Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Denis Lafontaine per lo sviluppo del protocollo e Sergey Venev per l'assistenza bioinformatica. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program a J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute.
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Passaggi critici per la gestione delle celle Sebbene sia possibile utilizzare un numero inferiore di celle di input, questo protocollo è stato ottimizzato per ~ 5 × 106 celle per corsia di sequenziamento (~ 400 M letture) per garantire la corretta complessità dopo il sequenziamento profondo. Le cellule sono meglio contate prima della fissazione. Per la generazione di librerie ultraprofonde, generalmente moltiplichiamo il numero di corsie (e celle) fino a raggiungere la profondità di lettura desiderata. Per una fissazione ottimale, il mezzo contenente siero deve essere sostituito con PBS prima della fissazione FA e le soluzioni fissative devono essere aggiunte immediatamente e senza gradienti di concentrazione15,22. Per la raccolta cellulare, la raschiatura è preferita alla tripsinizzazione, perché il passaggio da una forma più piatta a una sferica dopo la tripsinizzazione potrebbe influenzare la conformazione nucleare. Dopo l'aggiunta di DSG, i pellet di cellule sciolte e grumose vengono facilmente persi. Fare attenzione quando si maneggiano le cellule in questa fase e aggiungere fino allo 0,05% di BSA per ridurre l'aggregazione.
Modifiche al metodo Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule umane17. Tuttavia, sulla base dell'esperienza con la cattura della conformazione cromosomica, questo protocollo dovrebbe funzionare per la maggior parte delle cellule eucariotiche. Per un input significativamente inferiore (~1 × 106 celle), si consiglia di utilizzare metà dei volumi per le procedure di lisi e cattura della conformazione [passi 2.1-2.4]. Ciò consentirebbe anche di eseguire l'isolamento del DNA [fase 2.5] in una centrifuga da tavolo con tubi da 1,7 ml, che potrebbe migliorare la pellettizzazione per basse concentrazioni di DNA. La quantificazione del DNA (fase 2.6.6) indicherà come procedere. Per basse quantità di DNA isolato (1-5 μg), suggeriamo di saltare la selezione delle dimensioni (fase 3.3) e procedere con la rimozione della biotina dopo aver ridotto il volume da 130 μL a ~45 μL con un CFU.
Questo protocollo è stato sviluppato appositamente per garantire dati di alta qualità dopo la successiva reticolazione con FA e DSG e la digestione con DpnII e DdeI. Tuttavia, strategie di reticolazione alternative come la FA seguita da EGS (glicole etilenico bis (succinimidil succinato)), utilizzata anche in ChIP-seq23 e ChIA-PET24, potrebbero funzionare altrettanto bene17. Allo stesso modo, diverse combinazioni enzimatiche, come DpnII e HinfI18 o MboI, MseI e NlaIII19 possono essere utilizzate per la digestione. Quando si adattano le combinazioni enzimatiche, assicurarsi di utilizzare nucleotidi biotinilati in grado di riempire le sporgenze specifiche di 5' e utilizzare i tamponi più ottimali per ogni cocktail. DpnII viene fornito con il proprio tampone e il produttore dell'enzima raccomanda un tampone specifico per la digestione DdeI. Tuttavia, per la doppia digestione con DpnII e DdeI in questo protocollo, il Restriction Buffer è raccomandato perché è valutato al 100% di attività per entrambi gli enzimi.
Risoluzione dei problemi relativi all'acquisizione delle conformazioni I tre passaggi chiave nella cattura della conformazione cromosomica: reticolazione, digestione e religenza sono stati tutti eseguiti prima che i risultati possano essere visualizzati su gel. Per determinare la qualità di ciascuno di questi tre passaggi e discernere dove potrebbero essere sorti problemi, le aliquote prima (CI) e dopo la digestione (DC) vengono prelevate e caricate sul gel insieme al campione Hi-C legato (Figura 2). Questo gel viene utilizzato per determinare la qualità del campione Hi-C e se varrà la pena continuare il protocollo. Senza CI e DC, è difficile individuare potenziali passaggi subottimali. Vale la pena notare che la legatura subottimale potrebbe essere dovuta a un problema nella legatura stessa, il fill-in o un problema con la reticolazione. Per risolvere i problemi di reticolazione, assicurarsi di non utilizzare più di 1 × 107 cellule per libreria e iniziare con reagenti di reticolazione freschi e cellule pulite (cioè risciacquate con PBS). Per la legatura, assicurarsi che le cellule e la miscela di legatura siano mantenute sul ghiaccio. Aggiungere T4 DNA ligasi poco prima dell'incubazione di 4 ore a 16 °C e mescolare bene.
Risoluzione dei problemi relativi alla preparazione della libreria Se sono necessari più di 10 cicli di PCR o nessun prodotto PCR può essere visto sul gel dopo la titolazione PCR (Figura 4), ci sono alcune opzioni per salvare il campione Hi-C. Lavorando a ritroso dalla titolazione della PCR, la prima opzione è quella di provare di nuovo la PCR. Se non c'è ancora abbastanza prodotto, è possibile tentare un altro giro di coda A e legatura dell'adattatore (passaggio 3.6) dopo aver lavato le perline due volte con 1x tampone TLE. Dopo questa ulteriore legatura della coda A e dell'adattatore, si può procedere alla titolazione PCR come prima. Se non c'è ancora alcun prodotto, l'ultima opzione è quella di risonicare la frazione 0,8x dal passaggio 3.3 e procedere da lì.
Limitazioni e vantaggi di Hi-C3.0 È importante rendersi conto che Hi-C è un metodo basato sulla popolazione che cattura la frequenza media delle interazioni tra coppie di loci nella popolazione cellulare. Alcune analisi computazionali sono progettate per districare combinazioni di conformazioni da una popolazione25, ma in linea di principio, Hi-C è cieco alle differenze tra le cellule. Sebbene sia possibile eseguire Hi-C26,27 a cella singola e possano essere effettuate inferenze computazionali28, Hi-C a cella singola non è adatto per ottenere informazioni 3C ad altissima risoluzione. Un'ulteriore limitazione di Hi-C è che rileva solo interazioni a coppie. Per rilevare interazioni multicontatto, è possibile utilizzare frese frequenti combinate con sequenziamento a lettura breve (Illumina)16 o eseguire il sequenziamento multicontatto 3C29 o 4C30, utilizzando il sequenziamento a lunga lettura dalle piattaforme PacBio o Oxford Nanopore. Sono stati sviluppati anche derivati Hi-C per rilevare specificamente i contatti tra e lungo i cromatidi fratelli31,32.
Sebbene Hi-C19 e Micro-C33 possano essere utilizzati per generare mappe di contatto a risoluzioni subkilobase, entrambi richiedono una grande quantità di letture di sequenziamento e questo può diventare un'impresa costosa. Per ottenere una risoluzione simile o addirittura superiore senza i costi, è possibile applicare l'arricchimento per specifiche regioni genomiche (capture-C 34) o specifiche interazioni proteiche (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). Il punto di forza e lo svantaggio di queste applicazioni di arricchimento è che viene campionato solo un numero limitato di interazioni. Con tali arricchimenti, l'aspetto globale di Hi-C (e l'opzione della normalizzazione globale) è perso.
Importanza e potenziali applicazioni di Hi-C3.0 Questo protocollo è stato progettato per consentire 3C ultraprofondi ad alta risoluzione e allo stesso tempo rilevare caratteristiche di piegatura su larga scala come TAD e scomparti17 (Figura 6). Questo protocollo inizia con 5 × 106 celle per tubo per ogni libreria Hi-C, che dovrebbe essere materiale più che sufficiente per sequenziare una o due corsie su una cella di flusso per ottenere fino a 1 miliardo di letture accoppiate. Per il sequenziamento ultraprofondo, devono essere preparate più provette da 5 × 106 cellule, a seconda del numero di letture mappate e duplicati PCR. Alla massima risoluzione (<1 kb), le interazioni cicliche si trovano principalmente tra i siti CTCF, ma possono anche essere rilevate interazioni promotore-potenziatore. I lettori possono fare riferimento ad Akgol Oksuz et al.17 per una descrizione dettagliata dell'analisi dei dati.

La cattura della conformazione cromosomica è stata utilizzata dal 20021. Fondamentalmente, ogni variante di cattura della conformazione si basa sulla fissazione delle interazioni DNA-proteina e proteina-proteina per preservare l'organizzazione della cromatina 3D. Questo è seguito dalla frammentazione del DNA, di solito dalla digestione di restrizione e, infine, dalla religenza delle estremità del DNA vicine per convertire loci spazialmente prossimali in sequenze di DNA covalenti uniche. I protocolli 3C iniziali utilizzavano la PCR per campionare specifiche interazioni "one-to-one". I successivi saggi 4C hanno permesso di rilevare interazioni "uno-a-tutti"2, mentre 5C ha rilevato interazioni "molti-a-molti"3. La cattura della conformazione cromosomica è arrivata a pieno compimento dopo aver implementato il sequenziamento ad alto rendimento (NGS) di nuova generazione, che ha permesso di rilevare interazioni genomiche "all-to-all" utilizzando Hi-C 4 a livello di genoma e tecniche comparabili come 3C-seq5, TCC6 eMicro-C 7,8 (vedi anche revisione di Denker e De Laat9).
In Hi-C, i nucleotidi biotinilati sono usati per marcare le sporgenze di 5' dopo la digestione e prima della legatura (Figura 1). Ciò consente la selezione di frammenti correttamente digeriti e religati utilizzando perle rivestite di streptavidina, distinguendolo dal GCC10. Un importante aggiornamento del protocollo Hi-C è stato implementato da Rao et al.11, che hanno eseguito la digestione e la religazione in nuclei intatti (cioè in situ) per ridurre i prodotti di legatura spuria. Inoltre, la sostituzione della digestione HindIII con la digestione MboI (o DpnII) ha ridotto la dimensione del frammento e aumentato il potenziale di risoluzione di Hi-C. Questo aumento ha permesso la rilevazione di strutture relativamente piccole e una localizzazione genomica più precisa dei punti di contatto, come i loop di DNA tra piccoli cis-elementi, ad esempio loop tra siti legati al CTCF generati dall'estrusione di loop11,12. Tuttavia, questo potenziale ha un costo. In primo luogo, un aumento di due volte della risoluzione richiede un aumento di quattro volte (22) delle letture di sequenziamento13. In secondo luogo, le piccole dimensioni dei frammenti aumentano la possibilità di confondere i frammenti vicini non digeriti con frammenti digeriti e relegati14. Come accennato, in Hi-C, i frammenti digeriti e relegati differiscono dai frammenti non digeriti per la presenza di biotina alla giunzione della legatura. Tuttavia, è necessaria una corretta rimozione della biotina dalle estremità non legate per assicurare che solo le giunzioni di legatura vengano abbassate14,15.
Con la diminuzione del costo di NGS, diventa possibile studiare il ripiegamento cromosomico in modo più dettagliato. Per ridurre le dimensioni dei frammenti di DNA, e quindi aumentare la risoluzione, il protocollo Hi-C può essere adattato per utilizzare più frequentemente gli enzimi di restrizione di taglio16 o per utilizzare combinazioni di enzimi di restrizione17,18,19. In alternativa, MNasi 7,8 in Micro-C e DNasi in DNasi Hi-C20 possono essere titolate per ottenere una digestione ottimale.
Una recente valutazione sistematica dei fondamenti dei metodi 3C ha mostrato che la rilevazione delle caratteristiche di ripiegamento cromosomico su ogni scala di lunghezza è notevolmente migliorata con la reticolazione sequenziale con 1% FA seguito da 3 mM DSG17. Inoltre, Hi-C con digestione HindIII era l'opzione migliore per rilevare caratteristiche di piegatura su larga scala, come i compartimenti, e che Micro-C era superiore nel rilevare caratteristiche di ripiegamento su piccola scala come i loop di DNA. Questi risultati hanno portato allo sviluppo di un'unica strategia "Hi-C 3.0" ad alta risoluzione, che utilizza la combinazione di reticolanti FA e DSG seguita da una doppia digestione con endonucleasi DpnII e DdeI21. Hi-C 3.0 fornisce una strategia efficace per l'uso generale perché rileva con precisione le caratteristiche di piegatura su tutte le scale di lunghezza17. La parte sperimentale del protocollo Hi-C 3.0 è dettagliata qui e vengono mostrati i risultati tipici che ci si può aspettare dopo il sequenziamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figura 1: Procedura Hi-C in sei fasi. Le celle vengono fissate prima con FA e poi DSG (1). Quindi, la lisi precede una doppia digestione con DdeI e DpnII (2). La biotina viene aggiunta per riempimento sporgente e le estremità smussate prossimali vengono legate (3) prima della purificazione del DNA (4). La biotina viene rimossa dalle estremità non legate prima della sonicazione e della selezione delle dimensioni (5). Infine, il pull-down della biotina consente la legatura dell'adattatore e l'amplificazione della libreria mediante PCR (6). Abbreviazioni: FA = formaldeide; DSG = glutarato di disuccinimidile; B = Biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

La cattura della conformazione cromosomica (3C) viene utilizzata per rilevare interazioni tridimensionali della cromatina. Tipicamente, la reticolazione chimica con la formaldeide (FA) viene utilizzata per fissare le interazioni della cromatina. Quindi, la digestione della cromatina con un enzima di restrizione e la successiva legatura delle estremità del frammento converte la prossimità tridimensionale (3D) in prodotti di legatura unici. Infine, dopo l'inversione dei legami incrociati, la rimozione delle proteine e l'isolamento del DNA, il DNA viene tagliato e preparato per il sequenziamento ad alto rendimento. La frequenza di legatura di prossimità di coppie di loci è una misura della frequenza della loro colocalizzazione nello spazio tridimensionale in una popolazione cellulare.
Una libreria Hi-C sequenziata fornisce informazioni sull'intero genoma sulle frequenze di interazione tra tutte le coppie di loci. La risoluzione e la precisione di Hi-C si basano su una reticolazione efficiente che mantiene i contatti della cromatina e la frammentazione frequente e uniforme della cromatina. Questo articolo descrive un protocollo Hi-C in situ migliorato, Hi-C 3.0, che aumenta l'efficienza della reticolazione combinando due reticolanti (formaldeide [FA] e disuccinimidil glutarato [DSG]), seguiti da una digestione più fine utilizzando due enzimi di restrizione (DpnII e DdeI). Hi-C 3.0 è un singolo protocollo per la quantificazione accurata delle caratteristiche di ripiegamento del genoma su scale più piccole come loop e domini topologicamente associati (TAD), nonché caratteristiche su scale più grandi a livello di nucleo come i compartimenti.

Le figure in questo manoscritto sono state generate da un esperimento separato e replicato di quello pubblicato in precedenza da Lafontaine et al.21. Dopo aver ottenuto dati di sequenziamento ad alto throughput, è stato utilizzato l'Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) per elaborare i dati Hi-C. Una pipeline simile può essere trovata sul portale dati del progetto 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). In breve, il distillatore di pipeline Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) è stato implementato per (1) allineare le sequenze di molecole Hi-C al genoma di riferimento, (2) analizzare l'allineamento .sam e formare i file con coppie Hi-C, (3) filtrare i duplicati della PCR e (4) aggregare coppie in matrici binnate di interazioni Hi-C. Queste matrici formattate HDF5, chiamate cooler, possono quindi essere (1) visualizzate su un server HiGlass (https://higlass.io/) e (2) analizzate utilizzando un ampio set di strumenti computazionali open source presenti nella collezione "cooltools" gestita dall'Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) per estrarre e quantificare caratteristiche di piegatura come scomparti, TAD e loop.
Alcuni indicatori di qualità delle librerie Hi-C3.0 possono essere valutati immediatamente dopo aver mappato le coppie di lettura a un genoma di riferimento, utilizzando alcune semplici metriche/indicatori. In primo luogo, in genere ~ 50% delle coppie di lettura sequenziate può essere mappato in modo univoco per le cellule umane. A causa della natura polimerica dei cromosomi, la maggior parte di queste letture mappate (~ 60% -90%) rappresentano interazioni all'interno di un cromosoma (cis), con frequenze di interazione che decadono rapidamente con l'aumentare della distanza genomica (decadimento dipendente dalla distanza). Il decadimento dipendente dalla distanza può essere visualizzato meglio in un "grafico di scala", che mostra la probabilità di contatto (per braccio cromosomico) in funzione della distanza genomica. Abbiamo scoperto che l'uso di diversi reticolanti ed enzimi può alterare il decadimento dipendente dalla distanza a lunghe e corte distanze17. L'aggiunta di reticolazione DSG aumenta la rilevabilità delle interazioni a brevi distanze quando combinata con enzimi come Mnase e combinazioni di DpnII-DdeI che producono frammenti più piccoli (Figura 6A).
Il decadimento dipendente dalla distanza può anche essere osservato direttamente dalle matrici di interazione 2D: le interazioni diventano più rare quando si trovano più lontano dalla diagonale centrale (Figura 6B). Inoltre, le caratteristiche di ripiegamento genomico, come compartimenti, TAD e loop possono essere identificate da matrici Hi-C e grafici di scala come deviazioni dal decadimento medio generale dipendente dalla distanza dell'intero genoma. È importante sottolineare che il crosslinking con DSG in aggiunta a FA diminuisce le legature casuali, che sono illimitate a causa della natura polimerica dei cromosomi e, quindi, è più probabile che si verifichino tra i cromosomi (in trans) (Figura 6C). La riduzione della legatura casuale porta ad un aumento dei rapporti segnale-rumore, specialmente per le interazioni intracromosomiche intercromosomiche e a lunghissimo raggio (>10-50 Mb).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figura 6: Risultati rappresentativi delle librerie Hi-C mappate e filtrate. (A) Grafici di scala con probabilità di contatto e sua derivata per vari enzimi, ordinati per lunghezza del frammento (in alto) e reticolazione con FA o FA + DSG (in basso). La digestione con MNAse (microC) o DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) aumenta significativamente i contatti a corto raggio (in alto) così come l'aggiunta di DSG a FA (in basso). (B) Le colonne mostrano le mappe di calore Hi-C della digestione DpnII dopo la sola reticolazione FA e la digestione DpnII o DdeI dopo la reticolazione FA + DSG. Le frecce bianche mostrano una crescente forza dei "punti" dopo la reticolazione DSG e la digestione DdeI, il che implica una migliore rilevazione dei loop di DNA. Le righe mostrano diverse parti del cromosoma 3 ad alta risoluzione, allineandosi con il pannello C: riga superiore: cromosoma intero 3 (0-198.295.559 Mb); fila centrale: 186-196 Mb; riga inferiore: 191,0-191,5 Mb. (C) Grafici di copertura per le regioni rappresentate in A. Le frecce nere mostrano la copertura inferiore (%cis legge) per la reticolazione solo FA. Abbreviazioni: FA = formaldeide; DSG = glutarato di disuccinimidile; CHR = cromosoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Non tutte le letture mappate sono utili. Un secondo indicatore di qualità è il numero di duplicati PCR. È altamente improbabile che le letture duplicate esatte si verifichino per caso dopo la legatura e la sonicazione. Pertanto, tali letture probabilmente derivano dall'amplificazione PCR e devono essere filtrate. I duplicati spesso si verificano quando sono necessari troppi cicli di PCR per amplificare librerie a bassa complessità. Generalmente, per Hi-C, la maggior parte delle librerie ha bisogno solo di 5-8 cicli di amplificazione finale della PCR, come determinato dalla titolazione PCR (vedere passo 3.9; Figura 4). Tuttavia, librerie con sufficiente complessità possono essere ottenute anche dopo 14 cicli di amplificazione PCR.
Un'altra categoria di letture duplicate, i cosiddetti duplicati ottici, può derivare dal processo di amplificazione su piattaforme di sequenziamento Illumina che utilizzano celle di flusso modellate (come HiSeq4000). I duplicati ottici si trovano sia dal sovraccarico della cella di flusso, causando cluster (grandi) chiamati due cluster separati, sia dal riclustering locale della molecola originale accoppiata dopo un primo ciclo di PCR. Poiché entrambi i tipi di duplicati ottici sono locali, possono essere identificati e distinti dai duplicati PCR in base alla loro posizione sulla cella di flusso. Mentre le librerie con duplicati PCR del >15% avrebbero bisogno di rigenerazione, le librerie con duplicati ottici possono essere ricaricate dopo aver ottimizzato il processo di caricamento.
Tabella supplementare S1: Buffer e soluzioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 è un protocollo Hi-C migliorato che combina crosslinker di formaldeide e disuccinimidil glutarato con un cocktail di enzimi di restrizione DpnII e DdeI per aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione del rilevamento dell'interazione cromatina.

Acquisizione della conformazione cromosomica su scale di lunghezza

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Questo protocollo rileva accuratamente le caratteristiche di ripiegamento cromosomico su scale di lunghezza multipla con un segnale di fondo basso. Ad esempio, le interazioni del promotore enhancer possono essere analizzate nel contesto dei compartimenti cromosomici. L'uso di endonucleasi di restrizione aggira l'ottimizzazione del livello di digestione del materiale in ingresso.Non è richiesta alcuna selezione mediante isolamento del gel per catturare i prodotti di legatura. Il problema più comune è la perdita di cellule dopo la fissazione del DSG e la cattura di abbastanza DNA per produrre librerie di alta qualità. Per iniziare, aspirare il mezzo con una pipetta Pasteur accoppiata a una trappola a vuoto dalla piastra da 150 millimetri contenente 5 per 10 alla sesta cella.Lavare le celle due volte con 10 millilitri di HBSS. Per reticolare le cellule, versare 23,125 millilitri della soluzione di formaldeide all'1% nella piastra da 15 centimetri. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, dondolando delicatamente la piastra a mano ogni due minuti.Quindi, aggiungere 1,25 millilitri di glicina 2,5 molare e ruotare delicatamente la piastra per estinguere la reazione di reticolazione, prima di incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Continuare l'incubazione sul ghiaccio per 15 minuti per interrompere la reticolazione. Raschiare le celle dalla piastra con un raschietto cellulare o un poliziotto di gomma e trasferire la sospensione della cella in un tubo conico da 50 millilitri con una pipetta.Centrifugare la sospensione a 1.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante mediante aspirazione. Lavare il pellet una volta con 10 millilitri di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco, o DPBS. Quindi, centrifugare di nuovo prima di procedere alla reticolazione DSG.Per la reticolazione con DSG, risospendere le celle pellettate in 9,9 millilitri di DPBS. Quindi, aggiungere 100 microlitri di DSG da 300 millimolari. Mescolare il tubo per inversione e reticolare le celle a temperatura ambiente per 40 minuti su un rotatore.Dopo la reticolazione, aggiungere 1,925 millilitri di glicina 2,5 molare, invertire per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti e risospendere il pellet in un millilitro di albumina sierica bovina allo 0,05% DPBS prima di trasferirlo in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare le cellule a 2.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.Congelare il pellet in azoto liquido prima di procedere alla cattura della conferma cromosomica. Risospendere l'aliquota della cellula reticolata in un millilitro di tampone di lisi ghiacciato contenente 10 microlitri di cocktail inibitore della proteasi e trasferirlo in un omogeneizzatore Dounce per 15 minuti di incubazione su ghiaccio. Spostare lentamente il pestello A su e giù 30 volte per omogeneizzare le cellule e incubare per un minuto per consentire alle cellule di raffreddarsi prima di altri 30 colpi.Dopo l'ultimo colpo, trasferire il lisato in un tubo da 1,7 millilitri. Centrifugare la sospensione lisata a 2.500 volte G per cinque minuti. Scartare il surnatante e scorrere o vortice per risospendere il pellet bagnato.Rimuovere il più possibile il surnatante per ottenere una sostanza simile allo yogurt con grumi minimi. Risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di restrizione ghiacciato prima della centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il pellet in 360 microlitri di tampone di restrizione mediante pipettaggio dopo aver aggiunto circa 340 microlitri al volume di trascinamento del pellet, a seconda delle dimensioni della cella.Mettere da parte 18 microlitri di lisato per testare l'integrità della cromatina, o CI.To il lisato rimanente, aggiungere 38 microlitri di 1% di sodio dodecilsolfato al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 380 microlitri e mescolare accuratamente mediante pipettaggio senza introdurre bolle. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius senza agitare per 10 minuti per aprire la cromatina. Quindi, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio.Dopo aver preparato la miscela di digestione con Triton X-100, aggiungere 107 microlitri di questa miscela al tubo hi-C per ottenere un volume totale di 487 microlitri e digerire la cromatina durante la notte a 37 gradi Celsius in un termomixer con agitazione a intervalli. Il giorno successivo, trasferire i campioni a 65 gradi Celsius per 20 minuti per disattivare l'attività endonucleasi rimanente. Dopo aver posizionato il campione sul ghiaccio, mettere da parte 10 microlitri di controllo della digestione, o DC, e conservarli a quattro gradi Celsius.Rimuovere la condensa dal coperchio con una pipetta o ruotando. Quindi, aggiungere 58 microlitri di miscela di riempimento di biotina per ottenere un volume totale di 535 microlitri. Pipettare delicatamente senza formare bolle prima di incubare a 23 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore.Dopo l'incubazione, aggiungere 665 microlitri di miscela di legatura, rendendo il volume del campione 1.200 microlitri. Mescolare il campione mediante pipettaggio e incubare a 16 gradi Celsius per quattro ore in un termomiscelatore. Quindi, aggiungere 50 microlitri di proteinasi-K in due frazioni alla provetta hi-C e incubare durante la notte a 65 gradi Celsius con agitazione a intervalli.Per la purificazione del DNA, aggiungere etanolo ghiacciato al 100% e centrifugare i tubi a 18.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere completamente il surnatante dal lato non pellet e asciugare all'aria il campione per 10 minuti o fino a quando i pellet sono visibilmente asciutti. Una volta che i pellet sono asciutti, solubilizzarli in 450 microlitri di Tris a basso EDTA mediante pipettaggio o vortice.Trasferire la sospensione solubilizzata in un'unità filtrante centrifuga da 0,5 millimetri, o CFU, con un limite di peso molecolare di tre kilodalton. Centrifugare il CFU alla massima velocità per 10 minuti ed eliminare il flusso passante. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 80 microlitri di Tris a basso contenuto di EDTA alla colonna.Trasformare la colonna in un nuovo tubo di raccolta per due minuti di centrifugazione alla massima velocità. Infine, caricare i campioni su un gel di agarosio allo 0,8%. Il gel di agarosio con risultati di titolazione PCR ha dimostrato che la maggior parte delle librerie richiede da cinque a otto cicli di amplificazione finale della PCR.La digestione cellulare della libreria finale di PCR amplificata, come osservato da frammenti più piccoli su un gel di agarosio, conferma la presenza di giunzioni di legatura corrette e serve come controllo di qualità prima del sequenziamento. Dopo il sequenziamento, i dati mappati hanno mostrato che la combinazione di DpnII e DdeI aumenta significativamente i contatti a corto raggio, aggiungendo DSG alla reticolazione convenzionale della formaldeide. Un segnale migliorato potrebbe anche essere osservato a lunghe e brevi distanze direttamente dalle matrici di interazione 2D.I segnali compartimentali sono CRISPR a lunghe distanze e i punti formati dai loop della cromatina sono più prominenti a brevi distanze. Oltre alla formaldeide, il cross-linking con DSG diminuisce le legature casuali, migliorando la copertura relativa in cis. È importante non perdere cellule durante e dopo la reticolazione.I pellet cellulari possono essere sciolti o invisibili e le cellule possono attaccarsi alle punte delle pipette in alcuni dei tamponi.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Ricerca

Genetica

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