Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Vi vil takke Denis Lafontaine for protokollutvikling og Sergey Venev for bioinformatisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program til JD (U54-DK107980, UM1-HG011536). JD er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute.
Denne artikkelen er underlagt HHMIs retningslinjer for åpen tilgang til publikasjoner. HHMI lab heads har tidligere gitt en ikke-eksklusiv CC BY 4.0 lisens til publikum og en underlisensierbar lisens til HHMI i sine forskningsartikler. I henhold til disse lisensene kan det forfatteraksepterte manuskriptet til denne artikkelen gjøres fritt tilgjengelig under en CC BY 4.0-lisens umiddelbart etter publisering.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Kritiske trinn for cellehåndtering Selv om det er mulig å bruke et lavere antall inngangsceller, har denne protokollen blitt optimalisert for ~ 5 × 106 celler per sekvenseringsfelt (~ 400 M leser) for å sikre riktig kompleksitet etter dyp sekvensering. Celler telles best før fiksering. For generering av ultradeep-biblioteker multipliserer vi vanligvis antall baner (og celler) til ønsket lesedybde er nådd. For optimal fiksering bør serumholdig medium erstattes med PBS før FA-fiksering, og fikseringsløsninger bør tilsettes umiddelbart og uten konsentrasjonsgradienter 15,22. For cellehøsting foretrekkes skraping fremfor trypsinisering, fordi overgangen fra en flatere til en sfærisk form etter trypsinisering kan påvirke atomkonformasjonen. Etter tilsetning av DSG blir løse og klumpete cellepellets lett tapt. Vær forsiktig når du håndterer celler på dette stadiet og legg opp til 0,05% BSA for å redusere klumping.
Endringer i metoden Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av menneskelige celler17. Likevel, basert på erfaring med kromosomkonformasjonsfangst, bør denne protokollen fungere for de fleste eukaryote celler. For en betydelig lavere inngang (~ 1 × 106 celler), anbefaler vi at du bruker halvparten av volumene for lysis- og konformasjonsfangstprosedyrene [trinn 2.1-2.4]. Dette vil også tillate DNA-isolering [trinn 2.5] å bli utført i en bordplate sentrifuge med 1,7 ml rør, noe som kan forbedre pelletering for lave DNA-konsentrasjoner. Kvantifiseringen av DNA (trinn 2.6.6) vil indikere hvordan man går frem. For lave mengder isolert DNA (1-5 μg) foreslår vi å hoppe over størrelsesvalget (trinn 3.3) og fortsette med biotinfjerning etter å ha redusert volumet fra 130 μL til ~ 45 μL med CFU.
Denne protokollen ble utviklet spesielt for å sikre data av høy kvalitet etter påfølgende kryssbinding med FA og DSG og fordøyelse med DpnII og DdeI. Imidlertid kan alternative tverrbindingsstrategier som FA etterfulgt av EGS (etylenglykol bis (succinimidyl succinate)), som også brukes i ChIP-seq23 og ChIA-PET24, fungere like bra17. På samme måte kan forskjellige enzymkombinasjoner, som DpnII og HinfI18 eller MboI, MseI og NlaIII19 brukes til fordøyelse. Når du tilpasser enzymkombinasjoner, må du huske å bruke biotinylerte nukleotider som kan fylle ut de spesifikke 5 'overhengene og bruke de mest optimale bufferne for hver cocktail. DpnII kommer med sin egen buffer, og enzymprodusenten anbefaler en spesifikk buffer for DdeI-fordøyelsen. Likevel, for dobbeltfordøyelsen med DpnII og DdeI i denne protokollen, anbefales restriksjonsbuffer fordi den er vurdert til 100% aktivitet for begge enzymer.
Feilsøking av konformasjonsregistrering De tre nøkkeltrinnene i kromosomkonformasjonsfangst: tverrbinding, fordøyelse og religasjon har alle blitt utført før resultatene kan visualiseres på gel. For å bestemme kvaliteten på hvert av disse tre trinnene og skjelne hvor problemer kunne ha oppstått, blir aliquots før (CI) og etter fordøyelsen (DC) tatt og lastet på gelen sammen med den ligerte Hi-C-prøven (figur 2). Denne gelen brukes til å bestemme kvaliteten på Hi-C-prøven og om det vil være verdt å fortsette protokollen. Uten CI og DC er det vanskelig å finne potensielle suboptimale trinn. Det er verdt å merke seg at suboptimal ligering kan skyldes et problem i selve ligeringen, utfyllingen eller et problem med tverrbinding. For å feilsøke kryssbinding, må du ikke bruke mer enn 1 × 107 celler per bibliotek og starte med ferske tverrbindingsreagenser og rene celler (dvs. skyllet med PBS). For ligering, sørg for at celler og ligeringsblanding holdes på is. Tilsett T4 DNA-ligase rett før 4-timers inkubasjon ved 16 °C og bland godt.
Feilsøking av bibliotekforberedelse Hvis det er behov for mer enn 10 PCR-sykluser eller ikke noe PCR-produkt kan ses på gel etter PCR-titrering (figur 4), er det noen alternativer for å lagre Hi-C-prøven. Når du arbeider tilbake fra PCR-titreringen, er det første alternativet å prøve PCR igjen. Hvis det fortsatt ikke er nok produkt, er det mulig å prøve en ny runde med A-tailing og adapterligering (trinn 3.6) etter å ha vasket perlene to ganger med 1x TLE-buffer. Etter denne ekstra A-tailing og adapter ligering, kan man fortsette til PCR-titrering som før. Hvis det fortsatt ikke er noe produkt, er det siste alternativet å resonikere 0,8x-fraksjonen fra trinn 3.3 og fortsette derfra.
Begrensninger og fordeler med Hi-C3.0 Det er viktig å innse at Hi-C er en populasjonsbasert metode som fanger den gjennomsnittlige frekvensen av interaksjoner mellom par av loci i cellepopulasjonen. Noen beregningsanalyser er utformet for å skille kombinasjoner av konformasjoner fra en populasjon25, men i prinsippet er Hi-C blind for forskjeller mellom celler. Selv om det er mulig å utføre encellet Hi-C26,27 og beregningsmessige slutninger kan gjøres28, er encellet Hi-C ikke egnet for å oppnå ultrahøyoppløselig 3C-informasjon. En ekstra begrensning av Hi-C er at den bare oppdager parvise interaksjoner. For å oppdage multikontaktinteraksjoner kan man enten bruke hyppige kuttere kombinert med kortlesingssekvensering (Illumina)16 eller utføre multikontakt3C 29 eller 4C30, ved hjelp av langlest sekvensering fra PacBio eller Oxford Nanopore-plattformer. Hi-C-derivater for spesifikt å oppdage kontakter mellom og langs søsterkromatider er også utviklet31,32.
Selv om Hi-C19 og Micro-C33 kan brukes til å generere kontaktkart ved subkilobaseoppløsninger, krever begge en stor mengde sekvenseringsavlesninger, og dette kan bli et kostbart foretak. For å komme til lignende eller enda høyere oppløsning uten kostnadene, kan anrikning for spesifikke genomiske regioner (fangst-C34) eller spesifikke proteininteraksjoner (ChiA-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) brukes. Styrken og ulempen med disse anrikningsapplikasjonene er at bare et begrenset antall interaksjoner blir samplet. Med slike berikelser går det globale aspektet av Hi-C (og muligheten for global normalisering) tapt.
Viktighet og potensielle anvendelser av Hi-C3.0 Denne protokollen ble designet for å muliggjøre ultradyp 3C med høy oppløsning samtidig som den oppdager store foldefunksjoner som TADs og rom17 (figur 6). Denne protokollen starter med 5 × 106 celler per rør for hvert Hi-C-bibliotek, som skal være mer enn nok materiale til å sekvensere en eller to baner på en strømningscelle for å oppnå opptil 1 milliard parede avlesninger. For ultradeep sekvensering bør flere rør på 5 × 106 celler klargjøres, avhengig av antall kartlagte avlesninger og PCR-duplikater. Ved høyeste oppløsning (<1 kb) er looping-interaksjoner for det meste funnet mellom CTCF-steder, men promotorforsterkerinteraksjoner kan også oppdages. Leserne kan henvise til Akgol Oksuz et al.17 for en detaljert beskrivelse av dataanalysen.

Kromosomkonformasjonsfangst har blitt brukt siden 20021. I utgangspunktet er hver konformasjonsfangstvariant avhengig av fiksering av DNA-protein og protein-protein-interaksjoner for å bevare 3D-kromatinorganisasjon. Dette etterfølges av DNA-fragmentering, vanligvis ved restriksjonsfordøyelse, og til slutt slutter religering av nærliggende DNA for å konvertere romlig proksimale loci til unike kovalente DNA-sekvenser. Innledende 3C-protokoller brukte PCR for å prøve spesifikke "en-til-en" interaksjoner. Påfølgende 4C-analyser tillot påvisning av "en-til-alle" interaksjoner2, mens 5C oppdaget "mange-til-mange" interaksjoner3. Kromosomkonformasjonsfangst kom til full utførelse etter implementering av neste generasjon, høy gjennomstrømningssekvensering (NGS), som tillot påvisning av "alle-til-alle" genomiske interaksjoner ved bruk av genom-bred Hi-C4 og sammenlignbare teknikker som 3C-seq5, TCC6 og Micro-C 7,8 (se også gjennomgang av Denker og De Laat9).
I Hi-C brukes biotinylerte nukleotider for å markere 5 'overheng etter fordøyelsen og før ligering (figur 1). Dette gjør det mulig å velge riktig fordøyde og religerte fragmenter ved bruk av streptavidinbelagte perler, og skille den fra GCC10. En viktig oppdatering av Hi-C-protokollen ble implementert av Rao et al.11, som utførte fordøyelsen og religasjonen i intakte kjerner (dvs. in situ) for å redusere falske ligeringsprodukter. Videre reduserte erstatning av HindIII-fordøyelse med MboI (eller DpnII) fordøyelse fragmentstørrelsen og økte oppløsningspotensialet til Hi-C. Denne økningen tillot påvisning av relativt småskala strukturer og en mer presis genomisk lokalisering av kontaktpunkter, for eksempel DNA-løkker mellom små cis-elementer, for eksempel løkker mellom CTCF-bundne steder generert av sløyfeekstrudering11,12. Dette potensialet kommer imidlertid til en pris. For det første krever en todobling av oppløsningen en firedobling (22) økning i sekvensering av13. For det andre øker de små fragmentstørrelsene muligheten for å forveksle ufordøyd nabofragment med fordøyde og religerte fragmenter14. Som nevnt, i Hi-C, er fordøyde og religerte fragmenter forskjellig fra ufordøyd fragmenter ved tilstedeværelse av biotin ved ligeringskrysset. Imidlertid er det nødvendig med riktig biotinfjerning fra uligerte ender for å sikre at bare ligeringskryss trekkes ned14,15.
Med den reduserte kostnaden for NGS blir det mulig å studere kromosomfolding i større detalj. For å redusere størrelsen på DNA-fragmenter, og dermed øke oppløsningen, kan Hi-C-protokollen tilpasses for å bruke oftere kutte restriksjonsenzymer16 eller å bruke kombinasjoner av restriksjonsenzymer17,18,19. Alternativt kan MNase 7,8 i Micro-C og DNase i DNase Hi-C20 titreres for å oppnå optimal fordøyelse.
En nylig systematisk evaluering av det grunnleggende ved 3C-metoder viste at deteksjonen av kromosomfoldingsfunksjoner ved hver lengdeskala forbedret seg kraftig med sekvensiell tverrbinding med 1% FA etterfulgt av 3 mM DSG17. Videre var Hi-C med HindIII-fordøyelse det beste alternativet for å oppdage store foldefunksjoner, for eksempel rom, og at Micro-C var overlegen til å oppdage småskala foldefunksjoner som DNA-løkker. Disse resultatene førte til utviklingen av en enkelt, høyoppløselig "Hi-C 3.0" -strategi, som bruker kombinasjonen av FA- og DSG-tverrbindinger etterfulgt av dobbel fordøyelse med DpnII og DdeI-endonukleaser21. Hi-C 3.0 gir en effektiv strategi for generell bruk fordi den nøyaktig oppdager foldefunksjoner på tvers av alle lengdeskalaer17. Den eksperimentelle delen av Hi-C 3.0-protokollen er detaljert her, og typiske resultater som kan forventes etter sekvensering vises.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figur 1: Hi-C-prosedyre i seks trinn. Celler fikses først med FA, og deretter DSG (1). Deretter går lysis foran en dobbel fordøyelse med DdeI og DpnII (2). Biotin tilsettes ved overhengsutfylling og proksimale stumpe ender ligeres (3) før DNA-rensing (4). Biotin fjernes fra unligated ender før sonikering og størrelsesvalg (5). Til slutt tillater nedtrekk av biotin adapterligering og bibliotekforsterkning ved PCR (6). Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

Kromosomkonformasjonsfangst (3C) brukes til å oppdage tredimensjonale kromatininteraksjoner. Vanligvis brukes kjemisk tverrbinding med formaldehyd (FA) for å fikse kromatininteraksjoner. Deretter konverterer kromatinfordøyelse med et restriksjonsenzym og påfølgende religering av fragmentender tredimensjonal (3D) nærhet til unike ligeringsprodukter. Til slutt, etter reversering av tverrbindinger, proteinfjerning og DNA-isolasjon, blir DNA kuttet og forberedt på sekvensering med høy gjennomstrømning. Frekvensen av nærhetsligering av par av loci er et mål på frekvensen av deres colocalization i tredimensjonalt rom i en cellepopulasjon.
Et sekvensert Hi-C-bibliotek gir genomomfattende informasjon om interaksjonsfrekvenser mellom alle par loci. Oppløsningen og presisjonen til Hi-C er avhengig av effektiv tverrbinding som opprettholder kromatinkontakter og hyppig og jevn fragmentering av kromatinet. Dette papiret beskriver en forbedret in situ Hi-C-protokoll, Hi-C 3.0, som øker effektiviteten av tverrbinding ved å kombinere to tverrbindinger (formaldehyd [FA] og disuccinimidylglutarat [DSG]), etterfulgt av finere fordøyelse ved bruk av to restriksjonsenzymer (DpnII og DdeI). Hi-C 3.0 er en enkelt protokoll for nøyaktig kvantifisering av genomfoldingsfunksjoner på mindre skalaer som løkker og topologisk assosierende domener (TADs), samt funksjoner på større kjerne-brede skalaer som rom.

Figurene i dette manuskriptet ble generert fra et eget, replikerende eksperiment av det som tidligere ble publisert av Lafontaine et al.21. Etter å ha oppnådd sekvenseringsdata med høy gjennomstrømning, ble Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) brukt til å behandle Hi-C-dataene. En lignende rørledning finnes på dataportalen til 4D Nucleome-prosjektet (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kort fortalt ble Nextflow-rørledningsdestillatøren (https://github.com/open2c/distiller-nf) implementert for å (1) justere sekvensene av Hi-C-molekyler til referansegenomet, (2) analysere .sam-justering og formfiler med Hi-C-par, (3) filtrere PCR-duplikater og (4) aggregerte par i binned matriser av Hi-C-interaksjoner. Disse HDF5-formaterte matrisene, kalt kjølere, kan deretter (1) vises på en HiGlass-server (https://higlass.io/) og (2) analyseres ved hjelp av et stort sett med åpen kildekode-beregningsverktøy som finnes i "cooltools" -samlingen som vedlikeholdes av Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) for å trekke ut og kvantifisere foldefunksjoner som rom, TADs og looper.
Noen kvalitetsindikatorer for Hi-C3.0-bibliotekene kan vurderes umiddelbart etter kartlegging av lesepar til et referansegenom, ved hjelp av noen få enkle beregninger / indikatorer. For det første kan vanligvis ~ 50% av sekvenserte lesepar være unikt kartlagt for menneskelige celler. På grunn av kromosomenes polymere natur representerer de fleste av disse kartlagte lesningene (~ 60% -90%) interaksjoner i et kromosom (cis), med interaksjonsfrekvenser som raskt forfaller med økende genomisk avstand (avstandsavhengig forfall). Det avstandsavhengige forfallet kan visualiseres best i et "skaleringsplott", som viser kontaktsannsynligheten (per kromosomarm) som en funksjon av genomisk avstand. Vi fant at bruk av forskjellige tverrbindinger og enzymer kan endre avstandsavhengig forfall på lange og korte avstander17. Tilsetningen av DSG-tverrbinding øker detekterbarheten av interaksjoner på korte avstander når det kombineres med enzymer som Mnase og kombinasjoner av DpnII-DdeI som produserer mindre fragmenter (figur 6A).
Avstandsavhengig henfall kan også observeres direkte fra 2D-interaksjonsmatriser: interaksjoner blir sjeldnere når de ligger lenger unna den sentrale diagonalen (figur 6B). I tillegg kan genomiske foldefunksjoner, som rom, TADs og løkker, identifiseres fra Hi-C-matriser og skaleringsplott som avvik fra det generelle genomomfattende gjennomsnittlige avstandsavhengige forfallet. Det er viktig at tverrbinding med DSG i tillegg til FA reduserer tilfeldige ligeringer, som er ubegrenset på grunn av kromosomenes polymernatur og derfor mer sannsynlig å forekomme mellom kromosomer (i trans) (figur 6C). Reduksjon av tilfeldig ligering fører til økte signal-til-støy-forhold, spesielt for interkromosomale og svært langdistanse (>10-50 Mb) intrakromosomale interaksjoner.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figur 6: Representative resultater av kartlagte og filtrerte Hi-C-biblioteker. (A) Skaleringsplott med kontaktsannsynlighet og dens derivat for forskjellige enzymer, sortert etter fragmentlengde (øverst) og tverrbinding med enten FA eller FA + DSG (nederst). Fordøyelse med MNAse (microC) eller DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) øker kortdistansekontaktene betydelig (øverst) og legger DSG til FA (nederst). (B) Kolonner viser Hi-C varmekart over DpnII fordøyelse etter bare FA tverrbinding og DpnII eller DdeI fordøyelse etter FA + DSG tverrbinding. Hvite piler viser økende styrke av "prikker" etter DSG-tverrbinding og DdeI-fordøyelse, noe som innebærer bedre påvisning av DNA-løkker. Rader viser forskjellige deler av kromosom 3 ved økende oppløsning, på linje med panel C: øverste rad: hele kromosom 3 (0-198,295,559 Mb); midterste rad: 186-196 Mb; nederste rad: 191,0-191,5 Mb. (C) Dekningsgrafer for regionene som er avbildet i A. Svarte piler viser lavere dekning (% cis leser) for FA-bare tverrbinding. Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; chr = kromosom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Ikke alle kartlagte lesninger er nyttige. En annen kvalitetsindikator er antall PCR-duplikater. Eksakte dupliserte avlesninger er svært lite sannsynlig å oppstå ved en tilfeldighet etter ligering og sonikering. Dermed er slike avlesninger sannsynligvis et resultat av PCR-forsterkning og må filtreres ut. Duplikater oppstår ofte når det kreves for mange PCR-sykluser for å forsterke biblioteker med lav kompleksitet. Generelt, for Hi-C, trenger de fleste biblioteker bare 5-8 sykluser med endelig PCR-forsterkning, som bestemt av titrerings-PCR (se trinn 3.9; Figur 4). Imidlertid kan biblioteker med tilstrekkelig kompleksitet oppnås selv etter 14 sykluser med PCR-forsterkning.
En annen kategori av dupliserte avlesninger, såkalte optiske duplikater, kan oppstå fra forsterkningsprosessen på Illumina-sekvenseringsplattformer som bruker mønstrede strømningsceller (for eksempel HiSeq4000). Optiske duplikater er funnet fra enten overbelastning av strømningscellen, noe som fører til at (store) klynger kalles to separate klynger, eller fra lokal reclustering av det opprinnelige parede endemolekylet etter en første runde med PCR. Fordi begge typer optiske duplikater er lokale, kan de identifiseres og skilles fra PCR-duplikater ved deres plassering på flytcellen. Mens biblioteker med >15% PCR-duplikater trenger regenerering, kan biblioteker med optiske duplikater lastes på nytt etter optimalisering av lasteprosessen.
Tilleggstabell S1: Buffere og løsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 er en forbedret Hi-C-protokoll som kombinerer formaldehyd og disuccinimidylglutaratkryssbindinger med en cocktail av DpnII- og DdeI-restriksjonsenzymer for å øke signal-til-støy-forholdet og oppløsningen av kromatininteraksjonsdeteksjon.

Fange kromosomkonformasjon på tvers av lengdeskalaer

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Denne protokollen oppdager nøyaktig kromosomfoldingsfunksjoner over flere lengdeskalaer med lavt bakgrunnssignal. For eksempel kan promotorforsterkerinteraksjoner analyseres i sammenheng med kromosomrom. Bruken av restriksjonsendonukleaser omgår optimalisering av fordøyelsesnivået av inngangsmateriale.Ingen valg ved gelisolasjon er nødvendig for å fange ligeringsprodukter. Det vanligste problemet er tap av celler etter DSG-fiksering og fangst av nok DNA til å produsere biblioteker av høy kvalitet. Til å begynne med, aspirer mediet med en Pasteur-pipette koblet til en vakuumfelle fra 150 millimeterplaten som inneholder 5 til 10 til de sjette cellene.Vask cellene to ganger med 10 milliliter HBSS. For å krysskoble cellene, hell 23.125 milliliter av 1% formaldehydoppløsningen i 15-centimeterplaten. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter, vugg forsiktig platen for hånd hvert annet minutt.Deretter tilsettes 1, 25 ml 2, 5 molar glycin og virvler forsiktig platen for å slukke tverrbindingsreaksjonen, før den inkuberes ved romtemperatur i fem minutter. Fortsett inkubasjonen på is i 15 minutter for å stoppe tverrbindingen. Skrap cellene fra platen med en celleskrape eller gummipolitimann og overfør cellesuspensjonen til et 50 milliliter konisk rør med en pipette.Sentrifuger suspensjonen ved 1.000 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten ved aspirasjon. Vask pelleten en gang med 10 milliliter Dulbeccos fosfatbufrede saltvann, eller DPBS. Sentrifuger deretter igjen før du fortsetter til DSG-kryssbinding.For kryssbinding med DSG, resuspend de pelleterte cellene i 9,9 milliliter DPBS. Deretter legger du til 100 mikroliter 300 millimolar DSG. Bland røret ved inversjon og krysskoble cellene ved romtemperatur i 40 minutter på en rotator.Etter kryssbinding, tilsett 1, 925 ml 2, 5 molar glycin, inverter for å blande og inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Deretter sentrifugerer cellene ved 2.000 ganger G i 15 minutter og resuspenderer pelleten i en milliliter 0,05% bovint serumalbumin DPBS før den overføres til et 1,7 milliliter rør. Sentrifuger cellene ved 2.000 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten.Snap-frys pelleten i flytende nitrogen før du går videre til kromosombekreftelsesfangsten. Resuspend den tverrbundne cellen aliquot i en milliliter iskald lysisbuffer som inneholder 10 mikroliter proteasehemmercocktail og overfør til en Dounce homogenisator i 15 minutter med inkubasjon på is. Beveg deg sakte opp og ned 30 ganger for å homogenisere cellene og inkubere i ett minutt for å la cellene kjøle seg ned før ytterligere 30 slag.Etter det siste slaget, overfør lysatet til et 1, 7 milliliter rør. Sentrifuger den lysede fjæringen ved 2.500 ganger G i fem minutter. Kast supernatanten og flikk eller virvel for å resuspendere den våte pelleten.Fjern så mye av supernatanten som mulig for å få et yoghurtlignende stoff med minimale klumper. Resuspend pelleten i 500 mikroliter iskald restriksjonsbuffer før sentrifugering. Etter den andre vasken, resuspend pelleten i 360 mikroliter restriksjonsbuffer ved pipettering etter tilsetning av ca. 340 mikroliter til overføringsvolumet av pelleten, avhengig av cellestørrelsen.Sett av 18 mikroliter lysat for å teste kromatinintegriteten, eller CI.To det gjenværende lysatet, tilsett 38 mikroliter 1% natriumdodecylsulfat til hi-C-rør for å lage et totalt volum på 380 mikroliter og bland forsiktig ved pipettering uten å introdusere bobler. Inkuber prøvene ved 65 grader Celsius uten å riste i 10 minutter for å åpne kromatinet. Legg deretter røret umiddelbart på is.Etter å ha forberedt fordøyelsesblandingen med Triton X-100, tilsett 107 mikroliter av denne blandingen til hi-C-røret for å lage et totalt volum på 487 mikroliter og fordøye kromatinet over natten ved 37 grader Celsius i en termomikser med intervallristing. Neste dag, overfør prøvene til 65 grader Celsius i 20 minutter for å deaktivere den gjenværende endonukleaseaktiviteten. Etter å ha plassert prøven på is, sett av 10 mikroliter fordøyelseskontroll, eller DC, og lagre dem ved fire grader Celsius.Fjern kondensen fra lokket med en pipette eller ved å spinne. Deretter tilsettes 58 mikroliter biotinutfyllingsblanding for å lage et totalt volum på 535 mikroliter. Pipetten forsiktig uten å danne bobler før den inkuberes ved 23 grader Celsius i fire timer i en termomikser.Etter inkubering, tilsett 665 mikroliter ligeringsblanding, noe som gjør prøvevolumet 1.200 mikroliter. Bland prøven ved pipettering og inkuber ved 16 grader Celsius i fire timer i en termomixer. Deretter tilsettes 50 mikroliter proteinase-K i to fraksjoner til hi-C-prøverøret og inkuberer over natten ved 65 grader Celsius med intervallristing.For DNA-rensing, tilsett 100% iskald etanol og sentrifuger rørene ved 18.000 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten helt fra ikke-pelletssiden og lufttørk prøven i 10 minutter eller til pellets er synlig tørre. Når pellets er tørre, oppløs dem i 450 mikroliter Tris lav-EDTA ved pipettering eller virvling.Overfør den oppløselige suspensjonen til 0,5 millimeter sentrifugalfilterenhet, eller CFU, med en avskjæring på tre kilodalton molekylvekt. Sentrifuger CFU med maksimal hastighet i 10 minutter og kast gjennomstrømningen. Etter den andre vasken, tilsett 80 mikroliter Tris lav-EDTA til kolonnen.Gjør kolonnen om til et nytt oppsamlingsrør for to minutters sentrifugering med maksimal hastighet. Til slutt legger du prøvene på en 0,8% agarosegel. Agarosegel med PCR-titreringsresultater viste at de fleste biblioteker krever fem til åtte sykluser med endelig PCR-forsterkning.Cellefordøyelse av det endelige forsterkede PCR-biblioteket, som observert av mindre fragmenter på en agarosegel, bekrefter tilstedeværelsen av riktige ligeringskryss og fungerer som en kvalitetskontroll før sekvensering. Etter sekvensering viste de kartlagte dataene at kombinasjonen av DpnII og DdeI øker kortdistansekontaktene betydelig, som å legge DSG til den konvensjonelle formaldehydkryssbindingen. Et forbedret signal kan også observeres på lange og korte avstander direkte fra 2D-interaksjonsmatriser.Romsignaler er CRISPR på lange avstander, og prikker dannet av kromatinsløyfer er mer fremtredende på korte avstander. I tillegg til formaldehyd, reduserer kryssbinding med DSG tilfeldige ligeringer, noe som forbedrer den relative dekningen i cis. Det er viktig å ikke miste celler under og etter tverrbinding.Cellepellets kan være løse eller usynlige, og celler kan feste seg til pipettespisser i noen av bufferne.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide-avledet Metode for å transportere gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Rask stråling Biodosimetry automatisert for Dicentric kromosom identifikasjon (ADCI) og Dose estimering

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

En ikke-tilfeldig Mouse modell for farmakologisk reaktivering av Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Fremstilling av meiotiske kromosomspreader fra sebrafisk spermatocytter

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikasjon av enhancer-promoter kontakter i embryoid organer av kvantitative kromosom conformation capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...