Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
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プロトコル開発のDenis LafontaineとBioinformaticの支援をしてくれたSergey Venevに感謝します。この研究は、国立衛生研究所共通基金4D Nucleome ProgramからJ.D.への助成金(U54-DK107980、UM1-HG011536)によって支援されました。JDはハワードヒューズ医学研究所の研究者です。
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著者は開示する利益相反を持っていません。

セル処理の重要なステップ より少ない数のインプットセルを使用することも可能ですが、このプロトコルは、シーケンシングレーンあたり~5×106セル(~400 Mリード)に最適化されており、ディープシーケンシング後の適切な複雑さを確保しています。細胞は固定前に最もよく数えられます。超深度ライブラリの生成では、通常、目的の読み取り深度に達するまでレーン(およびセル)の数を乗算します。最適な固定のためには、FA固定の前に血清含有培地をPBSに交換し、固定液を濃度勾配なしで直ちに添加する必要があります15,22。細胞回収では、トリプシン処理後の平坦形状から球形への遷移が核立体構造に影響を与える可能性があるため、トリプシン処理よりも掻き取りが好まれます。DSGの添加後、ゆるくて塊状の細胞ペレットは容易に失われる。この段階で細胞を取り扱うときは注意し、凝集を減らすために最大0.05%のBSAを追加します。
メソッドの変更 このプロトコルは、ヒト細胞17を用いて開発された。それでも、染色体立体配座捕捉の経験に基づいて、このプロトコルはほとんどの真核細胞で機能するはずです。入力量が著しく低い場合(~1 ×10 6 細胞)、溶解および立体構造捕捉手順に半分の体積を使用することをお勧めします[ステップ2.1-2.4]。これにより、1.7 mLチューブを備えた卓上遠心分離機でDNA単離[ステップ2.5]を行うことができ、低DNA濃度のペレット化を改善することができます。DNAの定量(ステップ2.6.6)は、進め方を示します。単離されたDNA(1-5 μg)の量が少ない場合は、サイズ選択をスキップし(ステップ3.3)、CFUで容量を130 μLから~45 μLに減らした後、ビオチン除去を進めることをお勧めします。
このプロトコルは、その後のFAおよびDSGによる架橋およびDpnIIおよびDdeIによる消化後の高品質のデータを確保するために特別に開発されました。ただし、ChIP-seq23 およびChIA-PET24でも使用されているFAとそれに続くEGS(エチレングリコールビス(スクシンイミジルコハク酸塩))などの代替架橋戦略も同様にうまく機能する可能性があります17。同様に、DpnIIとHinfI18 またはMboI、MseI、およびNlaIII19 などの異なる酵素の組み合わせを消化に使用できます。酵素の組み合わせを適応させるときは、特定の5'オーバーハングを埋めることができるビオチン化ヌクレオチドを使用し、各カクテルに最適なバッファーを使用してください。DpnIIには独自のバッファーが付属しており、酵素メーカーはDdeI消化用の特定のバッファーを推奨しています。ただし、このプロトコルのDpnIIとDdeIによる二重消化には、両方の酵素で100%の活性が評価されているため、制限バッファーが推奨されます。
コンフォメーションキャプチャのトラブルシューティング 染色体コンフォメーションキャプチャの3つの重要なステップである架橋、消化、ライゲーションはすべて、結果をゲルで視覚化する前に実行されました。これら3つのステップのそれぞれの品質を判断し、問題が発生した可能性のある場所を識別するために、消化前(CI)と消化後(DC)のアリコートを採取し、ライゲーションされたHi-Cサンプルとともにゲルにロードします(図2)。このゲルは、Hi-Cサンプルの品質を判断し、プロトコルを継続する価値があるかどうかを判断するために使用されます。CIとDCがなければ、潜在的な次善のステップを特定することは困難です。次善のライゲーションは、ライゲーション自体の問題、フィルイン、または架橋の問題が原因である可能性があることは注目に値します。架橋のトラブルシューティングを行うには、ライブラリあたり1×107 細胞以上を使用せず、新しい架橋試薬とクリーンな細胞(PBSですすいで)から始めてください。ライゲーションでは、細胞とライゲーション混合物が氷上に保たれていることを確認してください。16°Cで4時間インキュベートする直前にT4 DNAリガーゼを加え、よく混ぜます。
ライブラリ準備のトラブルシューティング 10回を超えるPCRサイクルが必要な場合、またはPCR滴定後にゲルにPCR産物が見られない場合(図4)、Hi-Cサンプルを保存するためのいくつかのオプションがあります。PCR滴定からさかのぼって、最初のオプションはPCRを再試行することです。それでも十分な製品がない場合は、1x TLEバッファーでビーズを2回洗浄した後、Aテーリングとアダプターライゲーション(ステップ3.6)の別のラウンドを試みることができます。この追加のAテーリングとアダプターライゲーションの後、以前と同様にPCR滴定に進むことができます。それでも製品がない場合、最後のオプションは、ステップ3.3の0.8倍フラクションを再超音波処理し、そこから続行することです。
Hi-C3.0の制限事項と利点 Hi-Cは、細胞集団内の遺伝子座のペア間の相互作用の平均頻度をキャプチャする集団ベースの方法であることを認識することが重要です。いくつかの計算解析は、集団25から立体構造の組み合わせを解きほぐすように設計されていますが、原則として、Hi-Cは細胞間の違いを知らされません。シングルセルHi−C26,27を行うことは可能であり、計算推論28を行うことができるが、シングルセルHi−Cは超高分解能3C情報を得るのには適していない。Hi-Cの追加の制限は、ペアワイズ相互作用のみを検出することです。マルチコンタクト相互作用を検出するには、ショートリードシーケンシング(Illumina)16と組み合わせて頻繁なカッターを使用するか、PacBioまたはOxford Nanoporeプラットフォームのロングリードシーケンシングを使用してマルチコンタクト3C29または4C30を実行することができます。姉妹染色分体間および姉妹染色分体に沿った接触を特異的に検出するためのHi−C誘導体も開発されている31,32。
Hi-C19とMicro-C33は、サブキロベースの解像度でコンタクトマップを生成するために使用できますが、どちらも大量のシーケンシングリードを必要とし、これはコストのかかる作業になる可能性があります。コストをかけずに同等またはさらに高い分解能を得るために、特定のゲノム領域(キャプチャーC 34)または特定のタンパク質相互作用(ChiA-PET 35、PLAC-seq36、Hi-ChIP37)の濃縮を適用できます。これらのエンリッチメント アプリケーションの長所と欠点は、サンプリングされる相互作用の数が限られていることです。このようなエンリッチメントにより、Hi-C のグローバルな側面 (およびグローバル正規化のオプション) が失われます。
Hi-C3.0の重要性と応用の可能性 このプロトコルは、TADやコンパートメント17などの大規模な折り畳み機能を同時に検出しながら、高解像度の超深度3Cを可能にするように設計されています(図6)。このプロトコルは、Hi-Cライブラリごとにチューブあたり5セル×10セルから始まり、フローセルで1レーンまたは2レーンをシーケンスして最大10億のペアエンドリードを取得するのに十分な材料である必要があります。超ディープシーケンシングでは、マッピングされたリードとPCRの重複の数に応じて、5×106細胞の複数のチューブを準備する必要があります。最高分解能(<1 kb)では、CTCF部位間でループ相互作用が主に見られますが、プロモーター-エンハンサー相互作用も検出できます。読者は、データ分析の詳細な説明について、Akgol Oksuz et al.17を参照することができます。

染色体コンフォメーションキャプチャーは、2002年から使用されています1。基本的に、すべてのコンフォメーションキャプチャバリアントは、3Dクロマチン組織を維持するためにDNA-タンパク質およびタンパク質-タンパク質相互作用の固定に依存しています。これに続いて、通常は制限酵素処理によるDNA断片化が行われ、最後に、近くのDNA末端がライゲーションされて、空間的に近位の遺伝子座が固有の共有DNA配列に変換されます。初期の3Cプロトコルでは、PCRを使用して特定の「1対1」の相互作用をサンプリングしていました。その後の4Cアッセイでは、「1対すべて」の相互作用2の検出が可能になり、5Cは「多対多」の相互作用3を検出できました。染色体コンフォメーションキャプチャは、ゲノムワイドなHi-C4および3C-seq5、TCC6、Micro-C 7,8などの同等の技術を使用して「オールツーオール」ゲノム相互作用の検出を可能にする次世代のハイスループットシーケンシング(NGS)を実装した後に完全に実を結びました(DenkerとDe Laat9によるレビューも参照)。
Hi-Cでは、ビオチン化ヌクレオチドを使用して、消化後およびライゲーション前に5'オーバーハングをマークします(図1)。これにより、ストレプトアビジンコーティングビーズを使用して適切に消化およびライゲーションされたフラグメントを選択でき、GCC10とは一線を画しています。Hi-Cプロトコルの重要な更新は、スプリアスライゲーション生成物を減らすために無傷の核(すなわち、in situ)で消化とライゲーションを行ったRaoら11によって実装されました。さらに、HindIII消化をMboI(またはDpnII)消化に置き換えると、フラグメントサイズが小さくなり、Hi-Cの分解能の可能性が高まりました。この増加により、比較的小規模な構造の検出が可能になり、小さなシスエレメント間のDNAループ、例えばループ押出によって生成されたCTCF結合部位間のループなど、接触点のより正確なゲノム局在が可能になりました11,12。ただし、この可能性にはコストがかかります。まず、分解能を2倍に向上させるには、シーケンシングリードを4倍(22)に増やす必要があります13。第2に、断片サイズが小さいと、未消化の隣接断片を消化断片およびライゲーション断片と間違える可能性が高まります14。前述のように、Hi-Cでは、消化された断片およびライゲーションされた断片は、ライゲーション接合部におけるビオチンの存在によって未消化断片とは異なる。しかしながら、ライゲーション接合部のみが引き下げられることを保証するために、結紮されていない末端からの適切なビオチン除去が必要である14、15。
NGSのコストが下がるにつれて、染色体折り畳みをより詳細に研究することが可能になります。DNA断片のサイズを減少させ、それによって分離能を増加させるために、Hi−Cプロトコルは、より頻繁に切断制限酵素16を使用するか、または制限酵素17、18、19の組み合わせを使用するように適合させることができる。あるいは、マイクロC中のMNase 7,8およびDNase Hi-C20中のDNaseを滴定して、最適な消化を達成することができます。
3C法の基礎に関する最近の系統的評価では、1%FAとそれに続く3 mM DSG17による連続架橋により、あらゆる長さスケールでの染色体折り畳み機能の検出が大幅に改善されることが示されました。さらに、HindIII消化を伴うHi-Cは、コンパートメントなどの大規模なフォールディング機能を検出するための最良のオプションであり、Micro-CはDNAループなどの小規模なフォールディング機能の検出に優れていました。これらの結果は、FA架橋剤とDSG架橋剤の組み合わせを使用し、その後DpnIIおよびDdeIエンドヌクレアーゼ21で二重消化する単一の高分解能「Hi-C 3.0」戦略の開発につながりました。Hi-C 3.0は、すべての長さスケールで折り畳み機能を正確に検出するため、一般的な使用に効果的な戦略を提供します17。Hi-C 3.0プロトコルの実験部分はここで詳述され、シーケンシング後に期待できる典型的な結果が示されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> 図1:6つのステップでのHi-C手順。 セルは最初にFAで固定され、次にDSGで固定されます(1)。次に、溶解はDdeIとDpnIIによる二重消化に先行します(2)。ビオチンはオーバーハングフィルインによって添加され、近位平滑末端はDNA精製(4)の前にライゲーションされます(3)。ビオチンは、超音波処理およびサイズ選択の前に結紮されていない末端から除去される(5)。最後に、ビオチンのプルダウンにより、アダプターライゲーションとPCRによるライブラリ増幅が可能になります(6)。略語:FA =ホルムアルデヒド;DSG =ジスクシンイミジルグルタル酸;B =ビオチン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)は、3次元クロマチン相互作用を検出するために使用されます。通常、ホルムアルデヒド(FA)による化学架橋は、クロマチン相互作用を固定するために使用されます。次に、制限酵素によるクロマチン消化とそれに続くフラグメント末端のライゲーションにより、3次元(3D)近接性が独自のライゲーション産物に変換されます。最後に、架橋の逆転、タンパク質除去、およびDNA単離の後、DNAをせん断し、ハイスループットシーケンシング用に準備します。遺伝子座の対の近接ライゲーションの頻度は、細胞集団における三次元空間におけるそれらの共局在の頻度の尺度である。
配列決定されたHi-Cライブラリは、遺伝子座のすべてのペア間の相互作用頻度に関するゲノム全体の情報を提供します。Hi-Cの分解能と精度は、クロマチンの接触とクロマチンの頻繁で均一な断片化を維持する効率的な架橋に依存しています。この論文では、2つの架橋剤(ホルムアルデヒド[FA]とジスクシンイミジルグルタル酸[DSG])を組み合わせることで架橋効率を高め、2つの制限酵素(DpnIIとDdeI)を使用してより細かい消化を行うことで、改良された in situHi-C プロトコルHi-C 3.0について説明します。Hi-C 3.0は、ループやトポロジー関連ドメイン(TAD)などの小さなスケールでのゲノムフォールディングの特徴、およびコンパートメントなどの大きな核全体のスケールでの特徴を正確に定量化するための単一のプロトコルです。

この原稿の図は、Lafontaineらによって以前に発表されたものの別の複製実験から生成されました21。ハイスループットシーケンシングデータを取得した後、 オープンクロマチンコレクティブ (Open2C:https://github.com/open2c)を使用してHi-Cデータを処理しました。同様のパイプラインは、4D Nucleomeプロジェクト(https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline)のデータポータルにあります。簡単に言うと、Nextflowパイプライン蒸留器(https://github.com/open2c/distiller-nf)は、(1)Hi-C分子の配列をリファレンスゲノムにアラインメントし、(2).samアライメントを解析し、Hi-Cペアでファイルを形成し、(3)PCR重複をフィルタリングし、(4)ペアをHi-C相互作用のビン化マトリックスに集約するために実装されました。クーラーと呼ばれるこれらのHDF5フォーマットのマトリックスは、(1)HiGlassサーバーで表示し(https://higlass.io/)、(2)Open Chromatin Collective(https://github.com/open2c/cooltools)によって維持されている「cooltools」コレクションに存在するオープンソースの計算ツールの大規模なセットを使用して分析し、コンパートメント、TAD、ループなどの折り畳みの特徴を抽出および定量化できます。
Hi-C3.0ライブラリのいくつかの品質指標は、いくつかの簡単な指標/指標を使用して、リードペアをリファレンスゲノムにマッピングした直後に評価できます。まず、通常、配列決定されたリードペアの~50%をヒト細胞に対して一意にマッピングできます。染色体のポリマー性により、これらのマッピングされたリード(~60%-90%)のほとんどは染色体内の相互作用(シス)を表し、相互作用の頻度はゲノム距離の増加とともに急速に減衰します(距離依存性崩壊)。距離依存の減衰は、ゲノム距離の関数として接触確率(染色体アームごと)を示す「スケーリングプロット」で最もよく視覚化できます。異なる架橋剤と酵素を使用すると、長距離距離と短距離での距離依存的な崩壊が変化する可能性があることがわかりました17。DSG架橋の添加は、Mnaseなどの酵素や、より小さな断片を生成するDpnII-DdeIの組み合わせと組み合わせると、短距離での相互作用の検出可能性を高めます(図6A)。
距離依存の減衰は、2D相互作用行列から直接観察することもできます:中心対角線から離れると、相互作用はよりまれになります(図6B)。さらに、コンパートメント、TAD、ループなどのゲノムフォールディングの特徴は、Hi-Cマトリックスとスケーリングプロットから、一般的なゲノム全体の平均距離依存減衰からの偏差として識別できます。重要なことに、FAに加えてDSGによる架橋は、染色体のポリマー特性のために制限されないランダムライゲーションを減少させ、したがって染色体間(トランス)で発生する可能性が高くなります(図6C)。ランダムライゲーションを減らすと、特に染色体間および非常に長い範囲(>10〜50 Mb)の染色体内相互作用において、シグナル対ノイズ比が増加します。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> 図6:マッピングおよびフィルタリングされたHi-Cライブラリの代表的な結果 。 (A)さまざまな酵素の接触確率とその誘導体を、フラグメントの長さ(上)とFAまたはFA + DSGのいずれかで架橋(下)で並べたスケーリングプロット。MNAse(マイクロC)またはDpnII-DdeI(Hi-C 3.0)による消化は、DSGをFAに追加する場合(下)と同様に、短距離接触(上)を大幅に増加させます。(B)カラムは、FA架橋直後のDpnII消化とFA+DSG架橋後のDpnIIまたはDdeI消化のHi-Cヒートマップを示しています。白い矢印は、DSG架橋およびDdeI消化後の「ドット」の強度の増加を示しており、DNAループの検出が優れていることを意味します。行は、パネルCと整列して、解像度を上げた3番染色体のさまざまな部分を示しています:一番上の行:3番染色体全体(0-198,295,559 Mb);中段:186〜196メガバイト;下段:191.0-191.5 Mb。 (C) Aに描かれている地域のカバレッジグラフ。黒い矢印は、FAのみの架橋のカバレッジ(%cisリード)が低いことを示しています。略語:FA =ホルムアルデヒド;DSG =ジスクシンイミジルグルタル酸;CHR =染色体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
すべてのマップされた読み取りが役立つわけではありません。2番目の品質指標は、PCRの重複数です。正確な重複読み取りは、結紮および超音波処理後に偶然に発生する可能性は非常に低いです。したがって、このようなリードはPCR増幅に起因する可能性が高く、除外する必要があります。重複は、複雑度の低いライブラリを増幅するために必要なPCRサイクルが多すぎる場合によく発生します。一般に、Hi-Cの場合、ほとんどのライブラリは、滴定PCRによって決定されるように、5〜8サイクルの最終PCR増幅のみを必要とします(ステップ3.9; 図4)。ただし、14サイクルのPCR増幅後でも十分な複雑さのライブラリを取得できます。
重複リードの別のカテゴリ、いわゆる光学的重複は、パターン化されたフローセル(HiSeq4000など)を使用するIlluminaシーケンシングプラットフォームでの増幅プロセスから発生する可能性があります。光学的重複は、フローセルに過負荷がかかり、(大きな)クラスターが2つの別々のクラスターと呼ばれるようになるか、または最初のPCRラウンド後の元のペア末端分子の局所的な再クラスター化から見られます。どちらのタイプの光学重複も局所的であるため、フローセル上の位置によってPCR重複と識別および区別できます。PCR重複が>15%のライブラリは再生成が必要ですが、光学重複のあるライブラリはロードプロセスを最適化した後にリロードできます。
補足表S1:バッファーと溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0は、ホルムアルデヒドおよびジスクシンイミジルグルタル酸架橋剤をDpnIIおよびDdeI制限酵素のカクテルと組み合わせて、クロマチン相互作用検出のS/N比と分解能を高める改良されたHi-Cプロトコルです。

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

このプロトコルは、低バックグラウンドシグナルで複数の長さスケールにわたる染色体折り畳みの特徴を正確に検出します。例えば、プロモーターエンハンサー相互作用は、染色体コンパートメントの文脈で分析することができる。制限エンドヌクレアーゼの使用は、投入材料の消化レベルの最適化を回避します。ライゲーション産物を捕捉するためにゲル単離による選択は必要ありません。最も一般的な問題は、DSG固定後の細胞の喪失であり、高品質のライブラリを生成するのに十分なDNAを捕捉します。まず、5 x 10を含む150ミリメートルのプレートから6番目のセルまで真空トラップに結合されたパスツールピペットで培地を吸引します。10ミリリットルのHBSSで細胞を2回洗浄します。細胞を架橋するには、23.125ミリリットルの1%ホルムアルデヒド溶液を15センチメートルのプレートに注ぎます。室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手でプレートを静かに揺らします。次に、1.25ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、プレートを静かに回転させて架橋反応を消光してから、室温で5分間インキュベートします。氷上で15分間インキュベーションを続け、架橋を停止します。セルスクレーパーまたはゴム製の警官でプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液をピペット付きの50ミリリットルの円錐形チューブに移します。懸濁液を室温で1, 000倍Gで10分間遠心分離し、吸引により上清を廃棄する。ペレットを10ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄します。その後、DSG架橋に進む前に再度遠心分離する。DSGとの架橋のために、ペレット化された細胞を9.9ミリリットルのDPBSに再懸濁します。次に、100マイクロリットルの300ミリモルDSGを追加します。チューブを反転させて混合し、ローテーター上で室温で40分間細胞を架橋します。架橋後、1.925ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、転倒させて混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞を2, 000倍Gで15分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの0.05%ウシ血清アルブミンDPBSに再懸濁してから、1.7ミリリットルのチューブに移します。細胞を摂氏4度で15分間2, 000倍Gで遠心分離し、上清を廃棄します。ペレットを液体窒素でスナップ凍結してから、染色体確認キャプチャに進みます。架橋細胞アリコートを10マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1ミリリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、Dounceホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。乳棒Aをゆっくりと上下に30回動かして細胞を均質化し、1分間インキュベートして細胞を冷ましてからさらに30ストロークします。最後のストロークの後、ライセートを1.7ミリリットルのチューブに移します。溶解した懸濁液を2, 500倍Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、フリックまたはボルテックスして湿ったペレットを再懸濁します。できるだけ多くの上清を取り除き、塊を最小限に抑えたヨーグルト様物質を得る。遠心分離前に、ペレットを500マイクロリットルの氷冷制限バッファーに再懸濁します。2回目の洗浄後、セルサイズに応じてペレットのキャリーオーバー量に約340マイクロリットルを加えた後、ピペッティングによりペレットを360マイクロリットルの制限バッファーに再懸濁します。クロマチンの完全性をテストするために18マイクロリットルのライセートを確保するか、残りのライセート CI.To、38マイクロリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウムをhi-Cチューブに加えて総容量380マイクロリットルを作り、気泡を導入せずにピペッティングで慎重に混合します。サンプルを摂氏65度で10分間振とうせずにインキュベートし、クロマチンを開きます。次に、すぐにチューブを氷の上に置きます。Triton X-100で消化混合物を調製した後、この混合物を107マイクロリットルをhi-Cチューブに加えて総容量487マイクロリットルを作り、インターバル振とうしながらサーモミキサーで摂氏37度でクロマチンを一晩消化します。翌日、サンプルを摂氏65度に20分間移し、残りのエンドヌクレアーゼ活性を失活させます。サンプルを氷上に置いた後、10マイクロリットルの消化制御(DC)を取っておき、摂氏4度で保管します。ピペットまたは回転させて蓋から結露を取り除きます。次に、58マイクロリットルのビオチンフィルインミックスを加えて、総容量を535マイクロリットルにします。泡を形成せずに穏やかにピペットしてから、サーモミキサーで摂氏23度で4時間インキュベートします。インキュベーション後、665マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、サンプル量を1, 200マイクロリットルにします。ピペッティングでサンプルを混合し、サーモミキサーで摂氏16度で4時間インキュベートします。次に、2つの画分で50マイクロリットルのプロテイナーゼ-Kをhi-Cサンプルチューブに加え、インターバル振とうしながら摂氏65度で一晩インキュベートします。DNA 精製のために、 100% 氷冷エタノールを加え、摂氏 4 度で 30 分間 18 、 000 倍の G でチューブを遠心分離します。非ペレット側から上清を完全に除去し、サンプルを10分間、またはペレットが目に見えて乾くまで風乾します。ペレットが乾いたら、ピペッティングまたは旋回によって450マイクロリットルのTris低EDTAに可溶化します。可溶化した懸濁液を、分子量3キロダルトンのカットオフで0.5ミリメートル遠心フィルターユニット(CFU)に移します。CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄後、80マイクロリットルのTris低EDTAをカラムに加えます。カラムを新しい収集チューブに変えて、最高速度で2分間遠心分離します。最後に、サンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。PCR滴定結果を含むアガロースゲルは、ほとんどのライブラリが5〜8サイクルの最終PCR増幅を必要とすることを示しました。最終的な増幅PCRライブラリの細胞消化は、アガロースゲル上の小さなフラグメントによって観察され、適切なライゲーションジャンクションの存在を確認し、シーケンシング前の品質チェックとして機能します。シーケンシング後、マッピングされたデータは、DpnIIとDdeIの組み合わせが、従来のホルムアルデヒド架橋にDSGを追加するにつれて、短距離接触を有意に増加させることを示しました。改善された信号は、2D相互作用行列から直接長距離および短距離で観測することもできます。コンパートメント信号は長距離ではCRISPRであり、クロマチンループによって形成されるドットは短距離でより顕著です。ホルムアルデヒドに加えて、DSGとの架橋はランダムライゲーションを減少させ、シスの相対被覆率を改善します。架橋中および架橋後に細胞を失わないことが重要です。細胞ペレットは緩んでいたり見えなくなったりすることがあり、細胞は一部のバッファーのピペットチップに付着する可能性があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

迅速な放射線 Biodosimetry を自動化された減数分裂の染色体の識別 (ADCI) と線量評価

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...