Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Дениса Лафонтена за разработку протокола и Сергея Венева за биоинформационную помощь. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения Common Fund 4D Nucleome Program для J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). Джей Ди является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза.
Эта статья подпадает под действие политики открытого доступа к публикациям HHMI. Руководители лабораторий HHMI ранее предоставили неисключительную лицензию CC BY 4.0 для общественности и сублицензируемую лицензию HHMI в своих исследовательских статьях. В соответствии с этими лицензиями принятая автором рукопись этой статьи может быть предоставлена в свободный доступ по лицензии CC BY 4.0 сразу после публикации.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Критические шаги для обработки ячеек Хотя можно использовать меньшее количество входных ячеек, этот протокол был оптимизирован для ~ 5 × 106 ячеек на линию секвенирования (~ 400 M чтения), чтобы обеспечить надлежащую сложность после глубокого секвенирования. Клетки лучше всего подсчитывать перед фиксацией. Для генерации сверхглубоких библиотек мы обычно умножаем количество полос (и ячеек) до тех пор, пока не будет достигнута желаемая глубина чтения. Для оптимальной фиксации сывороточную среду следует заменить ПБС до фиксации ФА, а фиксирующие растворы добавлять немедленно и без градиентов концентрации 15,22. Для сбора клеток соскоб предпочтительнее трипсинизации, потому что переход от более плоской к сферической форме после трипсинизации может повлиять на ядерную конформацию. После добавления DSG гранулы сыпучих и комковатых клеток легко теряются. Будьте осторожны при работе с клетками на этом этапе и добавьте до 0,05% BSA, чтобы уменьшить слипание.
Изменения в методе Этот протокол был разработан с использованием клеток человека17. Тем не менее, основываясь на опыте захвата конформации хромосом, этот протокол должен работать для большинства эукариотических клеток. Для значительно более низкого ввода (~1 × 106 ячеек) мы советуем использовать половину объемов для процедур лизиса и конформационного захвата [этапы 2.1-2.4]. Это также позволит выполнить изоляцию ДНК [этап 2.5] в настольной центрифуге с пробирками объемом 1,7 мл, что может улучшить гранулирование для низких концентраций ДНК. Количественная оценка ДНК (этап 2.6.6) укажет, как действовать дальше. Для небольших количеств выделенной ДНК (1-5 мкг) мы предлагаем пропустить выбор размера (этап 3.3) и приступить к удалению биотина после уменьшения объема со 130 мкл до ~45 мкл с помощью КОЕ.
Этот протокол был разработан специально для обеспечения высокого качества данных после последующего сшивания с FA и DSG и пищеварения с DpnII и DdeI. Однако альтернативные стратегии сшивания, такие как FA, за которым следует EGS (этиленгликоль-бис (сукцинимидилсукцинат)), который также используется в ChIP-seq23 и ChIA-PET24, могут работать одинаково хорошо17. Аналогичным образом, различные комбинации ферментов, такие как DpnII и HinfI18 или MboI, MseI и NlaIII19 , могут быть использованы для пищеварения. При адаптации комбинаций ферментов обязательно используйте биотинилированные нуклеотиды, которые могут заполнять определенные 5'-свесы и использовать наиболее оптимальные буферы для каждого коктейля. DpnII поставляется с собственным буфером, и производитель ферментов рекомендует специальный буфер для пищеварения DdeI. Тем не менее, для двойного пищеварения с DpnII и DdeI в этом протоколе рекомендуется рестрикционный буфер, потому что он рассчитан на 100% активность для обоих ферментов.
Поиск и устранение неисправностей при захвате соответствия Три ключевых шага в захвате конформации хромосом: сшивание, пищеварение и религирование были выполнены до того, как результаты могут быть визуализированы на геле. Чтобы определить качество каждого из этих трех этапов и определить, где могли возникнуть проблемы, аликвоты до (CI) и после пищеварения (DC) берутся и загружаются на гель вместе с лигированным образцом Hi-C (рисунок 2). Этот гель используется для определения качества образца Hi-C и того, стоит ли продолжать протокол. Без CI и DC трудно точно определить потенциальные неоптимальные шаги. Стоит отметить, что неоптимальная перевязка может быть вызвана проблемой в самой лигации, заполнении или проблемой с сшивки. Для устранения неполадок сшивки убедитесь, что вы не используете более 1 × 107 ячеек на библиотеку и начните со свежих реагентов для сшивания и чистых ячеек (т. Е. Промытых PBS). Для перевязки убедитесь, что клетки и лигационная смесь хранятся на льду. Добавьте Т4 ДНК-лигазу непосредственно перед 4-часовой инкубацией при 16 °C и хорошо перемешайте.
Устранение неполадок при подготовке библиотеки Если требуется более 10 циклов ПЦР или продукт ПЦР не виден на геле после титрования ПЦР (рисунок 4), есть несколько вариантов сохранения образца Hi-C. Возвращаясь к титрованию ПЦР, первый вариант заключается в том, чтобы попробовать ПЦР еще раз. Если продукта все еще недостаточно, можно попробовать еще один раунд перевязки A-хвоста и адаптера (шаг 3.6) после промывки бусин дважды с буфером 1x TLE. После этого дополнительного А-хвоста и перевязки адаптера можно приступать к титрованию ПЦР, как и раньше. Если продукта по-прежнему нет, последний вариант состоит в том, чтобы повторно обработать фракцию 0,8x с шага 3.3 и продолжить оттуда.
Ограничения и преимущества Hi-C3.0 Важно понимать, что Hi-C является популяционным методом, который фиксирует среднюю частоту взаимодействий между парами локусов в клеточной популяции. Некоторые вычислительные анализы предназначены для разделения комбинаций конформаций из популяции25, но в принципе Hi-C слеп к различиям между клетками. Хотя можно выполнить одноэлементный Hi-C26,27 и вычислительные выводы могут быть сделаны28, одноэлементный Hi-C не подходит для получения информации 3C сверхвысокого разрешения. Дополнительным ограничением Hi-C является то, что он обнаруживает только парные взаимодействия. Для обнаружения многоконтактных взаимодействий можно либо использовать частые фрезы в сочетании с секвенированием короткого считывания (Illumina)16, либо выполнять многоконтактные 3C29 или 4C30, используя секвенирование с длинным чтением с платформ PacBio или Oxford Nanopore. Производные Hi-C для конкретного обнаружения контактов между и вдоль сестринских хроматид также были разработаны31,32.
Хотя Hi-C19 и Micro-C33 могут использоваться для создания карт контактов с субкилобазовыми разрешениями, оба требуют большого количества последовательных считываний, и это может стать дорогостоящим мероприятием. Чтобы получить аналогичное или даже более высокое разрешение без затрат, может быть применено обогащение для конкретных геномных областей (захват-C34) или специфических белковых взаимодействий (ChiA-PET35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). Сила и недостаток этих применений обогащения заключается в том, что отбирается только ограниченное количество взаимодействий. При таких обогащениях теряется глобальный аспект Hi-C (и возможность глобальной нормализации).
Важность и потенциальные возможности применения Hi-C3.0 Этот протокол был разработан для обеспечения сверхглубокого 3C с высоким разрешением при одновременном обнаружении крупномасштабных складных функций, таких как TAD и отсеки17 (рисунок 6). Этот протокол начинается с 5 × 106 ячеек на трубку для каждой библиотеки Hi-C, что должно быть более чем достаточным материалом для секвенирования одной или двух полос на проточной ячейке для получения до 1 миллиарда парных считываний. Для сверхглубокого секвенирования следует подготовить несколько пробирок по 5 × 106 клеток, в зависимости от количества отображаемых считываний и дубликатов ПЦР. При самом высоком разрешении (<1 кб) зацикленные взаимодействия в основном обнаруживаются между сайтами CTCF, но также могут быть обнаружены взаимодействия промотор-энхансер. Читатели могут обратиться к Akgol Oksuz et al.17 для подробного описания анализа данных.

Захват конформации хромосом используется с 2002 года1. По сути, каждый вариант захвата конформации зависит от фиксации взаимодействий ДНК-белок и белок-белок для сохранения 3D-организации хроматина. За этим следует фрагментация ДНК, обычно путем рестрикции пищеварения, и, наконец, религирование близлежащих концов ДНК для преобразования пространственно проксимальных локусов в уникальные ковалентные последовательности ДНК. Первоначальные протоколы 3C использовали ПЦР для выборки конкретных взаимодействий «один к одному». Последующие анализы 4C позволили обнаружить взаимодействия «один ко всем»2, в то время как 5C обнаружил взаимодействия «многие ко многим»3. Захват конформации хромосом полностью осуществился после внедрения высокопроизводительного секвенирования следующего поколения (NGS), которое позволило обнаружить геномные взаимодействия «все ко всем» с использованием геномных Hi-C4 и сопоставимых методов, таких как 3C-seq5, TCC6 и Micro-C 7,8 (см. также обзор Denker и De Laat9).
В Hi-C биотинилированные нуклеотиды используются для обозначения 5'-свесов после пищеварения и перед лигированием (рисунок 1). Это позволяет выбирать правильно переваренные и религированные фрагменты с использованием бусин, покрытых стрептавидином, что отличает их от GCC10. Важное обновление протокола Hi-C было реализовано Rao et al.11, которые выполнили переваривание и религирование в интактных ядрах (т.е. in situ) для уменьшения ложных продуктов лигирования. Кроме того, замена пищеварения HindIII перевариванием MboI (или DpnII) уменьшала размер фрагмента и увеличивала потенциал разрешения Hi-C. Это увеличение позволило обнаружить относительно небольшие структуры и более точную геномную локализацию точек контакта, таких как петли ДНК между мелкими цис-элементами, например, петли между CTCF-связанными сайтами, генерируемыми экструзией петли11,12. Однако этот потенциал имеет свою цену. Во-первых, двукратное увеличение разрешения требует четырехкратного (22) увеличения последовательности чтения13. Во-вторых, небольшие размеры фрагментов увеличивают возможность ошибочного принятия непереваренных соседних фрагментов за переваренные и лигированные фрагменты14. Как уже упоминалось, в Hi-C переваренные и религированные фрагменты отличаются от непереваренных фрагментов наличием биотина в лигативном соединении. Тем не менее, требуется правильное удаление биотина с нелигированных концов, чтобы гарантировать, что только лигационные соединения вытягиваются вниз14,15.
С уменьшением стоимости NGS становится возможным более детально изучить сворачивание хромосом. Чтобы уменьшить размер фрагментов ДНК и тем самым увеличить разрешение, протокол Hi-C может быть адаптирован для более частого использования редукционных ферментов16 или для использования комбинаций ферментоврестрикции 17,18,19. Альтернативно,MNase 7,8 в Micro-C и DNase в DNase Hi-C20 могут быть титрованы для достижения оптимального пищеварения.
Недавняя систематическая оценка основ методов 3C показала, что обнаружение особенностей сворачивания хромосом на каждой шкале длины значительно улучшилось благодаря последовательному сшиванию с 1% FA, за которым следует 3 мМ DSG17. Кроме того, Hi-C с пищеварением HindIII был лучшим вариантом для обнаружения крупномасштабных складных функций, таких как компартменты, и что Micro-C превосходил в обнаружении мелкомасштабных складных функций, таких как петли ДНК. Эти результаты привели к разработке единой стратегии высокого разрешения «Hi-C 3.0», которая использует комбинацию сшивающих устройств FA и DSG с последующим двойным перевариванием с эндонуклеазами DpnII и DdeI21. Hi-C 3.0 обеспечивает эффективную стратегию для общего использования, поскольку он точно обнаруживает складные элементы на всех масштабах длины17. Экспериментальная часть протокола Hi-C 3.0 подробно описана здесь и показаны типичные результаты, которые можно ожидать после секвенирования.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Рисунок 1: Процедура Hi-C в шесть этапов. Клетки фиксируются сначала ФА, а затем DSG (1). Затем лизис предшествует двойному пищеварению с DdeI и DpnII (2). Биотин добавляют путем заполнения свеса, а проксимальные притупленные концы перевязывают (3) перед очисткой ДНК (4). Биотин удаляется с нелигированных концов перед обработкой ультразвуком и подбором размера (5). Наконец, вытягивание биотина позволяет осуществлять лигирование адаптера и библиотечное усиление с помощью ПЦР (6). Сокращения: FA = формальдегид; DSG = дисукцинимидиллутарат; B = Биотин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

Захват конформации хромосом (3C) используется для обнаружения трехмерных взаимодействий хроматина. Как правило, химическое сшивание с формальдегидом (ФА) используется для фиксации взаимодействий хроматина. Затем переваривание хроматина ферментом рестрикции и последующее религирование концов фрагмента превращает трехмерную (3D) близость в уникальные продукты лигирования. Наконец, после разворота сшивок, удаления белка и выделения ДНК ДНК срезается и подготавливается к высокопроизводительному секвенированию. Частота бесконтактного лигирования пар локусов является мерой частоты их колокализации в трехмерном пространстве в клеточной популяции.
Секвенированная библиотека Hi-C предоставляет общегеномную информацию о частотах взаимодействия между всеми парами локусов. Разрешение и точность Hi-C зависит от эффективного сшивания, которое поддерживает контакты хроматина и частую и равномерную фрагментацию хроматина. В этой статье описывается улучшенный in situ протокол Hi-C, Hi-C 3.0, который повышает эффективность сшивки путем объединения двух сшивающих (формальдегид [FA] и дисукцинимидиллутарат [DSG]), с последующим более тонким пищеварением с использованием двух ферментов рестрикции (DpnII и DdeI). Hi-C 3.0 - это единый протокол для точной количественной оценки признаков складывания генома в меньших масштабах, таких как петли и топологически ассоциирующие домены (TADs), а также особенностей в более крупных масштабах ядра, таких как компартменты.

Рисунки в этой рукописи были получены из отдельного, повторяющего эксперимента, опубликованного ранее Lafontaine et al.21. После получения высокопроизводительных данных секвенирования для обработки данных Hi-C был использован Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c). Аналогичный конвейер можно найти на портале данных проекта 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Вкратце, конвейерный дистиллятор Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) был реализован для (1) выравнивания последовательностей молекул Hi-C с эталонным геномом, (2) разбора выравнивания .sam и файлов форм с парами Hi-C, (3) фильтрации дубликатов ПЦР и (4) агрегирования пар в объединенные матрицы взаимодействий Hi-C. Эти матрицы в формате HDF5, называемые кулерами, затем можно (1) просмотреть на сервере HiGlass (https://higlass.io/) и (2) проанализировать с использованием большого набора вычислительных инструментов с открытым исходным кодом, присутствующих в коллекции «cooltools», поддерживаемой Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools), для извлечения и количественной оценки складных функций, таких как отсеки, TAD и петли.
Некоторые показатели качества библиотек Hi-C3.0 могут быть оценены сразу после сопоставления считываемых пар с эталонным геномом, используя несколько простых метрик / индикаторов. Во-первых, как правило, ~ 50% секвенированных пар чтения могут быть уникально отображены для клеток человека. Из-за полимерной природы хромосом большинство из этих нанесенных на карту считываний (~ 60%-90%) представляют собой взаимодействия внутри хромосомы (цис), причем частоты взаимодействия быстро распадаются с увеличением геномного расстояния (зависящий от расстояния распад). Зависящий от расстояния распад может быть лучше всего визуализирован на «графике масштабирования», который показывает вероятность контакта (на хромосомное плечо) как функцию геномного расстояния. Мы обнаружили, что использование различных сшивающих веществ и ферментов может изменить зависящий от расстояния распад на больших и ближних расстояниях17. Добавление сшивки DSG повышает обнаруживаемость взаимодействий на коротких расстояниях в сочетании с ферментами, такими как Mnase и комбинациями DpnII-DdeI, которые производят меньшие фрагменты (рисунок 6A).
Зависящий от расстояния распад также можно наблюдать непосредственно из 2D-матриц взаимодействия: взаимодействия становятся более редкими, когда они расположены дальше от центральной диагонали (рисунок 6B). Кроме того, геномные особенности сворачивания, такие как компартменты, TAD и петли, могут быть идентифицированы из матриц Hi-C и графиков масштабирования как отклонения от общего среднего расстояния геномного распада. Важно отметить, что сшивание с DSG в дополнение к FA уменьшает случайные лигации, которые не ограничены из-за полимерной природы хромосом и, следовательно, более вероятны между хромосомами (у транс) (рисунок 6C). Уменьшение случайного лигирования приводит к увеличению отношения сигнал/шум, особенно для межхромосомных и очень дальних (>10-50 Мб) внутрихромосомных взаимодействий.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативные результаты картографированных и отфильтрованных библиотек Hi-C. (A) Графики масштабирования с вероятностью контакта и его производными для различных ферментов, упорядоченные по длине фрагмента (вверху) и сшивки с FA или FA + DSG (внизу). Пищеварение с помощью MNAse (microC) или DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) значительно увеличивает контакты ближнего действия (сверху), как и добавление DSG к FA (внизу). (B) Столбцы показывают тепловые карты Hi-C пищеварения DpnII после сшивки FA и dpnII или DdeI после сшивки FA + DSG. Белые стрелки показывают увеличение силы «точек» после сшивания DSG и переваривания DdeI, что подразумевает лучшее обнаружение петель ДНК. Ряды показывают различные части хромосомы 3 с возрастающим разрешением, выравниваясь с панелью C: верхний ряд: вся хромосома 3 (0-198,295,559 Mb); средний ряд: 186-196 Мб; нижний ряд: 191.0-191.5 Mb. (C) Графики покрытия для регионов, изображенных в A. Черные стрелки показывают более низкое покрытие (%cis reads) для сшивки только FA. Сокращения: FA = формальдегид; DSG = дисукцинимидиллутарат; chr = хромосома. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Не все сопоставленные чтения полезны. Вторым показателем качества является количество дубликатов ПЦР. Точные дублирующие показания вряд ли произойдут случайно после перевязки и обработки ультразвуком. Таким образом, такие показания, вероятно, являются результатом амплификации ПЦР и должны быть отфильтрованы. Дубликаты часто возникают, когда требуется слишком много циклов ПЦР для усиления библиотек низкой сложности. Как правило, для Hi-C большинству библиотек требуется только 5-8 циклов конечной амплификации ПЦР, определяемой титрованием ПЦР (см. шаг 3.9; Рисунок 4). Однако библиотеки достаточной сложности можно получить даже после 14 циклов ПЦР-амплификации.
Другая категория дублированных считываний, так называемые оптические дубликаты, может возникнуть в результате процесса усиления на платформах секвенирования Illumina, которые используют узорчатые проточные ячейки (такие как HiSeq4000). Оптические дубликаты обнаруживаются либо от перегрузки проточной ячейки, в результате чего (большие) кластеры называются двумя отдельными кластерами, либо от локального повторного повторения исходной парной концевой молекулы после первого раунда ПЦР. Поскольку оба типа оптических дубликатов являются локальными, их можно идентифицировать и отличить от дубликатов ПЦР по их расположению на проточной ячейке. В то время как библиотеки с >15% дубликатами ПЦР потребуют регенерации, библиотеки с оптическими дубликатами могут быть перезагружены после оптимизации процесса загрузки.
Дополнительная таблица S1: Буферы и растворы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 представляет собой улучшенный протокол Hi-C, который сочетает в себе формальдегидные и дисукцинимидиллутаратные сшивки с коктейлем ферментов dpnII и DdeI для увеличения отношения сигнал/шум и разрешения обнаружения взаимодействия хроматина.

Захват конформации хромосом по длинным шкалам

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Этот протокол точно обнаруживает особенности сворачивания хромосом в нескольких масштабах длины с низким фоновым сигналом. Например, промоторные энхансерные взаимодействия могут быть проанализированы в контексте хромосомных компартментов. Использование рестрикционных эндонуклеаз позволяет оптимизировать уровень переваривания входного материала.Для улавливания продуктов лигирования не требуется отбор по гелевой изоляции. Наиболее распространенной проблемой является потеря клеток после фиксации DSG и захвата достаточного количества ДНК для создания высококачественных библиотек. Для начала аспирируйте среду пипеткой Пастера, соединенной с вакуумной ловушкой, от 150-миллиметровой пластины, содержащей 5 на 10, до шестой ячейки.Дважды промыть клетки 10 миллилитрами HBSS. Чтобы сшить клетки, насыпьте 23,125 миллилитра 1%-ного раствора формальдегида в 15-сантиметровую пластину. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, осторожно раскачивая тарелку вручную каждые две минуты.Затем добавьте 1,25 миллилитра 2,5-молярного глицина и осторожно закрутите пластину, чтобы погасить реакцию сшивки, прежде чем инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Продолжайте инкубацию на льду в течение 15 минут, чтобы остановить сшивание. Соскоблите ячейки с пластины с помощью скребка для ячеек или резинового полицейского и перенесите суспензию ячейки в 50-миллилитровую коническую трубку с пипеткой.Центрифугируют суспензию в 1 000 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант путем аспирации. Вымойте гранулу один раз 10 миллилитрами фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco или DPBS. Затем снова центрифугируйте, прежде чем перейти к сшиванию DSG.Для сшивания с DSG повторно суспендируют гранулированные ячейки в 9,9 миллилитрах DPBS. Затем добавьте 100 микролитров 300-миллимолярного DSG. Перемешайте трубку путем инверсии и сшивайте ячейки при комнатной температуре в течение 40 минут на ротаторе.После сшивки добавьте 1,925 миллилитра 2,5-молярного глицина, переверните для смешивания и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифугируют клетки в 2000 раз G в течение 15 минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре 0,05% бычьего сывороточного альбумина DPBS перед переносом его в 1,7-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клетки в 2000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант.Заморозьте гранулу в жидком азоте, прежде чем приступить к захвату подтверждения хромосомы. Повторно суспендируют сшитую клеточную аликвоту в одном миллилитре буфера ледяного лизиса, содержащего 10 микролитров коктейля ингибитора протеазы, и переносят в гомогенизатор Доунса в течение 15 минут инкубации на льду. Медленно перемещайте пестик А вверх и вниз 30 раз, чтобы гомогенизировать клетки и инкубировать в течение одной минуты, чтобы позволить клеткам остыть еще до 30 ударов.После последнего удара перенесите лизат в 1,7-миллилитровую трубку. Центрифугируйте лизированную суспензию в 2 500 раз G в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и щелкните или вихрь, чтобы повторно суспендировать влажную гранулу.Удалите как можно больше надосадочного вещества, чтобы получить йогуртоподобное вещество с минимальными сгустками. Перед центрифугированием гранулы повторно суспендируют в 500 микролитрах ледо-холодового рестрикционного буфера. После второй промывки повторно суспендируют гранулу в 360 микролитрах рестрикционного буфера путем пипетирования после добавления примерно 340 микролитров к переходящего объему гранулы, в зависимости от размера ячейки.Отложите 18 микролитров лизата для проверки целостности хроматина или CI.To оставшийся лизат, добавьте 38 микролитров 1% додецилсульфата натрия в трубку hi-C, чтобы получить общий объем 380 микролитров и тщательно перемешайте путем пипетирования без введения пузырьков. Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия без встряхивания в течение 10 минут, чтобы открыть хроматин. Затем сразу же поместите трубку на лед.После приготовления смеси для пищеварения с Тритоном Х-100 добавляют 107 микролитров этой смеси в трубку hi-C, чтобы получить общий объем 487 микролитров и переваривают хроматин в течение ночи при 37 градусах Цельсия в термомиксере с интервальным встряхиванием. На следующий день переведите образцы до 65 градусов цельсия в течение 20 минут, чтобы деактивировать оставшуюся активность эндонуклеазы. После помещения образца на лед отложите 10 микролитров контроля пищеварения, или постоянного тока, и храните их при четырех градусах Цельсия.Снимите конденсат с крышки пипеткой или спиннингом. Затем добавьте 58 микролитров биотиновой смеси, чтобы получить общий объем 535 микролитров. Пипетку осторожно не образуя пузырьков перед насиживанием при 23 градусах Цельсия в течение четырех часов в термомиксоре.После инкубации добавляют 665 микролитров лигационной смеси, делая объем образца 1,200 микролитра. Перемешайте образец путем пипетирования и инкубируйте при температуре 16 градусов Цельсия в течение четырех часов в термомикшере. Затем добавьте 50 микролитров протеиназы-К в двух фракциях в пробирку для образцов hi-C и инкубируйте в течение ночи при 65 градусах Цельсия с интервальным встряхиванием.Для очистки ДНК добавьте 100% ледяной этанол и центрифугируйте пробирки в 18 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Полностью удалите супернатант со стороны, не содержащей гранул, и высушите образец на воздухе в течение 10 минут или до тех пор, пока гранулы не высохнут. Как только гранулы высохнут, солюбилизируйте их в 450 микролитрах Tris с низким ЭДТА путем пипетирования или закручивания.Перенесите солюбилизированную суспензию на 0,5-миллиметровый центробежный фильтрующий блок, или КОЕ, с трехкилодальтонной отсечкой молекулярной массы. Центрифугируйте КОЕ на максимальной скорости в течение 10 минут и отбрасывайте проточную. После второй промывки добавьте в колонку 80 микролитров Tris low-EDTA.Превратите колонну в новую коллекторную трубку для двух минут центрифугирования на максимальной скорости. Наконец, загрузите образцы на гель с содержанием агарозы 0,8%. Агарозный гель с результатами титрования ПЦР показал, что большинство библиотек требуют от пяти до восьми циклов окончательной амплификации ПЦР.Клеточное переваривание конечной амплифицированной библиотеки ПЦР, наблюдаемое более мелкими фрагментами на агарозном геле, подтверждает наличие надлежащих лигационных соединений и служит проверкой качества перед секвенированием. После секвенирования картографированные данные показали, что комбинация DpnII и DdeI значительно увеличивает контакты на коротких расстояниях, так как добавление DSG к обычному сшивке формальдегида. Улучшенный сигнал также можно наблюдать на больших и коротких расстояниях непосредственно от 2D-матриц взаимодействия.Сигналы отсека CRISPR на больших расстояниях, а точки, образованные петлями хроматина, более заметны на коротких расстояниях. В дополнение к формальдегиду, сшивание с DSG уменьшает случайные лигации, улучшая относительный охват в цис. Важно не терять клетки во время и после сшивания.Гранулы клеток могут быть рыхлыми или невидимыми, а клетки могут прилипать к кончикам пипетки в некоторых буферах.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Ускоренной излучения Биодозиметрические, автоматизированной идентификации Dicentric хромосомы (ADCI) и оценки дозы

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Поколение генома общесистемной Chromatin конформации захвата библиотек из плотно поставил раннего дрозофилы эмбрионов

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Модель неслучайной мыши для фармакологической активации Mecp2 на неактивной х-хромосоме

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Идентификация контактов Enhancer-Promoter в эмбриоидных телах по количественному захвату конформации хромосомы (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...