Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Denis Lafontaine pelo desenvolvimento do protocolo e a Sergey Venev pela assistência em Bioinformática. Este trabalho foi apoiado por uma doação do National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program para J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. é investigador do Howard Hughes Medical Institute.
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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Etapas críticas para o manuseio de células Embora seja possível usar um número menor de células de entrada, este protocolo foi otimizado para ~ 5 × 106 células por pista de sequenciamento (~ 400 M lê) para garantir a complexidade adequada após o sequenciamento profundo. As células são melhor contadas antes da fixação. Para a geração de bibliotecas ultraprofundas, geralmente multiplicamos o número de pistas (e células) até que a profundidade de leitura desejada seja atingida. Para uma fixação ideal, o meio contendo soro deve ser substituído por PBS antes da fixação da AF, e soluções fixadoras devem ser adicionadas imediatamente e sem gradientes de concentração 15,22. Para a colheita celular, a raspagem é preferida à tripsinização, porque a transição de uma forma mais plana para uma forma esférica após a tripsinização pode afetar a conformação nuclear. Após a adição de DSG, pellets de células soltas e aglomeradas são facilmente perdidos. Tenha cuidado ao manusear as células nesta fase e adicione até 0,05% de BSA para diminuir a aglomeração.
Modificações no método Esse protocolo foi desenvolvido utilizando células humanas17. No entanto, com base na experiência com a captura de conformação cromossômica, esse protocolo deve funcionar para a maioria das células eucarióticas. Para uma entrada significativamente menor (~1 × 106 células), aconselhamos o uso de metade dos volumes para os procedimentos de lise e captura de conformação [etapas 2.1-2.4]. Isso também permitiria que o isolamento do DNA [etapa 2.5] fosse realizado em uma centrífuga de mesa com tubos de 1,7 mL, o que poderia melhorar a peletização para baixas concentrações de DNA. A quantificação do ADN (passo 2.6.6) indicará como proceder. Para baixas quantidades de DNA isolado (1-5 μg), sugerimos pular a seleção de tamanho (etapa 3.3) e prosseguir com a remoção de biotina após reduzir o volume de 130 μL para ~45 μL com uma UFC.
Este protocolo foi desenvolvido especificamente para garantir dados de alta qualidade após subsequente reticulação com AF e DSG e digestão com DpnII e DdeI. No entanto, estratégias alternativas de reticulação, como a AF seguida de EGS (bis(succinimidil succinato)), que também é usada em ChIP-seq23 e ChIA-PET24, podem funcionar igualmente bem17. Da mesma forma, diferentes combinações enzimáticas, como DpnII e HinfI18 ou MboI, MseI e NlaIII19 podem ser usadas para digestão. Ao adaptar combinações enzimáticas, certifique-se de usar nucleotídeos biotinilados que possam preencher as saliências específicas de 5 'e usar os tampões mais ideais para cada coquetel. DpnII vem com seu próprio tampão e o fabricante da enzima recomenda um tampão específico para a digestão DdeI. No entanto, para a dupla digestão com DpnII e DdeI neste protocolo, o tampão de restrição é recomendado porque é avaliado em 100% de atividade para ambas as enzimas.
Solução de problemas de captura de conformação As três etapas principais na captura da conformação cromossômica: reticulação, digestão e religação foram realizadas antes que os resultados possam ser visualizados em gel. Para determinar a qualidade de cada uma dessas três etapas e discernir onde os problemas poderiam ter surgido, as alíquotas antes (IC) e após a digestão (DC) são tomadas e carregadas no gel junto com a amostra de Hi-C ligada (Figura 2). Este gel é usado para determinar a qualidade da amostra Hi-C e se valerá a pena continuar o protocolo. Sem o IC e a DO, é difícil identificar possíveis passos subótimos. Vale a pena notar que a ligadura subótima pode ser devido a um problema na própria ligadura, no preenchimento ou em um problema com a reticulação. Para solucionar problemas de reticulação, certifique-se de não usar mais de 1 × 107 células por biblioteca e comece com novos reagentes de reticulação e células limpas (ou seja, enxaguadas com PBS). Para ligadura, certifique-se de que as células e a mistura de ligadura sejam mantidas no gelo. Adicionar T4 DNA ligase imediatamente antes da incubação de 4 h a 16 °C e misturar bem.
Solução de problemas de preparação da biblioteca Se forem necessários mais de 10 ciclos de PCR ou nenhum produto de PCR puder ser visto em gel após a titulação por PCR (Figura 4), há algumas opções para salvar a amostra Hi-C. Trabalhando de volta a partir da titulação de PCR, a primeira opção é tentar a PCR novamente. Se ainda não houver produto suficiente, é possível tentar outra rodada de retailing A e ligadura do adaptador (etapa 3.6) depois de lavar as contas duas vezes com 1x buffer TLE. Após esta ligadura adicional de cauda A e adaptador, pode-se proceder à titulação por PCR como antes. Se ainda não houver produto, a última opção é resonicar a fração 0,8x da etapa 3.3 e prosseguir a partir daí.
Limitações e vantagens do Hi-C3.0 É importante perceber que o Hi-C é um método de base populacional que captura a frequência média de interações entre pares de loci na população celular. Algumas análises computacionais são projetadas para desembaraçar combinações de conformações de uma população25, mas, em princípio, o Hi-C é cego para as diferenças entre as células. Embora seja possível realizar Hi-C 26,27 de célula única e inferências computacionais possam ser feitas 28, o Hi-C de célula única não é adequado para a obtenção de informações 3C de ultra-alta resolução. Uma limitação adicional do Hi-C é que ele detecta apenas interações pareadas. Para detectar interações multicontato, pode-se usar cortadores frequentes combinados com sequenciamento de leitura curta (Illumina)16 ou realizar multicontato 3C29 ou 4C30, usando sequenciamento de leitura longa de plataformas PacBio ou Oxford Nanopore. Derivados de Hi-C para detectar especificamente contatos entre e ao longo de cromátides irmãs também foram desenvolvidos31,32.
Embora o Hi-C19 e o Micro-C33 possam ser usados para gerar mapas de contato em resoluções subquilobase, ambos exigem uma grande quantidade de leituras de sequenciamento e isso pode se tornar um empreendimento caro. Para chegar a uma resolução semelhante ou até maior sem os custos, o enriquecimento para regiões genômicas específicas (captura-C 34) ou interações proteicas específicas (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37) pode ser aplicado. A força e a desvantagem dessas aplicações de enriquecimento é que apenas um número limitado de interações é amostrado. Com tais enriquecimentos, o aspecto global do Hi-C (e a opção da normalização global) é perdido.
Importância e potenciais aplicações do Hi-C3.0 Esse protocolo foi projetado para permitir 3C ultraprofundos de alta resolução e, ao mesmo tempo, detectar recursos de dobragem em larga escala, como TADs e compartimentos17 (Figura 6). Este protocolo começa com 5 × 106 células por tubo para cada biblioteca Hi-C, que deve ser material mais do que suficiente para sequenciar uma ou duas pistas em uma célula de fluxo para obter até 1 bilhão de leituras emparelhadas. Para sequenciamento ultraprofundo, múltiplos tubos de 5 × 106 células devem ser preparados, dependendo do número de leituras mapeadas e duplicatas de PCR. Na resolução mais alta (<1 kb), as interações de looping são encontradas principalmente entre os locais da CTCF, mas as interações promotor-potenciador também podem ser detectadas. Os leitores podem consultar Akgol Oksuz et al.17 para uma descrição detalhada da análise dos dados.

A captura de conformação cromossômica tem sido utilizada desde 20021. Fundamentalmente, cada variante de captura de conformação depende da fixação das interações DNA-proteína e proteína-proteína para preservar a organização da cromatina 3D. Isto é seguido por fragmentação de DNA, geralmente por digestão de restrição e, finalmente, religação de extremidades de DNA próximas para converter loci espacialmente proximais em sequências de DNA covalentes únicas. Os protocolos 3C iniciais usavam PCR para amostrar interações específicas "um-para-um". Ensaios 4C subsequentes permitiram a detecção de interações "um-para-todos"2, enquanto o 5C detectou interações "muitos-para-muitos"3. A captura de conformação cromossômica se concretizou completamente após a implementação de sequenciamento de alta produção (NGS) de próxima geração, que permitiu a detecção de interações genômicas "all-to-all" usando Hi-C4 em todo o genoma e técnicas comparáveis, como 3C-seq5, TCC6 e Micro-C 7,8 (ver também revisão por Denker e De Laat9).
Em Hi-C, nucleotídeos biotinilados são usados para marcar saliências de 5′ após a digestão e antes da ligadura (Figura 1). Isso permite a seleção de fragmentos adequadamente digeridos e religados usando contas revestidas com estreptavidina, diferenciando-o do GCC10. Uma importante atualização do protocolo Hi-C foi implementada por Rao et al.11, que realizaram a digestão e religação em núcleos intactos (ou seja, in situ) para reduzir os produtos de ligadura espúria. Além disso, a substituição da digestão HindIII pela digestão MboI (ou DpnII) reduziu o tamanho do fragmento e aumentou o potencial de resolução do Hi-C. Esse aumento permitiu a detecção de estruturas de escala relativamente pequena e uma localização genômica mais precisa de pontos de contato, como alças de DNA entre pequenos cis-elementos, por exemplo, alças entre sítios ligados à CTCF geradas por extrusão de alça11,12. No entanto, esse potencial tem um custo. Primeiro, um aumento de duas vezes na resolução requer um aumento de quatro vezes (22) nas leituras de sequenciamento13. Em segundo lugar, os pequenos tamanhos de fragmentos aumentam a possibilidade de confundir fragmentos vizinhos não digeridos com fragmentos digeridos e religados14. Como mencionado, em Hi-C, fragmentos digeridos e religados diferem dos fragmentos não digeridos pela presença de biotina na junção de ligadura. No entanto, a remoção adequada da biotina das extremidades não ligadas é necessária para garantir que apenas as junções de ligadura sejam puxadas para baixo14,15.
Com a diminuição do custo do NGS, torna-se viável estudar o dobramento cromossômico com mais detalhes. Para diminuir o tamanho dos fragmentos de DNA e, assim, aumentar a resolução, o protocolo Hi-C pode ser adaptado para usar com maior frequência enzimas de restrição de corte16 ou para usar combinações de enzimas de restrição17,18,19. Alternativamente, a MNase 7,8 em Micro-C e DNase em DNase Hi-C20 podem ser tituladas para alcançar a digestão ideal.
Uma avaliação sistemática recente dos fundamentos dos métodos 3C mostrou que a detecção de características de dobramento cromossômico em todas as escalas de comprimento melhorou muito com reticulação sequencial com 1% de AF seguida de 3 mM DSG17. Além disso, o Hi-C com digestão HindIII foi a melhor opção para detectar características de dobramento em larga escala, como compartimentos, e que o Micro-C foi superior na detecção de características de dobramento em pequena escala, como laços de DNA. Esses resultados levaram ao desenvolvimento de uma estratégia "Hi-C 3.0" única e de alta resolução, que utiliza a combinação de reticulantes FA e DSG seguida de dupla digestão com endonucleases DpnII e DdeI21. O Hi-C 3.0 fornece uma estratégia eficaz para uso geral, pois detecta com precisão os recursos de dobragem em todas as escalas de comprimento17. A parte experimental do protocolo Hi-C 3.0 é detalhada aqui e os resultados típicos que podem ser esperados após o sequenciamento são mostrados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figura 1: Procedimento Hi-C em seis etapas. As células são fixadas primeiro com AF e, em seguida, DSG (1). Em seguida, a lise precede uma dupla digestão com DdeI e DpnII (2). A biotina é adicionada por saliência de preenchimento e as extremidades embotadas proximais são ligadas (3) antes da purificação do DNA (4). A biotina é removida das extremidades não ligadas antes da sonicação e seleção de tamanho (5). Finalmente, o pull-down da biotina permite a ligadura do adaptador e a amplificação da biblioteca por PCR (6). Abreviaturas: FA = formaldeído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; B = Biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

A captura de conformação cromossômica (3C) é usada para detectar interações tridimensionais de cromatina. Normalmente, a reticulação química com formaldeído (AF) é usada para fixar interações de cromatina. Em seguida, a digestão da cromatina com uma enzima de restrição e a subsequente religação das extremidades do fragmento convertem a proximidade tridimensional (3D) em produtos de ligadura exclusivos. Finalmente, após a reversão das ligações cruzadas, remoção de proteínas e isolamento do DNA, o DNA é cortado e preparado para sequenciamento de alto rendimento. A frequência de ligadura de proximidade de pares de loci é uma medida da frequência de sua colocalização no espaço tridimensional em uma população celular.
Uma biblioteca Hi-C sequenciada fornece informações de todo o genoma sobre frequências de interação entre todos os pares de loci. A resolução e a precisão do Hi-C dependem de uma reticulação eficiente que mantém os contatos da cromatina e da fragmentação frequente e uniforme da cromatina. Este trabalho descreve um protocolo Hi-C in situ melhorado, Hi-C 3.0, que aumenta a eficiência da reticulação combinando dois reticulantes (formaldeído [FA] e glutarato de disuccinimidil [DSG]), seguido de digestão mais fina usando duas enzimas de restrição (DpnII e DdeI). O Hi-C 3.0 é um protocolo único para a quantificação precisa de características de dobramento do genoma em escalas menores, como loops e domínios topologicamente associados (TADs), bem como características em escalas maiores de todo o núcleo, como compartimentos.

As figuras deste manuscrito foram geradas a partir de um experimento separado, replicado do publicado anteriormente por Lafontaine et al.21. Após a obtenção dos dados de sequenciamento de alto rendimento, o Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) foi utilizado para processar os dados Hi-C. Um pipeline semelhante pode ser encontrado no portal de dados do projeto 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Resumidamente, o destilador de tubulação Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) foi implementado para (1) alinhar as sequências de moléculas Hi-C ao genoma de referência, (2) analisar o alinhamento .sam e formar arquivos com pares Hi-C, (3) filtrar duplicatas de PCR e (4) agregar pares em matrizes binadas de interações Hi-C. Essas matrizes formatadas HDF5, chamadas de coolers, podem então ser (1) visualizadas em um servidor HiGlass (https://higlass.io/) e (2) analisadas usando um grande conjunto de ferramentas computacionais de código aberto presentes na coleção "cooltools" mantida pelo Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) para extrair e quantificar recursos de dobra, como compartimentos, TADs e loops.
Alguns indicadores de qualidade das bibliotecas Hi-C3.0 podem ser avaliados imediatamente após o mapeamento de pares de leitura para um genoma de referência, usando algumas métricas/indicadores simples. Primeiro, normalmente ~ 50% dos pares de leitura sequenciados podem ser mapeados exclusivamente para células humanas. Devido à natureza polimérica dos cromossomos, a maioria dessas leituras mapeadas (~60%-90%) representa interações dentro de um cromossomo (cis), com frequências de interação decaindo rapidamente com o aumento da distância genômica (decaimento dependente da distância). O decaimento dependente da distância pode ser melhor visualizado em um "gráfico de escala", que mostra a probabilidade de contato (por braço cromossômico) em função da distância genômica. Descobrimos que o uso de diferentes reticuladores e enzimas pode alterar o decaimento dependente da distância em distâncias de longo e curto alcance17. A adição de reticulação DSG aumenta a detectabilidade de interações a curtas distâncias quando combinada com enzimas como Mnase e combinações de DpnII-DdeI que produzem fragmentos menores (Figura 6A).
O decaimento dependente da distância também pode ser observado diretamente a partir de matrizes de interação 2D: as interações tornam-se mais infrequentes quando localizadas mais longe da diagonal central (Figura 6B). Além disso, características de dobramento genômico, como compartimentos, TADs e alças, podem ser identificadas a partir de matrizes Hi-C e gráficos de escala como desvios do decaimento dependente da distância média geral do genoma. É importante ressaltar que a reticulação com DSG, além da AF, diminui as ligaduras aleatórias, que são irrestritas devido à natureza polimérica dos cromossomos e, portanto, mais propensas a ocorrer entre os cromossomos (em trans) (Figura 6C). A redução da ligadura aleatória leva ao aumento da relação sinal-ruído, especialmente para interações intracromossômicas intercromossômicas e de longo alcance (>10-50 Mb).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figura 6: Resultados representativos de bibliotecas Hi-C mapeadas e filtradas. (A) Gráficos de escala com probabilidade de contato e sua derivada para várias enzimas, ordenados por comprimento de fragmento (topo) e reticulação com FA ou FA + DSG (abaixo). A digestão com MNAse (microC) ou DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) aumenta significativamente os contatos de curto alcance (acima), assim como a adição de DSG ao FA (inferior). (B) As colunas mostram mapas de calor Hi-C da digestão DpnII após apenas a reticulação FA e a digestão DpnII ou DdeI após a reticulação FA+DSG. As setas brancas mostram o aumento da força dos "pontos" após a reticulação DSG e a digestão DdeI, o que implica uma melhor detecção de alças de DNA. As linhas mostram diferentes partes do cromossomo 3 em resolução crescente, alinhando-se com o painel C: linha superior: cromossomo 3 inteiro (0-198,295,559 Mb); fila do meio: 186-196 Mb; linha inferior: 191,0-191,5 Mb. (C) Gráficos de cobertura para as regiões representadas em A. As setas pretas mostram a cobertura mais baixa (%cis lê) para reticulação somente de FA. Abreviaturas: FA = formaldeído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; chr = cromossomo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Nem todas as leituras mapeadas são úteis. Um segundo indicador de qualidade é o número de duplicatas de PCR. Leituras duplicadas exatas são altamente improváveis de ocorrer por acaso após ligadura e sonicação. Assim, tais leituras provavelmente resultaram da amplificação por PCR e precisam ser filtradas. Duplicatas geralmente surgem quando muitos ciclos de PCR são necessários para amplificar bibliotecas de baixa complexidade. Geralmente, para Hi-C, a maioria das bibliotecas só precisa de 5-8 ciclos de amplificação final de PCR, conforme determinado pela titulação PCR (ver etapa 3.9; Figura 4). No entanto, bibliotecas com complexidade suficiente podem ser obtidas mesmo após 14 ciclos de amplificação por PCR.
Outra categoria de leituras duplicadas, as chamadas duplicatas ópticas, pode surgir do processo de amplificação em plataformas de sequenciamento Illumina que usam células de fluxo padronizadas (como HiSeq4000). Duplicatas ópticas são encontradas sobrecarregando a célula de fluxo, fazendo com que aglomerados (grandes) sejam chamados de dois aglomerados separados, ou de reagrupamento local da molécula final emparelhada original após uma primeira rodada de PCR. Como ambos os tipos de duplicatas ópticas são locais, elas podem ser identificadas e distinguidas das duplicatas de PCR por sua localização na célula de fluxo. Enquanto bibliotecas com duplicatas de PCR de >15% precisariam de regeneração, bibliotecas com duplicatas ópticas podem ser recarregadas após a otimização do processo de carregamento.
Tabela Suplementar S1: Buffers e soluções. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Este protocolo detecta com precisão os recursos de dobramento cromossômico em várias escalas de comprimento com um sinal de fundo baixo. Por exemplo, as interações do potenciador do promotor podem ser analisadas no contexto dos compartimentos cromossômicos. O uso de endonucleases de restrição contorna a otimização do nível de digestão do material de entrada.Nenhuma seleção por isolamento de gel é necessária para capturar produtos de ligadura. O problema mais comum é a perda de células após a fixação do DSG e a captura de DNA suficiente para produzir bibliotecas de alta qualidade. Para começar, aspirar o meio com uma pipeta Pasteur acoplada a um purgador de vácuo da placa de 150 milímetros contendo 5 por 10 até as sextas células.Lave as células duas vezes com 10 mililitros de HBSS. Para reticular as células, despeje 23,125 mililitros da solução de 1% de formaldeído na placa de 15 centímetros. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, agitando suavemente a placa à mão a cada dois minutos.Em seguida, adicione 1,25 mililitros de glicina 2,5 molar e gire suavemente a placa para extinguir a reação de reticulação, antes de incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Continue a incubação no gelo por 15 minutos para parar a reticulação. Raspe as células da placa com um raspador de células ou um policial de borracha e transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 50 mililitros com uma pipeta.Centrifugar a suspensão a 1 000 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante por aspiração. Lave o pellet uma vez com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS. Em seguida, centrifugar novamente antes de prosseguir para a reticulação DSG.Para reticulação com DSG, ressuspenda as células peletizadas em 9,9 mililitros de DPBS. Em seguida, adicione 100 microlitros de DSG de 300 milimolares. Misture o tubo por inversão e faça a ligação cruzada das células à temperatura ambiente durante 40 minutos num rotador.Após a reticulação, adicione 1,925 mililitros de glicina 2,5 molares, inverta para misturar e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugar as células a 2.000 vezes G por 15 minutos e ressuspender o pellet em um mililitro de 0,05% de albumina sérica bovina DPBS antes de transferi-lo para um tubo de 1,7 mililitro. Centrifugar as células a 2.000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.Congele o pellet em nitrogênio líquido antes de prosseguir para a captura de confirmação cromossômica. Ressuspeite a alíquota de células reticuladas em um mililitro de tampão de lise gelada contendo 10 microlitros de coquetel inibidor de protease e transfira para um homogeneizador Dounce por 15 minutos de incubação no gelo. Mova lentamente o pilão A para cima e para baixo 30 vezes para homogeneizar as células e incubar por um minuto para permitir que as células esfriem antes de mais 30 golpes.Após o último traço, transfira o lisado para um tubo de 1,7 mililitro. Centrifugar a suspensão lisada a 2, 500 vezes G durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e agite ou vórtice para ressuspender o pellet molhado.Remova o máximo possível do sobrenadante para obter uma substância semelhante a iogurte com o mínimo de aglomerados. Ressuscite o pellet em 500 microlitros de tampão de restrição gelada antes da centrifugação. Após a segunda lavagem, ressuscite o pellet em 360 microlitros de tampão de restrição por pipetagem depois de adicionar aproximadamente 340 microlitros ao volume de carryover do pellet, dependendo do tamanho da célula.Reserve 18 microlitros de lisado para testar a integridade da cromatina, ou CI.To lisado restante, adicione 38 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 1% ao tubo hi-C para fazer um volume total de 380 microlitros e misture cuidadosamente pipetando sem introduzir bolhas. Incubar as amostras a 65 graus Celsius sem agitar durante 10 minutos para abrir a cromatina. Em seguida, coloque imediatamente o tubo no gelo.Depois de preparar a mistura de digestão com Triton X-100, adicione 107 microlitros desta mistura ao tubo hi-C para fazer um volume total de 487 microlitros e digerir a cromatina durante a noite a 37 graus Celsius em um termócamo com agitação intervalar. No dia seguinte, transfira as amostras para 65 graus Celsius por 20 minutos para desativar a atividade restante da endonuclease. Depois de colocar a amostra no gelo, reserve 10 microlitros de controle de digestão, ou DC, e armazene-os a quatro graus Celsius.Remova a condensação da tampa com uma pipeta ou girando. Em seguida, adicione 58 microlitros de mistura de preenchimento de biotina para fazer um volume total de 535 microlitros. Pipetar suavemente sem formar bolhas antes de incubar a 23 graus Celsius durante quatro horas numa termímetro.Após a incubação, adicionar 665 microlitros de mistura de ligadura, tornando o volume da amostra 1, 200 microlitros. Misture a amostra por pipetagem e incube a 16 graus Celsius durante quatro horas numa termificante. Em seguida, adicione 50 microlitros de proteinase-K em duas frações ao tubo de amostra hi-C e incube durante a noite a 65 graus Celsius com agitação intervalar.Para a purificação do DNA, adicione etanol 100% gelado e centrifugar os tubos a 18.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Retirar completamente o sobrenadante do lado não pellet e secar a amostra ao ar durante 10 minutos ou até que os pellets estejam visivelmente secos. Uma vez que os pellets estejam secos, solubilize-os em 450 microlitros de Tris low-EDTA por pipetagem ou rodopiando.Transfira a suspensão solubilizada para a unidade de filtro centrífugo de 0,5 milímetros, ou UFC, com um ponto de corte de peso molecular de três quilodaltons. Centrifugar a UFC à velocidade máxima durante 10 minutos e eliminar o fluxo. Após a segunda lavagem, adicione 80 microlitros de Tris low-EDTA à coluna.Transformar a coluna num novo tubo de recolha durante dois minutos de centrifugação à velocidade máxima. Finalmente, carregue as amostras em um gel de agarose a 0,8%. O gel de agarose com resultados de titulação por PCR demonstrou que a maioria das bibliotecas requer cinco a oito ciclos de amplificação final por PCR.A digestão celular da biblioteca final de PCR amplificada, como observado por fragmentos menores em um gel de agarose, confirma a presença de junções de ligadura adequadas e serve como uma verificação de qualidade antes do sequenciamento. Após o sequenciamento, os dados mapeados mostraram que a combinação de DpnII e DdeI aumenta significativamente os contatos de curto alcance, como a adição de DSG à reticulação convencional de formaldeído. Um sinal melhorado também pode ser observado a longas e curtas distâncias diretamente das matrizes de interação 2D.Os sinais compartimentais são CRISPR a longas distâncias e os pontos formados por laços de cromatina são mais proeminentes a curtas distâncias. Além do formaldeído, a reticulação com DSG diminui as ligaduras aleatórias, melhorando a cobertura relativa em cis. É importante não perder células durante e após a reticulação.Os pellets de células podem estar soltos ou invisíveis, e as células podem grudar nas pontas da pipeta em alguns dos buffers.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Genética

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Em pool shRNA tela para reativação de MeCP2 no cromossomo X inativo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Geração de todo o genoma da cromatina conformação captura bibliotecas de firmemente encenado embriões adiantados da drosófila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...