिश्चित करने के लिए ~ 5 × 106 कोशिकाओं प्रति अनुक्रमण लेन (~ 400 एम रीड) के लिए अनुकूलित किया गया है। निर्धारण से पहले कोशिकाओं को सबसे अच्छी तरह से गिना जाता है। अल्ट्राडीप पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए, हम आम तौर पर लेन (और कोशिकाओं) की संख्या को गुणा करते हैं जब तक कि वांछित पठन-गहराई तक नहीं पहुंच जाता है। इष्टतम निर्धारण के लिए, सीरम युक्त माध्यम को एफए निर्धारण से पहले पीबीएस के साथ बदल दिया जाना चाहिए, और फिक्सेटिव समाधानों को तुरंत और एकाग्रता ग्रेडिएंट15,22 के बिना जोड़ा जाना चाहिए। सेल कटाई के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन पर स्क्रैपिंग को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद चापलूसी से गोलाकार आकार में संक्रमण परमाणु रचना को प्रभावित कर सकता है। डीएसजी को जोड़ने के बाद, ढीले और झुरमुट सेल छर्रों को आसानी से खो दिया जाता है। इस स्तर पर कोशिकाओं को संभालते समय सावधान रहें और झुरमुट को कम करने के लिए 0.05% बीएसए जोड़ें।
विधि में संशोधन यह प्रोटोकॉल मानव कोशिकाओं17 का उपयोग करके विकसित किया गया था। फिर भी, क्रोमोसोम रचना कैप्चर के साथ अनुभव के आधार पर, यह प्रोटोकॉल अधिकांश यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए काम करना चाहिए। काफी कम इनपुट (~ 1 × 106 कोशिकाओं) के लिए, हम लाइसिस और अनुरूपता कैप्चर प्रक्रियाओं [चरण 2.1-2.4] के लिए आधे वॉल्यूम का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह डीएनए अलगाव [चरण 2.5] को 1.7 एमएल ट्यूबों के साथ टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में करने की अनुमति देगा, जो कम डीएनए सांद्रता के लिए पेलेटिंग में सुधार कर सकता है। डीएनए की मात्रा (चरण 2.6.6) इंगित करेगी कि कैसे आगे बढ़ना है। पृथक डीएनए (1-5 μg) की कम मात्रा के लिए, हम आकार चयन (चरण 3.3) को छोड़ने का सुझाव देते हैं और सीएफयू के साथ मात्रा को 130 μL से ~ 45 μL तक कम करने के बाद बायोटिन हटाने के साथ आगे बढ़ते हैं।
इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से एफए और डीएसजी के साथ क्रॉसलिंकिंग और डीपीएनआई और डीडीईआई के साथ पाचन के बाद उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, वैकल्पिक क्रॉसलिंकिंग रणनीतियाँ जैसे कि एफए के बाद ईजीएस (एथिलीन ग्लाइकोल बिस (सक्सिनिमिडिल सक्सिनेट)), जिसका उपयोग CHIP-seq23 और CHIA-PET24 में भी किया जाता है, समान रूपसे अच्छी तरह से काम कर सकता है। इसी तरह, विभिन्न एंजाइम संयोजन, जैसे कि DpnII और HinfI18 या MBOI , MSEI, और NLAIII19 का उपयोग पाचन के लिए किया जा सकता है। एंजाइम संयोजनों को अपनाते समय, बायोटिनिलेटेड न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करना सुनिश्चित करें जो विशिष्ट 5 'ओवरहैंग्स को भर सकते हैं और प्रत्येक कॉकटेल के लिए सबसे इष्टतम बफर का उपयोग कर सकते हैं। DpnII अपने स्वयं के बफर के साथ आता है और एंजाइम निर्माता डीडीईआई पाचन के लिए एक विशिष्ट बफर की सिफारिश करता है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में DpnII और DDEI के साथ डबल-पाचन के लिए, प्रतिबंध बफर की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह दोनों एंजाइमों के लिए 100% गतिविधि पर रेट किया गया है।
समस्या निवारण रचना कैप्चर क्रोमोसोम रचना कैप्चर में तीन प्रमुख चरण: जेल पर परिणामों की कल्पना करने से पहले क्रॉसलिंकिंग, पाचन और रिलिगेशन सभी किए गए हैं। इन तीन चरणों में से प्रत्येक की गुणवत्ता निर्धारित करने और यह समझने के लिए कि समस्याएं कहां उत्पन्न हो सकती हैं, पाचन से पहले (सीआई) और बाद में (डीसी) एलिकोट लिए जाते हैं और लिगेटेड हाई-सी नमूने (चित्रा 2) के साथ जेल पर लोड किए जाते हैं। इस जेल का उपयोग हाई-सी नमूने की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए किया जाता है और क्या यह प्रोटोकॉल जारी रखने के लायक होगा। सीआई और डीसी के बिना, संभावित उप-मानक चरण (ओं) को इंगित करना मुश्किल है। यह ध्यान देने योग्य है कि उप-बंधाव लिगेशन में समस्या, फिल-इन, या क्रॉसलिंकिंग के साथ समस्या के कारण हो सकता है। क्रॉसलिंकिंग की समस्या का निवारण करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रति पुस्तकालय 107 कोशिकाओं × 1 से अधिक का उपयोग न करें और ताजा क्रॉसलिंकिंग अभिकर्मकों और स्वच्छ कोशिकाओं (यानी, पीबीएस से धोया गया) के साथ शुरू करें। बंधाव के लिए, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं और बंधाव मिश्रण को बर्फ पर रखा गया है। 4 घंटे से ठीक पहले टी 4 डीएनए लिगेज जोड़ें इनक्यूबेशन 16 डिग्री सेल्सियस पर और अच्छी तरह मिलाएं।
लायब्रेरी तैयारी में समस्या का निवारण यदि पीसीआर अनुमापन (चित्रा 4) के बाद जेल पर 10 से अधिक पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है या कोई पीसीआर उत्पाद नहीं देखा जा सकता है, तो हाई-सी नमूने को बचाने के लिए कुछ विकल्प हैं। पीसीआर अनुमापन से वापस काम करते हुए, पहला विकल्प पीसीआर को फिर से आज़माना है। यदि अभी भी पर्याप्त उत्पाद नहीं है, तो 1x TLE बफर के साथ दो बार मोतियों को धोने के बाद ए-टेलिंग और एडाप्टर लिगेशन (चरण 3.6) के एक और दौर का प्रयास करना संभव है। इस अतिरिक्त ए-टेलिंग और एडाप्टर लिगेशन के बाद, कोई भी पहले की तरह पीसीआर अनुमापन के लिए आगे बढ़ सकता है। यदि अभी भी कोई उत्पाद नहीं है, तो अंतिम विकल्प चरण 3.3 से 0.8x अंश को पुन: व्यवस्थित करना और वहां से आगे बढ़ना है।
हाई-C3.0 की सीमाएं और फायदे यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि हाई-सी एक जनसंख्या-आधारित विधि है जो सेल आबादी में लोकी के जोड़े के बीच बातचीत की औसत आवृत्ति को पकड़ती है। कुछ कम्प्यूटेशनल विश्लेषण25 की आबादी से अनुरूपता के संयोजन को अलग करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, लेकिन सिद्धांत रूप में, हाई-सी कोशिकाओं के बीच अंतर के लिए अंधा है। यद्यपि एकल-सेल हाई-सी26,27 करना संभव है और कम्प्यूटेशनल निष्कर्ष28 बनाए जा सकते हैं, एकल-सेल हाई-सी अल्ट्राहाई-रिज़ॉल्यूशन 3 सी जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। हाई-सी की एक अतिरिक्त सीमा यह है कि यह केवल जोड़ीवार इंटरैक्शन का पता लगाता है। मल्टीकॉन्टैक्ट इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए, कोई या तो शॉर्ट-रीड सीक्वेंसिंग (इलुमिना) 16 के साथ संयुक्त लगातार कटर का उपयोग कर सकता है या पैकबायो या ऑक्सफोर्ड नैनोपोर प्लेटफार्मों से लंबे समय तक पढ़े जाने वाले अनुक्रमण का उपयोग करके मल्टीकॉन्टैक्ट 3 सी29 या 4 सी30 कर सकता है। विशेष रूप से बहन क्रोमैटिड के बीच और उसके साथ संपर्कों का पता लगाने के लिए हाई-सी डेरिवेटिव भी31,32 विकसित किए गए हैं।
यद्यपि हाई-सी19 और माइक्रो-सी33 का उपयोग सबकिलोबेस रिज़ॉल्यूशन पर संपर्क मानचित्र उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, दोनों को बड़ी मात्रा में अनुक्रमण पढ़ने की आवश्यकता होती है और यह एक महंगा उपक्रम बन सकता है। लागत के बिना समान या उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों (कैप्चर-सी34) या विशिष्ट प्रोटीन इंटरैक्शन (चिया-पीईटी35, पीएलएसी-सेक36, हाई-सीएचआईपी37) के लिए संवर्धन लागू किया जा सकता है। इन संवर्धन अनुप्रयोगों की ताकत और नकारात्मक पक्ष यह है कि केवल सीमित संख्या में इंटरैक्शन का नमूना लिया जाता है। इस तरह के संवर्धन के साथ, हाई-सी का वैश्विक पहलू (और वैश्विक सामान्यीकरण का विकल्प) खो जाता है।
हाय-C3.0 का महत्व और संभावित अनुप्रयोग इस प्रोटोकॉल को उच्च-रिज़ॉल्यूशन, अल्ट्राडीप 3 सी को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि साथ ही टीएडी और डिब्बों17 (चित्रा 6) जैसे बड़े पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाया गया था। यह प्रोटोकॉल प्रत्येक हाई-सी लाइब्रेरी के लिए प्रति ट्यूब 5 × 106 कोशिकाओं के साथ शुरू होता है, जो 1 बिलियन युग्मित-अंत पठन प्राप्त करने के लिए प्रवाह सेल पर एक या दो लेन अनुक्रमित करने के लिए पर्याप्त सामग्री से अधिक होना चाहिए। अल्ट्राडीप अनुक्रमण के लिए, मैप किए गए रीड और पीसीआर डुप्लिकेट की संख्या के आधार पर 5 × 106 कोशिकाओं के कई ट्यूब तैयार किए जाने चाहिए। उच्चतम रिज़ॉल्यूशन (<1 केबी) पर, लूपिंग इंटरैक्शन ज्यादातर सीटीसीएफ साइटों के बीच पाए जाते हैं, लेकिन प्रमोटर-एन्हांसर इंटरैक्शन का भी पता लगाया जा सकता है। पाठक डेटा विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए एकगोल ओकसुज़ एट अल .17 का उल्लेख कर सकते हैं।

क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर का उपयोग 2002 1 से किया गयाहै। मौलिक रूप से, प्रत्येक रचना कैप्चर संस्करण 3 डी क्रोमैटिन संगठन को संरक्षित करने के लिए डीएनए-प्रोटीन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के निर्धारण पर निर्भर करता है। इसके बाद डीएनए विखंडन होता है, आमतौर पर प्रतिबंध पाचन द्वारा, और अंत में, पास के डीएनए का पुनर्ग्रहण स्थानिक रूप से समीपस्थ लोकी को अद्वितीय सहसंयोजक डीएनए अनुक्रमों में परिवर्तित करने के लिए समाप्त होता है। प्रारंभिक 3 सी प्रोटोकॉल ने विशिष्ट, "वन-टू-वन" इंटरैक्शन का नमूना लेने के लिए पीसीआर का उपयोग किया। बाद के 4 सी परीक्षणों ने "वन-टू-ऑल" इंटरैक्शन2 का पता लगाने की अनुमति दी, जबकि 5 सी ने "कई-से-कई" इंटरैक्शन3 का पता लगाया। अगली पीढ़ी, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एनजीएस) को लागू करने के बाद क्रोमोसोम रचना कैप्चर पूर्ण रूप से फलीभूत हुआ, जिसने जीनोम-वाइड हाई-सी4 और तुलनीय तकनीकों जैसे 3 सी-सेक5, टीसीसी6 और माइक्रो-सी 7,8 का उपयोग करके "ऑल-टू-ऑल" जीनोमिक इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति दी (डेंकर और डी लाट9 द्वारा समीक्षा भी देखें)।
हाई-सी में, बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड का उपयोग पाचन के बाद और बंधाव से पहले 5 ' ओवरहैंग को चिह्नित करने के लिए किया जाता है (चित्रा 1)। यह स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों का उपयोग करके ठीक से पचने वाले और पुनर्निर्मित टुकड़ों के चयन की अनुमति देता है, इसे जीसीसी10 से अलग करता है। हाई-सी प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण अद्यतन राव एट अल .11 द्वारा लागू किया गया था, जिन्होंने नकली बंधाव उत्पादों को कम करने के लिए बरकरार नाभिक (यानी, सीटू में) में पाचन और पुनरावृत्ति का प्रदर्शन किया था। इसके अलावा, एमबीओआई (या डीपीएनआई) पाचन के साथ हिंद III पाचन को प्रतिस्थापित करने से टुकड़े का आकार कम हो गया और हाई-सी की संकल्प क्षमता में वृद्धि हुई। इस वृद्धि ने अपेक्षाकृत छोटे पैमाने पर संरचनाओं का पता लगाने और संपर्क के बिंदुओं के अधिक सटीक जीनोमिक स्थानीयकरण की अनुमति दी, जैसे कि छोटे सीआईएस-तत्वों के बीच डीएनए लूप, उदाहरण के लिए, लूप एक्सट्रूज़न11,12 द्वारा उत्पन्न सीटीसीएफ-बाध्य साइटों के बीच लूप। हालांकि, यह क्षमता एक कीमत पर आती है। सबसे पहले, रिज़ॉल्यूशन में दो गुना वृद्धि के लिए अनुक्रमण में चार गुना (22) वृद्धिकी आवश्यकता होती है। दूसरा, छोटे टुकड़े के आकार से पचे हुए और पुनर्निर्मित टुकड़ों के लिए बिना पचे हुए पड़ोसी टुकड़ों को गलत समझने की संभावना बढ़जाती है। जैसा कि उल्लेख किया गया है, हाई-सी में, पचा हुआ और पुनर्निर्मित टुकड़े बंधाव जंक्शन पर बायोटिन की उपस्थिति से बिना पचे हुए टुकड़ों से भिन्न होते हैं। हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल बंधाव जंक्शनों को14,15 से नीचे खींचा जाता है, अनलिगेटेड सिरों से उचित बायोटिन हटाने की आवश्यकता होती है।
एनजीएस की घटती लागत के साथ, क्रोमोसोम फोल्डिंग का अधिक विस्तार से अध्ययन करना संभव हो जाता है। डीएनए टुकड़ों के आकार को कम करने के लिए, और इस प्रकार रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए, हाई-सी प्रोटोकॉल को प्रतिबंध एंजाइमों 16 को अधिक बार काटने या प्रतिबंध एंजाइम17,18,19 के संयोजन का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, माइक्रो-सी में एमनेस 7,8 और डीनेस हाई-सी20 में डीनेस को इष्टतम पाचन प्राप्त करने के लिए टाइटरेट किया जा सकता है।
3 सी विधियों के मूल सिद्धांतों के हालिया व्यवस्थित मूल्यांकन से पता चला है कि हर लंबाई के पैमाने पर क्रोमोसोम फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने में 1% एफए के साथ अनुक्रमिक क्रॉसलिंकिंग के साथ बहुत सुधार हुआ, जिसके बाद 3 एमएम डीएसजी17 था। इसके अलावा, हिंद III पाचन के साथ हाई-सी बड़े पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा विकल्प था, जैसे कि डिब्बे, और माइक्रो-सी डीएनए लूप जैसे छोटे पैमाने पर फोल्डिंग सुविधाओं का पता लगाने में बेहतर था। इन परिणामों ने एक एकल, उच्च-रिज़ॉल्यूशन "हाई-सी 3.0" रणनीति के विकास को जन्म दिया, जो एफए और डीएसजी क्रॉसलिंकर के संयोजन का उपयोग करता है, जिसके बाद डीपीएनआई और डीडीईआई एंडोन्यूक्लिज़21 के साथ डबल पाचन होता है। हाई-सी 3.0 सामान्य उपयोग के लिए एक प्रभावी रणनीति प्रदान करता है क्योंकि यह सभी लंबाई तराजू17 में फोल्डिंग सुविधाओं का सटीक रूप से पता लगाता है। हाई-सी 3.0 प्रोटोकॉल का प्रयोगात्मक भाग यहां विस्तृत है और अनुक्रमण के बाद अपेक्षित विशिष्ट परिणाम दिखाए जा सकते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> चित्रा 1: छह चरणों में हाई-सी प्रक्रिया। कोशिकाओं को पहले एफए के साथ तय किया जाता है, और फिर डीएसजी (1)। फिर, लाइसिस डीडीईआई और डीपीएनआई (2) के साथ दोहरे पाचन से पहले होता है। बायोटिन को ओवरहैंग फिल-इन द्वारा जोड़ा जाता है और समीपस्थ कुंद सिरों को डीएनए शुद्धिकरण (4) से पहले (3) किया जाता है। बायोटिन को सोनिकेशन और आकार चयन से पहले अनलिगेटेड सिरों से हटा दिया जाता है (5). अंत में, बायोटिन का पुल-डाउन पीसीआर द्वारा एडाप्टर लिगेशन और लाइब्रेरी प्रवर्धन की अनुमति देता है (6). संक्षेप: एफए = फॉर्मलाडेहाइड; डीएसजी = डिसुकिनिमिडिल ग्लूटारेट; बी = बायोटिन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) का उपयोग त्रि-आयामी क्रोमैटिन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए किया जाता है। आमतौर पर, फॉर्मलाडेहाइड (एफए) के साथ रासायनिक क्रॉसलिंकिंग का उपयोग क्रोमैटिन इंटरैक्शन को ठीक करने के लिए किया जाता है। फिर, एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ क्रोमैटिन पाचन और बाद में टुकड़े के सिरों का पुन: बंधाव तीन आयामी (3 डी) निकटता को अद्वितीय बंधाव उत्पादों में परिवर्तित करता है। अंत में, क्रॉसलिंक, प्रोटीन हटाने और डीएनए अलगाव के उलट के बाद, डीएनए को कतरनी किया जाता है और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए तैयार किया जाता है। लोकी के जोड़े की निकटता बंधाव की आवृत्ति एक सेल आबादी में त्रि-आयामी अंतरिक्ष में उनके सह-स्थानीयकरण की आवृत्ति का एक उपाय है।
एक अनुक्रमित हाई-सी लाइब्रेरी लोकी के सभी जोड़े के बीच बातचीत आवृत्तियों पर जीनोम-व्यापक जानकारी प्रदान करती है। हाई-सी का संकल्प और परिशुद्धता कुशल क्रॉसलिंकिंग पर निर्भर करती है जो क्रोमैटिन संपर्कों और क्रोमैटिन के लगातार और समान विखंडन को बनाए रखती है। यह पेपर एक बेहतर सीटू हाई-सी प्रोटोकॉल, हाई-सी 3.0 का वर्णन करता है, जो दो क्रॉसलिंकर (फॉर्मलाडेहाइड [एफए] और डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट [डीएसजी]) के संयोजन से क्रॉसलिंकिंग की दक्षता को बढ़ाता है, इसके बाद दो प्रतिबंध एंजाइमों (डीपीएनआई और डीडीईआई) का उपयोग करके बेहतर पाचन होता है। हाई-सी 3.0 छोटे पैमानों जैसे लूप और टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) पर जीनोम फोल्डिंग सुविधाओं की सटीक मात्रा का ठहराव करने के लिए एक एकल प्रोटोकॉल है, साथ ही साथ डिब्बों जैसे बड़े नाभिक-व्यापक पैमाने पर विशेषताएं भी हैं।

इस पांडुलिपि में आंकड़े लाफोंटेन एट अल.21 द्वारा पहले प्रकाशित एक के एक अलग, प्रतिकृति प्रयोग से उत्पन्न हुए थे। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के बाद, हाई-सी डेटा को संसाधित करने के लिए ओपन क्रोमैटिन कलेक्टिव (ओपन 2 सी: https://github.com/open2c) का उपयोग किया गया था। 4 डी न्यूक्लियोम प्रोजेक्ट (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline) के डेटा पोर्टल पर एक समान पाइपलाइन पाई जा सकती है। संक्षेप में, नेक्स्टफ्लो पाइपलाइन डिस्टिलर (https://github.com/open2c/distiller-nf) को (1) हाई-सी अणुओं के अनुक्रमों को संदर्भ जीनोम में संरेखित करने के लिए लागू किया गया था, (2) .sam संरेखण को पार्स करें और हाई-सी जोड़े के साथ फ़ाइलों का निर्माण करें, (3) पीसीआर डुप्लिकेट फ़िल्टर करें, और (4) कुल जोड़े को हाई-सी इंटरैक्शन के बिन्ड मैट्रिसेस में। इन एचडीएफ 5 स्वरूपित मैट्रिक्स, जिन्हें कूलर कहा जाता है, को तब (1) हाइग्लास सर्वर (https://higlass.io/) पर देखा जा सकता है और (2) ओपन क्रोमैटिन कलेक्टिव (https://github.com/open2c/cooltools) द्वारा बनाए गए "कूलटूल्स" संग्रह में मौजूद ओपन सोर्स कम्प्यूटेशनल टूल के एक बड़े सेट का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है ताकि डिब्बों, टीएडी और लूप जैसी फोल्डिंग विशेषताओं को निकाला और मात्रा निर्धारित की जा सके।
हाई-सी 3.0 पुस्तकालयों के कुछ गुणवत्ता संकेतकों का मूल्यांकन कुछ सरल मैट्रिक्स / संकेतकों का उपयोग करके, संदर्भ जीनोम में पढ़ने वाले जोड़े को मैप करने के तुरंत बाद किया जा सकता है। सबसे पहले, आमतौर पर ~ 50% अनुक्रमित पठन जोड़े मानव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट रूप से मैप किए जा सकते हैं। क्रोमोसोम की बहुलक प्रकृति के कारण, इनमें से अधिकांश मैप किए गए रीड (~ 60% -90%) एक क्रोमोसोम (सीआईएस) के भीतर इंटरैक्शन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें इंटरैक्शन आवृत्तियों तेजी से बढ़ती जीनोमिक दूरी (दूरी-निर्भर क्षय) के साथ क्षय होती हैं। दूरी-निर्भर क्षय को "स्केलिंग प्लॉट" में सबसे अच्छी तरह से देखा जा सकता है, जो जीनोमिक दूरी के कार्य के रूप में संपर्क संभावना (प्रति गुणसूत्र हाथ) को दर्शाता है। हमने पाया कि विभिन्न क्रॉसलिंकर और एंजाइमों का उपयोग लंबी और छोटी दूरी की दूरी पर दूरी-निर्भर क्षय को बदल सकताहै। डीएसजी क्रॉसलिंकिंग के अलावा कम दूरी पर इंटरैक्शन की पहचान क्षमता बढ़ जाती है जब एमएनसे जैसे एंजाइमों और डीपीएनआई-डीडीईआई के संयोजन के साथ जोड़ा जाता है जो छोटे टुकड़े पैदा करते हैं (चित्रा 6 ए)।
दूरी-निर्भर क्षय को सीधे 2 डी इंटरैक्शन मैट्रिसेस से भी देखा जा सकता है: केंद्रीय विकर्ण से दूर स्थित होने पर इंटरैक्शन अधिक असंगत हो जाते हैं (चित्रा 6 बी)। इसके अतिरिक्त, जीनोमिक फोल्डिंग विशेषताओं, जैसे कि डिब्बों, टीएडी और लूप को हाई-सी मैट्रिसेस और स्केलिंग प्लॉट से सामान्य जीनोम-वाइड औसत दूरी-निर्भर क्षय से विचलन के रूप में पहचाना जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, एफए के अलावा डीएसजी के साथ क्रॉसलिंकिंग यादृच्छिक बंधाव को कम करती है, जो गुणसूत्रों की बहुलक प्रकृति के कारण अप्रतिबंधित हैं और इसलिए, गुणसूत्रों (ट्रांस में) के बीच होने की अधिक संभावना है (चित्रा 6 सी)। यादृच्छिक बंधाव को कम करने से सिग्नल-टू शोर अनुपात में वृद्धि होती है, विशेष रूप से अंतर-क्रोमोसोमल और बहुत लंबी दूरी (>10-50 एमबी) इंट्राक्रोमोसोमल इंटरैक्शन के लिए।
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> चित्र 6: मैप किए गए और फ़िल्टर किए गए हाई-सी पुस्तकालयों के प्रतिनिधि परिणाम। (A) विभिन्न एंजाइमों के लिए संपर्क संभाव्यता और इसके व्युत्पन्न के साथ स्केलिंग प्लॉट, टुकड़े की लंबाई (ऊपर) और एफए या एफए + डीएसजी (नीचे) के साथ क्रॉसलिंकिंग द्वारा आदेशित। एमएनई (माइक्रोसी) या डीपीएनआई-डीडीईआई (हाई-सी 3.0) के साथ पाचन छोटी दूरी के संपर्कों (ऊपर) को काफी बढ़ाता है जैसा कि डीएसजी को एफए (नीचे) में जोड़ता है। (बी) कॉलम एफए क्रॉसलिंकिंग के बाद डीपीएनआई पाचन के हाई-सी हीटमैप दिखाते हैं और एफए + डीएसजी क्रॉसलिंकिंग के बाद डीपीएनआई या डीडीईआई पाचन दिखाते हैं। सफेद तीर डीएसजी क्रॉसलिंकिंग और डीडीईआई पाचन के बाद "डॉट्स" की बढ़ती ताकत दिखाते हैं, जिसका अर्थ है डीएनए लूप का बेहतर पता लगाना। पंक्तियाँ बढ़ते रिज़ॉल्यूशन पर क्रोमोसोम 3 के विभिन्न हिस्सों को दिखाती हैं, पैनल सी के साथ संरेखित: शीर्ष पंक्ति: संपूर्ण गुणसूत्र 3 (0-198,295,559 एमबी); मध्य पंक्ति: 186-196 एमबी; नीचे पंक्ति: 191.0-191.5 एमबी (सी) ए में दर्शाए गए क्षेत्रों के लिए कवरेज ग्राफ। काले तीर एफए-ओनली क्रॉसलिंकिंग के लिए कम कवरेज (%सीआईएस पढ़ता है) दिखाते हैं। संक्षेप: एफए = फॉर्मलाडेहाइड; डीएसजी = डिसुकिनिमिडिल ग्लूटारेट; chr = क्रोमोसोम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
सभी मैप किए गए पाठ उपयोगी नहीं हैं। एक दूसरा गुणवत्ता संकेतक पीसीआर डुप्लिकेट की संख्या है। सटीक डुप्लिकेट रीड बंधाव और सोनिकेशन के बाद संयोग से होने की संभावना नहीं है। इस प्रकार, इस तरह के पठन संभवतः पीसीआर प्रवर्धन के परिणामस्वरूप होते हैं और उन्हें फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है। डुप्लिकेट अक्सर तब उत्पन्न होते हैं जब कम जटिलता पुस्तकालयों को बढ़ाने के लिए बहुत सारे पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, हाई-सी के लिए, अधिकांश पुस्तकालयों को केवल अंतिम पीसीआर प्रवर्धन के 5-8 चक्रों की आवश्यकता होती है, जैसा कि अनुमापन पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है (चरण 3.9 देखें; चित्र 4)। हालांकि, पीसीआर प्रवर्धन के 14 चक्रों के बाद भी पर्याप्त जटिलता वाले पुस्तकालय प्राप्त किए जा सकते हैं।
डुप्लिकेट रीडिंग की एक और श्रेणी, तथाकथित ऑप्टिकल डुप्लिकेट, इलुमिना अनुक्रमण प्लेटफार्मों पर प्रवर्धन प्रक्रिया से उत्पन्न हो सकती है जो पैटर्न प्रवाह कोशिकाओं (जैसे HiSeq4000) का उपयोग करते हैं। ऑप्टिकल डुप्लिकेट या तो प्रवाह सेल को ओवरलोड करने से पाए जाते हैं, जिससे (बड़े) समूहों को दो अलग-अलग क्लस्टर कहा जाता है, या पीसीआर के पहले दौर के बाद मूल युग्मित-अंत अणु के स्थानीय पुनरावृत्ति से। क्योंकि दोनों प्रकार के ऑप्टिकल डुप्लिकेट स्थानीय हैं, उन्हें प्रवाह सेल पर उनके स्थान से पीसीआर डुप्लिकेट से पहचाना और अलग किया जा सकता है। जबकि >15% पीसीआर डुप्लिकेट वाले पुस्तकालयों को पुनर्जनन की आवश्यकता होगी, ऑप्टिकल डुप्लिकेट वाले पुस्तकालयों को लोडिंग प्रक्रिया को अनुकूलित करने के बाद फिर से लोड किया जा सकता है।
पूरक तालिका एस 1: बफर और समाधान। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

हाई-सी 3.0 एक बेहतर हाई-सी प्रोटोकॉल है जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात और क्रोमैटिन इंटरैक्शन डिटेक्शन के रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए डीपीएनआई और डीडीईआई प्रतिबंध एंजाइमों के कॉकटेल के साथ फॉर्मलाडेहाइड और डिसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट क्रॉसलिंकर को जोड़ता है।

लंबाई के पैमाने पर क्रोमोसोम रचना कैप्चर करना

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

यह प्रोटोकॉल कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ कई लंबाई के तराजू में क्रोमोसोम फोल्डिंग सुविधाओं का सटीक रूप से पता लगाता है। उदाहरण के लिए, प्रमोटर एन्हांसर इंटरैक्शन का विश्लेषण क्रोमोसोम डिब्बों के संदर्भ में किया जा सकता है। प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिज़ का उपयोग इनपुट सामग्री के पाचन स्तर को अनुकूलित करता है।लिगेशन उत्पादों को पकड़ने के लिए जेल अलगाव द्वारा कोई चयन आवश्यक नहीं है। सबसे आम समस्या डीएसजी निर्धारण के बाद कोशिकाओं का नुकसान और उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त डीएनए कैप्चर करना है। शुरू करने के लिए, 150 मिलीमीटर प्लेट से वैक्यूम ट्रैप के साथ मिलकर पाश्चर पिपेट के साथ माध्यम को एस्पिरेट करें जिसमें 5 बाय 10 से छठी कोशिकाएं होती हैं।कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर एचबीएसएस के साथ दो बार धोएं। कोशिकाओं को क्रॉस-लिंक करने के लिए, 1% फॉर्मलाडेहाइड समाधान के 23.125 मिलीलीटर को 15-सेंटीमीटर प्लेट में डालें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, धीरे से हर दो मिनट में हाथ से प्लेट को हिलाएं।इसके बाद, 2.5-मोलर ग्लाइसिन के 1.25 मिलीलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने से पहले क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं। क्रॉस-लिंकिंग को रोकने के लिए 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन जारी रखें। सेल स्क्रैपर या रबर पुलिसकर्मी के साथ प्लेट से कोशिकाओं को स्क्रैप करें और सेल निलंबन को पिपेट के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1,000 गुना जी पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और आकांक्षा से सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन, या डीपीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ गोली को एक बार धो लें। फिर, डीएसजी क्रॉस-लिंकिंग पर जाने से पहले फिर से सेंट्रीफ्यूज।डीएसजी के साथ क्रॉस-लिंकिंग के लिए, डीपीबीएस के 9.9 मिलीलीटर में पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर, 300-मिलीमोलर डीएसजी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूब को व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं और घूर्णन पर 40 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को क्रॉस-लिंक करें।क्रॉस-लिंकिंग के बाद, 2.5-मोलर ग्लाइसिन के 1.925 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण के लिए इनवर्ट करें, और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 2,000 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और 1.7-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले 0.05% गोजातीय सीरम एल्बुमिन डीपीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 2,000 गुना जी पर 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।क्रोमोसोम पुष्टिकरण कैप्चर के लिए आगे बढ़ने से पहले तरल नाइट्रोजन में गोली को स्नैप-फ्रीज करें। क्रॉस-लिंक्ड सेल एलिकोट को एक मिलीलीटर आइस-कोल्ड लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें जिसमें प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 10 माइक्रोलीटर होते हैं और बर्फ पर 15 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए डौंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित होते हैं। कोशिकाओं को समरूप बनाने के लिए धीरे-धीरे मूसल ए को 30 बार ऊपर और नीचे ले जाएं और कोशिकाओं को एक मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को अन्य 30 स्ट्रोक से पहले ठंडा किया जा सके।अंतिम स्ट्रोक के बाद, लाइसेट को 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 2,500 गुना जी पर लाइस्ड सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें। गीली गोली को फिर से निलंबित करने के लिए सतह पर तैरने वाले और फ्लिक या भंवर को छोड़ दें।न्यूनतम झुरमुट के साथ दही जैसा पदार्थ प्राप्त करने के लिए जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट निकालें। सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले 500 माइक्रोलीटर बर्फ-ठंडा प्रतिबंध बफर में गोली को फिर से निलंबित करें। दूसरे धोने के बाद, सेल के आकार के आधार पर, गोली के कैरीओवर वॉल्यूम में लगभग 340 माइक्रोलीटर जोड़ने के बाद पाइपिंग द्वारा प्रतिबंध बफर के 360 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।क्रोमैटिन अखंडता का परीक्षण करने के लिए लाइसेट के 18 माइक्रोलीटर अलग रखें, या शेष लाइसेट CI.To, 380 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा बनाने के लिए हाई-सी ट्यूब में 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट के 38 माइक्रोलीटर जोड़ें और बुलबुले पेश किए बिना पाइपिंग द्वारा सावधानीपूर्वक मिलाएं। क्रोमैटिन को खोलने के लिए नमूनों को 10 मिनट तक हिलाए बिना 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, तुरंत ट्यूब को बर्फ पर रखें।ट्राइटन एक्स -100 के साथ पाचन मिश्रण तैयार करने के बाद, इस मिश्रण के 107 माइक्रोलीटर को हाई-सी ट्यूब में जोड़ें ताकि कुल मात्रा 487 माइक्रोलीटर हो सके और अंतराल झटकों के साथ थर्मोमिक्सर में रात भर क्रोमैटिन को 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं। अगले दिन, शेष एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि को निष्क्रिय करने के लिए नमूनों को 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करें। नमूने को बर्फ पर रखने के बाद, पाचन नियंत्रण, या डीसी के 10 माइक्रोलीटर अलग रखें, और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।एक पिपेट के साथ या घूमकर ढक्कन से संक्षेपण हटा दें। फिर, 535 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा बनाने के लिए बायोटिन फिल-इन मिश्रण के 58 माइक्रोलीटर जोड़ें। थर्मोमिक्सर में चार घंटे के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने से पहले बुलबुले बनाए बिना धीरे से पिपेट।इनक्यूबेशन बाद, लिगेशन मिश्रण के 665 माइक्रोलीटर जोड़ें, जिससे नमूना मात्रा 1, 200 माइक्रोलीटर हो जाती है। नमूने को पाइप द्वारा मिलाएं और थर्मोमिक्सर में चार घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, हाई-सी नमूना ट्यूब में दो अंशों में प्रोटीन-के के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और अंतराल झटकों के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।डीएनए शुद्धिकरण के लिए, 100% बर्फ-ठंडा इथेनॉल जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 18,000 गुना जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। गैर-पेलेट साइड से सुपरनैटेंट को पूरी तरह से हटा दें और नमूने को 10 मिनट के लिए या जब तक छर्रों को स्पष्ट रूप से सूख न जाए, तब तक हवा में सुखाएं। एक बार छर्रों के सूख जाने के बाद, उन्हें पिपेट या घूमकर ट्रिस लो-ईडीटीए के 450 माइक्रोलीटर में घुलनशील करें।घुलनशील निलंबन को तीन-किलोडाल्टन आणविक भार कटऑफ के साथ 0.5 मिलीमीटर केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट, या सीएफयू में स्थानांतरित करें। सीएफयू को 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से सेंट्रीफ्यूज करें और प्रवाह को छोड़ दें। दूसरे धोने के बाद, कॉलम में ट्रिस लो-ईडीटीए के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें।कॉलम को अधिकतम गति पर दो मिनट के सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक नए संग्रह ट्यूब में बदलें। अंत में, नमूने को 0.8% अगारोस जेल पर लोड करें। पीसीआर अनुमापन परिणामों के साथ एगारोस जेल ने दिखाया कि अधिकांश पुस्तकालयों को अंतिम पीसीआर प्रवर्धन के पांच से आठ चक्रों की आवश्यकता होती है।अंतिम प्रवर्धित पीसीआर लाइब्रेरी का सेल पाचन, जैसा कि एक अगारोस जेल पर छोटे टुकड़ों द्वारा देखा गया है, उचित बंधाव जंक्शनों की उपस्थिति की पुष्टि करता है और अनुक्रमण से पहले गुणवत्ता जांच के रूप में कार्य करता है। अनुक्रमण के बाद, मैप किए गए डेटा से पता चला कि DpnII और DDEI का संयोजन छोटी दूरी के संपर्कों को काफी बढ़ाता है, क्योंकि पारंपरिक फॉर्मलाडेहाइड क्रॉस-लिंकिंग में डीएसजी को जोड़ा जाता है। 2 डी इंटरैक्शन मैट्रिसेस से सीधे लंबी और छोटी दूरी पर एक बेहतर संकेत भी देखा जा सकता है।कम्पार्टमेंट सिग्नल लंबी दूरी पर सीआरआईएसपीआर होते हैं और क्रोमैटिन लूप द्वारा गठित डॉट्स छोटी दूरी पर अधिक प्रमुख होते हैं। फॉर्मलाडेहाइड के अलावा, डीएसजी के साथ क्रॉस-लिंकिंग यादृच्छिक बंधाव को कम करती है, जिससे सीआईएस में सापेक्ष कवरेज में सुधार होता है। क्रॉसलिंकिंग के दौरान और बाद में कोशिकाओं को खोना महत्वपूर्ण नहीं है।सेल छर्रों ढीले या अदृश्य हो सकते हैं, और कोशिकाएं कुछ बफर में पिपेट युक्तियों से चिपक सकती हैं।

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विषाक्त पुफेरफिश की बेहतर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

पेप्टाइड व्युत्पन्न विधि पौधों में सेलुलर के उस पार जीन और प्रोटीन और Organellar बाधाओं को परिवहन करने के लिए

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

स्वचालित Dicentric गुणसूत्र पहचान (ADCI) और खुराक अनुमान द्वारा शीघ्र विकिरण Biodosimetry

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 के पुनः सक्रिय करने के लिए परित shRNA स्क्रीन

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

जीनोम की पीढ़ी चौड़ा क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा पुस्तकालयों जल्दी Drosophila भ्रूण का मंचन

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर Mecp2 के औषधीय पुनः सक्रियण के लिए एक गैर यादृच्छिक माउस मॉडल

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

जेब्राफिश स्पर्मेटोसाइट्स से मेओटिक क्रोमोसोम स्प्रेड की तैयारी

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर (4C) द्वारा भ्रूण निकायों में एन्हांस्ड-प्रमोटर संपर्कों की पहचान

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...