Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Denis Lafontaine por el desarrollo del protocolo y a Sergey Venev por la asistencia bioinformática. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Programa de Nucleomas 4D del Fondo Común de los Institutos Nacionales de Salud a J.D. (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Pasos críticos para el manejo celular Aunque es posible utilizar un número menor de celdas de entrada, este protocolo se ha optimizado para ~ 5 × 106 celdas por carril de secuenciación (~ 400 M lecturas) para garantizar la complejidad adecuada después de la secuenciación profunda. Las células se cuentan mejor antes de la fijación. Para la generación de bibliotecas ultraprofundas, generalmente multiplicamos el número de carriles (y celdas) hasta que se alcanza la profundidad de lectura deseada. Para una fijación óptima, el medio que contiene suero debe ser reemplazado por PBS antes de la fijación de AF, y las soluciones fijadoras deben agregarse inmediatamente y sin gradientes de concentración15,22. Para la recolección celular, se prefiere el raspado a la tripsinización, porque la transición de una forma más plana a una forma esférica después de la tripsinización podría afectar la conformación nuclear. Después de la adición de DSG, los gránulos de células sueltas y grumosas se pierden fácilmente. Tenga cuidado al manipular células en esta etapa y agregue hasta 0.05% de BSA para disminuir la aglutinación.
Modificaciones al método Este protocolo fue desarrollado utilizando células humanas17. Sin embargo, según la experiencia con la captura de la conformación cromosómica, este protocolo debería funcionar para la mayoría de las células eucariotas. Para una entrada significativamente menor (~ 1 × 106 celdas), recomendamos usar la mitad de los volúmenes para los procedimientos de captura de lisis y conformación [pasos 2.1-2.4]. Esto también permitiría realizar el aislamiento de ADN [paso 2.5] en una centrífuga de mesa con tubos de 1,7 ml, lo que podría mejorar la granulación para bajas concentraciones de ADN. La cuantificación del ADN (paso 2.6.6) indicará cómo proceder. Para cantidades bajas de ADN aislado (1-5 μg), sugerimos omitir la selección de tamaño (paso 3.3) y proceder con la eliminación de biotina después de reducir el volumen de 130 μL a ~ 45 μL con una UFC.
Este protocolo fue desarrollado específicamente para garantizar datos de alta calidad después de la posterior reticulación con FA y DSG y la digestión con DpnII y DdeI. Sin embargo, las estrategias alternativas de reticulación como FA seguida de EGS (etilenglicol bis (succinato de succinidil)), que también se utiliza en ChIP-seq23 y ChIA-PET24, podrían funcionar igualmente bien17. Del mismo modo, se pueden usar diferentes combinaciones de enzimas, como DpnII y HinfI18 o MboI, MseI y NlaIII19 para la digestión. Al adaptar combinaciones de enzimas, asegúrese de usar nucleótidos biotinilados que puedan llenar los voladizos específicos de 5' y use los tampones más óptimos para cada cóctel. DpnII viene con su propio tampón y el fabricante de enzimas recomienda un tampón específico para la digestión DdeI. Sin embargo, para la doble digestión con DpnII y DdeI en este protocolo, se recomienda el tampón de restricción porque está clasificado en 100% de actividad para ambas enzimas.
Solución de problemas de captura de conformación Los tres pasos clave en la captura de la conformación cromosómica: reticulación, digestión y religación se han realizado antes de que los resultados se puedan visualizar en gel. Para determinar la calidad de cada uno de estos tres pasos y discernir dónde podrían haber surgido los problemas, se toman alícuotas antes (IC) y después de la digestión (DC) y se cargan en el gel junto con la muestra Hi-C ligada (Figura 2). Este gel se utiliza para determinar la calidad de la muestra Hi-C y si valdrá la pena continuar con el protocolo. Sin el IC y el DC, es difícil identificar posibles pasos subóptimos. Vale la pena señalar que la ligadura subóptima podría deberse a un problema en la ligadura en sí, el relleno o un problema con la reticulación. Para solucionar problemas de reticulación, asegúrese de no usar más de 1 × 107 celdas por biblioteca y comience con reactivos de reticulación nuevos y celdas limpias (es decir, enjuagadas con PBS). Para la ligadura, asegúrese de que las células y la mezcla de ligadura se mantengan en hielo. Añadir T4 DNA ligasa justo antes de la incubación de 4 h a 16 °C y mezclar bien.
Solución de problemas de preparación de la biblioteca Si se necesitan más de 10 ciclos de PCR o no se puede ver ningún producto de PCR en el gel después de la titulación por PCR (Figura 4), hay algunas opciones para guardar la muestra Hi-C. Trabajando hacia atrás desde la titulación de PCR, la primera opción es probar la PCR nuevamente. Si todavía no hay suficiente producto, es posible intentar otra ronda de A-tailing y ligadura del adaptador (paso 3.6) después de lavar las perlas dos veces con 1x tampón TLE. Después de esta ligadura adicional de cola A y adaptador, se puede proceder a la titulación por PCR como antes. Si todavía no hay producto, la última opción es volver a sonizar la fracción 0.8x del paso 3.3 y proceder desde allí.
Limitaciones y ventajas de Hi-C3.0 Es importante darse cuenta de que Hi-C es un método basado en la población que captura la frecuencia promedio de interacciones entre pares de loci en la población celular. Algunos análisis computacionales están diseñados para desentrañar combinaciones de conformaciones de una población25, pero en principio, Hi-C es ciego a las diferencias entre células. Aunque es posible realizar Hi-C26,27 de una sola celda y se pueden hacer inferencias computacionales28, Hi-C de una sola celda no es adecuado para obtener información 3C de ultra alta resolución. Una limitación adicional de Hi-C es que solo detecta interacciones por pares. Para detectar interacciones multicontacto, se pueden usar cortadores frecuentes combinados con secuenciación de lectura corta (Illumina)16 o realizar multicontacto 3C29 o 4C30, utilizando secuenciación de lectura larga de plataformas PacBio u Oxford Nanopore. También se han desarrollado derivados de Hi-C para detectar específicamente contactos entre y a lo largo de cromátidas hermanas31,32.
Aunque Hi-C19 y Micro-C33 se pueden usar para generar mapas de contactos a resoluciones subkilobase, ambos requieren una gran cantidad de lecturas de secuenciación y esto puede convertirse en una tarea costosa. Para llegar a una resolución similar o incluso mayor sin los costos, se puede aplicar el enriquecimiento para regiones genómicas específicas (captura-C 34) o interacciones proteicas específicas (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37). La fuerza y la desventaja de estas aplicaciones de enriquecimiento es que solo se muestrea un número limitado de interacciones. Con tales enriquecimientos, el aspecto global de Hi-C (y la opción de normalización global) se pierde.
Importancia y aplicaciones potenciales de Hi-C3.0 Este protocolo fue diseñado para permitir 3C ultraprofundo de alta resolución y, al mismo tiempo, detectar características de plegado a gran escala, como TAD y compartimentos17 (Figura 6). Este protocolo comienza con 5 × 106 celdas por tubo para cada biblioteca Hi-C, que debería ser material más que suficiente para secuenciar uno o dos carriles en una celda de flujo para obtener hasta mil millones de lecturas de extremo emparejado. Para la secuenciación ultraprofunda, se deben preparar múltiples tubos de 5 × 106 células, dependiendo del número de lecturas mapeadas y duplicados de PCR. A la resolución más alta (<1 kb), las interacciones en bucle se encuentran principalmente entre los sitios CTCF, pero también se pueden detectar interacciones promotor-potenciador. Los lectores pueden consultar Akgol Oksuz et al.17 para una descripción detallada del análisis de datos.

La captura de conformación cromosómica se ha utilizado desde 20021. Fundamentalmente, cada variante de captura de conformación se basa en la fijación de las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína para preservar la organización de la cromatina 3D. Esto es seguido por la fragmentación del ADN, generalmente por la digestión de restricción y, finalmente, la religación de los extremos de ADN cercanos para convertir loci espacialmente proximales en secuencias de ADN covalentes únicas. Los protocolos 3C iniciales utilizaron PCR para muestrear interacciones específicas "uno a uno". Los ensayos 4C posteriores permitieron la detección de interacciones "uno a todos"2, mientras que 5C detectó interacciones "muchos a muchos"3. La captura de la conformación cromosómica llegó a buen término después de implementar la secuenciación de alto rendimiento (NGS) de próxima generación, que permitió la detección de interacciones genómicas "todo a todos" utilizando Hi-C4 de todo el genoma y técnicas comparables como 3C-seq5, TCC6 y Micro-C 7,8 (ver también revisión de Denker y De Laat9).
En Hi-C, los nucleótidos biotinilados se utilizan para marcar voladizos 5' después de la digestión y antes de la ligadura (Figura 1). Esto permite la selección de fragmentos adecuadamente digeridos y religados utilizando perlas recubiertas de estreptavidina, diferenciándolo de GCC10. Una importante actualización del protocolo Hi-C fue implementada por Rao et al.11, quienes realizaron la digestión y religación en núcleos intactos (es decir, in situ) para reducir los productos de ligadura espuria. Además, la sustitución de la digestión HindIII con la digestión MboI (o DpnII) redujo el tamaño del fragmento y aumentó el potencial de resolución de Hi-C. Este aumento permitió la detección de estructuras de escala relativamente pequeña y una localización genómica más precisa de puntos de contacto, como bucles de ADN entre pequeños elementos cis, por ejemplo, bucles entre sitios unidos a CTCF generados por extrusión de bucle11,12. Sin embargo, este potencial tiene un costo. En primer lugar, un aumento de dos veces en la resolución requiere un aumento de cuatro veces (22) en las lecturas de secuenciación13. En segundo lugar, los pequeños tamaños de los fragmentos aumentan la posibilidad de confundir fragmentos vecinos no digeridos con fragmentos digeridos y religados14. Como se mencionó, en Hi-C, los fragmentos digeridos y religados difieren de los fragmentos no digeridos por la presencia de biotina en la unión de ligadura. Sin embargo, se requiere una eliminación adecuada de biotina de los extremos no ligados para asegurar que solo las uniones de ligadura se retiren14,15.
Con el costo decreciente de NGS, se hace factible estudiar el plegamiento cromosómico con mayor detalle. Para disminuir el tamaño de los fragmentos de ADN y, por lo tanto, aumentar la resolución, el protocolo Hi-C se puede adaptar para usar enzimas de restricción de corte con mayor frecuencia16 o para usar combinaciones de enzimas de restricción17,18,19. Alternativamente, la MNasa 7,8 en Micro-C y la DNasa en DNasa Hi-C20 pueden ajustarse para lograr una digestión óptima.
Una evaluación sistemática reciente de los fundamentos de los métodos 3C mostró que la detección de características de plegamiento cromosómico en cada escala de longitud mejoró enormemente con la reticulación secuencial con 1% FA seguida de 3 mM DSG17. Además, Hi-C con digestión HindIII fue la mejor opción para detectar características de plegado a gran escala, como compartimentos, y que Micro-C fue superior en la detección de características de plegamiento a pequeña escala, como bucles de ADN. Estos resultados condujeron al desarrollo de una única estrategia de alta resolución "Hi-C 3.0", que utiliza la combinación de reticulantes FA y DSG seguidos de doble digestión con endonucleasas DpnII y DdeI21. Hi-C 3.0 proporciona una estrategia eficaz para uso general porque detecta con precisión las características de plegado en todas las escalas de longitud17. La parte experimental del protocolo Hi-C 3.0 se detalla aquí y se muestran los resultados típicos que se pueden esperar después de la secuenciación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Figura 1: Procedimiento Hi-C en seis pasos. Las celdas se fijan primero con FA y luego con DSG (1). Luego, la lisis precede a una doble digestión con DdeI y DpnII (2). La biotina se agrega por relleno saliente y los extremos romos proximales se ligan (3) antes de la purificación del ADN (4). La biotina se elimina de los extremos no ligados antes de la sonicación y la selección del tamaño (5). Finalmente, la extracción de biotina permite la ligadura del adaptador y la amplificación de la biblioteca por PCR (6). Abreviaturas: FA = formaldehído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; B = Biotina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

La captura de conformación cromosómica (3C) se utiliza para detectar interacciones tridimensionales de la cromatina. Por lo general, la reticulación química con formaldehído (FA) se utiliza para fijar las interacciones de la cromatina. Luego, la digestión de la cromatina con una enzima de restricción y la posterior religación de los extremos del fragmento convierte la proximidad tridimensional (3D) en productos de ligadura únicos. Finalmente, después de la reversión de los enlaces cruzados, la eliminación de proteínas y el aislamiento del ADN, el ADN se corta y se prepara para la secuenciación de alto rendimiento. La frecuencia de ligadura de proximidad de pares de loci es una medida de la frecuencia de su colocalización en el espacio tridimensional en una población celular.
Una biblioteca Hi-C secuenciada proporciona información de todo el genoma sobre las frecuencias de interacción entre todos los pares de loci. La resolución y precisión de Hi-C se basa en una reticulación eficiente que mantiene los contactos de la cromatina y la fragmentación frecuente y uniforme de la cromatina. Este documento describe un protocolo Hi-C in situ mejorado, Hi-C 3.0, que aumenta la eficiencia de la reticulación mediante la combinación de dos reticulantes (formaldehído [FA] y glutarato de disuccinimidil [DSG]), seguido de una digestión más fina utilizando dos enzimas de restricción (DpnII y DdeI). Hi-C 3.0 es un protocolo único para la cuantificación precisa de las características de plegamiento del genoma a escalas más pequeñas, como bucles y dominios de asociación topológica (TAD), así como características a escalas más grandes de todo el núcleo, como los compartimentos.

Las figuras de este manuscrito fueron generadas a partir de un experimento separado y replicado del publicado previamente por Lafontaine et al.21. Después de obtener los datos de secuenciación de alto rendimiento, se utilizó Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) para procesar los datos Hi-C. Una tubería similar se puede encontrar en el portal de datos del proyecto 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Brevemente, el destilador de tuberías Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) se implementó para (1) alinear las secuencias de moléculas Hi-C con el genoma de referencia, (2) analizar la alineación .sam y formar archivos con pares Hi-C, (3) filtrar duplicados de PCR y (4) pares agregados en matrices agrupadas de interacciones Hi-C. Estas matrices formateadas HDF5, llamadas coolers, pueden (1) verse en un servidor HiGlass (https://higlass.io/) y (2) analizarse utilizando un gran conjunto de herramientas computacionales de código abierto presentes en la colección "cooltools" mantenida por Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) para extraer y cuantificar características de plegado como compartimentos, TAD y bucles.
Algunos indicadores de calidad de las bibliotecas Hi-C3.0 se pueden evaluar inmediatamente después de mapear pares de lectura a un genoma de referencia, utilizando algunas métricas / indicadores simples. Primero, típicamente ~ 50% de los pares de lectura secuenciados se pueden mapear de forma única para las células humanas. Debido a la naturaleza polimérica de los cromosomas, la mayoría de estas lecturas mapeadas (~ 60% -90%) representan interacciones dentro de un cromosoma (cis), con frecuencias de interacción que decaen rápidamente con el aumento de la distancia genómica (decaimiento dependiente de la distancia). La desintegración dependiente de la distancia se puede visualizar mejor en un "gráfico de escala", que muestra la probabilidad de contacto (por brazo cromosómico) en función de la distancia genómica. Encontramos que el uso de diferentes reticulantes y enzimas puede alterar la decaimiento dependiente de la distancia a distancias de largo y corto alcance17. La adición de reticulación DSG aumenta la detectabilidad de las interacciones a distancias cortas cuando se combina con enzimas como Mnase y combinaciones de DpnII-DdeI que producen fragmentos más pequeños (Figura 6A).
El decaimiento dependiente de la distancia también se puede observar directamente a partir de matrices de interacción 2D: las interacciones se vuelven más infrecuentes cuando se encuentran más lejos de la diagonal central (Figura 6B). Además, las características de plegamiento genómico, como compartimentos, TAD y bucles, se pueden identificar a partir de matrices Hi-C y gráficos de escala como desviaciones de la desintegración general dependiente de la distancia promedio de todo el genoma. Es importante destacar que la reticulación con DSG además de FA disminuye las ligaduras aleatorias, que no están restringidas debido a la naturaleza polimérica de los cromosomas y, por lo tanto, es más probable que ocurran entre cromosomas (en trans) (Figura 6C). La reducción de la ligadura aleatoria conduce a un aumento de las relaciones señal-ruido, especialmente para las interacciones intracromosómicas intercromosómicas y de muy largo alcance (>10-50 Mb).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Figura 6: Resultados representativos de bibliotecas Hi-C mapeadas y filtradas. (A) Gráficos de escala con probabilidad de contacto y su derivado para varias enzimas, ordenados por longitud de fragmento (arriba) y reticulación con FA o FA + DSG (abajo). La digestión con MNAse (microC) o DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) aumenta significativamente los contactos de corto alcance (arriba) al igual que la adición de DSG a FA (abajo). (B) Las columnas muestran mapas de calor Hi-C de la digestión de DpnII después de la reticulación FA y la digestión de DpnII o DdeI después de la reticulación FA+DSG. Las flechas blancas muestran una fuerza creciente de los "puntos" después de la reticulación DSG y la digestión DdeI, lo que implica una mejor detección de los bucles de ADN. Las filas muestran diferentes partes del cromosoma 3 a resolución creciente, alineándose con el panel C: fila superior: cromosoma 3 completo (0-198,295,559 Mb); fila central: 186-196 Mb; fila inferior: 191.0-191.5 Mb. (C) Gráficos de cobertura para las regiones representadas en A. Las flechas negras muestran la cobertura más baja (%cis reads) para la reticulación solo de FA. Abreviaturas: FA = formaldehído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; CHR = cromosoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
No todas las lecturas asignadas son útiles. Un segundo indicador de calidad es el número de duplicados de PCR. Es muy poco probable que las lecturas duplicadas exactas ocurran por casualidad después de la ligadura y la sonicación. Por lo tanto, tales lecturas probablemente resultaron de la amplificación de PCR y deben filtrarse. Los duplicados a menudo surgen cuando se requieren demasiados ciclos de PCR para amplificar las bibliotecas de baja complejidad. En general, para Hi-C, la mayoría de las bibliotecas solo necesitan de 5 a 8 ciclos de amplificación final de PCR, según lo determinado por la valoración PCR (ver paso 3.9; Figura 4). Sin embargo, se pueden obtener bibliotecas con suficiente complejidad incluso después de 14 ciclos de amplificación por PCR.
Otra categoría de lecturas duplicadas, los llamados duplicados ópticos, pueden surgir del proceso de amplificación en plataformas de secuenciación Illumina que utilizan celdas de flujo con patrones (como HiSeq4000). Los duplicados ópticos se encuentran ya sea por sobrecargar la celda de flujo, causando que los grupos (grandes) se llamen dos grupos separados, o por el reagrupamiento local de la molécula de extremo pareado original después de una primera ronda de PCR. Debido a que ambos tipos de duplicados ópticos son locales, se pueden identificar y distinguir de los duplicados de PCR por su ubicación en la celda de flujo. Mientras que las bibliotecas con >15% de duplicados de PCR necesitarían regeneración, las bibliotecas con duplicados ópticos se pueden volver a cargar después de optimizar el proceso de carga.
Cuadro complementario S1: Tampones y soluciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Este protocolo detecta con precisión las características de plegamiento cromosómico en múltiples escalas de longitud con una señal de fondo baja. Por ejemplo, las interacciones potenciadoras del promotor se pueden analizar en el contexto de los compartimentos cromosómicos. El uso de endonucleasas de restricción evita optimizar el nivel de digestión del material de entrada.No se requiere selección por aislamiento de gel para capturar productos de ligadura. El problema más común es la pérdida de células después de la fijación DSG y la captura de suficiente ADN para producir bibliotecas de alta calidad. Para comenzar, aspire el medio con una pipeta Pasteur acoplada a una trampa de vacío desde la placa de 150 milímetros que contiene 5 por 10 hasta la sexta celdas.Lave las células dos veces con 10 mililitros de HBSS. Para entrecruzar las células, vierta 23.125 mililitros de la solución de formaldehído al 1% en la placa de 15 centímetros. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, meciendo suavemente el plato a mano cada dos minutos.A continuación, agregue 1.25 mililitros de glicina 2.5 molar y agite suavemente la placa para apagar la reacción de reticulación, antes de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Continúe la incubación en hielo durante 15 minutos para detener la reticulación. Raspa las células de la placa con un raspador de celdas o un policía de goma y transfiere la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros con una pipeta.Centrifugar la suspensión a 1.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante por aspiración. Lave el pellet una vez con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS. Luego, centrifugar nuevamente antes de proceder a la reticulación DSG.Para la reticulación con DSG, resuspenda las celdas granuladas en 9,9 mililitros de DPBS. Luego, agregue 100 microlitros de DSG de 300 milimolares. Mezcle el tubo por inversión y entrecruze las celdas a temperatura ambiente durante 40 minutos en un rotador.Después de la reticulación, agregue 1.925 mililitros de glicina 2.5 molar, invierta para mezclar e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, centrifugar las células a 2.000 veces G durante 15 minutos y resuspender el pellet en un mililitro de albúmina sérica bovina al 0,05% DPBS antes de transferirlo a un tubo de 1,7 mililitros. Centrifugar las células a 2.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.Congele el gránulo en nitrógeno líquido antes de proceder a la captura de confirmación cromosómica. Resuspender la alícuota celular reticulada en un mililitro de tampón de lisis helada que contiene 10 microlitros de cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un homogeneizador Dounce durante 15 minutos de incubación en hielo. Mueva lentamente el mortero A hacia arriba y hacia abajo 30 veces para homogeneizar las células e incubar durante un minuto para permitir que las células se enfríen antes de otros 30 golpes.Después del último golpe, transfiera el lisado a un tubo de 1.7 mililitros. Centrifugar la suspensión lisada a 2, 500 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y mueva o vórtice para resuspender la bolita húmeda.Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante para obtener una sustancia similar al yogur con grumos mínimos. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de restricción helado antes de la centrifugación. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en 360 microlitros de tampón de restricción mediante pipeteo después de agregar aproximadamente 340 microlitros al volumen de arrastre del pellet, dependiendo del tamaño de la celda.Reserve 18 microlitros de lisado para probar la integridad de la cromatina, o CI.To el lisado restante, agregue 38 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 1% al tubo hi-C para hacer un volumen total de 380 microlitros y mezcle cuidadosamente pipeteando sin introducir burbujas. Incubar las muestras a 65 grados centígrados sin agitar durante 10 minutos para abrir la cromatina. Luego, coloque inmediatamente el tubo sobre hielo.Después de preparar la mezcla de digestión con Triton X-100, agregue 107 microlitros de esta mezcla al tubo hi-C para hacer un volumen total de 487 microlitros y digiera la cromatina durante la noche a 37 grados centígrados en un termomezclador con agitación a intervalos. Al día siguiente, transfiera las muestras a 65 grados centígrados durante 20 minutos para desactivar la actividad endonucleasa restante. Después de colocar la muestra en hielo, reserve 10 microlitros de control de digestión, o DC, y guárdelos a cuatro grados centígrados.Retire la condensación de la tapa con una pipeta o girando. Luego, agregue 58 microlitros de mezcla de relleno de biotina para hacer un volumen total de 535 microlitros. Pipetear suavemente sin formar burbujas antes de incubar a 23 grados centígrados durante cuatro horas en un termomezclador.Después de la incubación, agregue 665 microlitros de mezcla de ligadura, lo que hace que el volumen de muestra sea de 1, 200 microlitros. Mezclar la muestra pipeteando e incubar a 16 grados centígrados durante cuatro horas en un termomezclador. A continuación, agregue 50 microlitros de proteinasa-K en dos fracciones al tubo de muestra hi-C e incube durante la noche a 65 grados centígrados con agitación a intervalos.Para la purificación del ADN, agregue etanol 100% frío como el hielo y centrifugar los tubos a 18, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante completamente del lado que no sea pellet y seque la muestra al aire durante 10 minutos o hasta que los pellets estén visiblemente secos. Una vez que los pellets estén secos, solubilizarlos en 450 microlitros de Tris bajo-EDTA por pipeteo o remolino.Transfiera la suspensión solubilizada a la unidad de filtro centrífugo de 0,5 milímetros, o UFC, con un límite de peso molecular de tres kilodaltones. Centrifugar la UFC a velocidad máxima durante 10 minutos y desechar el flujo. Después del segundo lavado, agregue 80 microlitros de Tris low-EDTA a la columna.Convertir la columna en un nuevo tubo de recogida durante dos minutos de centrifugación a máxima velocidad. Finalmente, cargue las muestras en un gel de agarosa al 0,8%. El gel de agarosa con resultados de titulación por PCR demostró que la mayoría de las bibliotecas requieren de cinco a ocho ciclos de amplificación final por PCR.La digestión celular de la biblioteca final de PCR amplificada, observada por fragmentos más pequeños en un gel de agarosa, confirma la presencia de uniones de ligadura adecuadas y sirve como un control de calidad antes de la secuenciación. Después de la secuenciación, los datos mapeados mostraron que la combinación de DpnII y DdeI aumenta significativamente los contactos de corto alcance, como la adición de DSG a la reticulación convencional de formaldehído. También se podía observar una señal mejorada a distancias largas y cortas directamente desde matrices de interacción 2D.Las señales de compartimento son CRISPR a largas distancias y los puntos formados por bucles de cromatina son más prominentes a distancias cortas. Además del formaldehído, la reticulación con DSG disminuye las ligaduras aleatorias, mejorando la cobertura relativa en cis. Es importante no perder células durante y después de la reticulación.Los gránulos celulares pueden estar sueltos o ser invisibles, y las células pueden adherirse a las puntas de pipeta en algunos de los tampones.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Investigación

Genética

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Péptido derivado Método para el transporte de genes y proteínas a través de celular y Barreras Organellar en Plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...