Name: capturing chromosome conformation across length scales
Uploaded: 2023-01-20T15:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Protokol geliştirme için Denis Lafontaine'e ve Biyoinformatik yardım için Sergey Venev'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ortak Fonu 4D Nükleom Programı'ndan J.D.'ye (U54-DK107980, UM1-HG011536) verilen bir hibe ile desteklenmiştir. J.D., Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün bir araştırmacısıdır.
Bu makale HHMI'nın Yayınlara Açık Erişim politikasına tabidir. HHMI laboratuvar başkanları daha önce kamuya münhasır olmayan bir CC BY 4.0 lisansı ve araştırma makalelerinde HHMI'ya alt lisanslanabilir bir lisans vermiştir. Bu lisanslar uyarınca, bu makalenin yazar tarafından kabul edilen makalesi, yayınlandıktan hemen sonra CC BY 4.0 lisansı altında serbestçe kullanılabilir hale getirilebilir.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>Simonis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+(4C).">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C).</a> Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).</li><li>Dostie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+(5C):+a+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements.">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions.">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li><li>Kalhor, R., Tjong, H., Jayathilaka, N., Alber, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+architectures+revealed+by+tethered+chromosome+conformation+capture+and+population-based+modeling.">Genome architectures revealed by tethered chromosome conformation capture and population-based modeling.</a> Nature Biotechnology. 30 (1), 90-98 (2012).</li><li>Hsieh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+micro-C.">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li><li>Hsieh, T. -. H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-C+XL:+assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome.">Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Rodley, C. D., Bertels, F., Jones, B., O&#8217;Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+identification+of+yeast+chromosome+interactions+using+Genome+conformation+capture.">Global identification of yeast chromosome interactions using Genome conformation capture.</a> Fungal Genetics and Biology. 46 (11), 879-886 (2009).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Alipour, E., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+domain+structures+by+DNA-loop-extruding+enzymes.">Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 40 (22), 11202-11212 (2012).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker&#8217;s+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker&#8217;s guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li><li>Golloshi, R., Sanders, J. T., McCord, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iteratively+improving+Hi-C+experiments+one+step+at+a+time.">Iteratively improving Hi-C experiments one step at a time.</a> Methods. 142, 47-58 (2018).</li><li>Darrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+DXZ4+on+the+human+inactive+X+chromosome+alters+higher-order+genome+architecture.">Deletion of DXZ4 on the human inactive X chromosome alters higher-order genome architecture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (31), 4504-4512 (2016).</li><li>Akgol Oksuz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays.">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).</li><li>Ghuryeid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Hi-C+links+with+assembly+graphs+for+chromosome-scale+assembly.">Integrating Hi-C links with assembly graphs for chromosome-scale assembly.</a> PLoS Computational Biology. 15 (8), 1007273 (2019).</li><li>Gu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-mapping+of+nuclear+compartments+using+ultra-deep+Hi-C+shows+that+active+promoter+and+enhancer+elements+localize+in+the+active+A+compartment+even+when+adjacent+sequences+do+not.">Fine-mapping of nuclear compartments using ultra-deep Hi-C shows that active promoter and enhancer elements localize in the active A compartment even when adjacent sequences do not.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+3D+genome+architecture+through+in+situ+DNase+Hi-C.">Mapping 3D genome architecture through in situ DNase Hi-C.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2104-2121 (2016).</li><li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+3.0:+Improved+Protocol+for+Genome-Wide+Chromosome+Conformation+Capture.">Hi-C 3.0: Improved Protocol for Genome-Wide Chromosome Conformation Capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).</li><li>Belton, J. -. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+A+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes.">Hi-C: A comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li><li>Truch, J., Telenius, J., Higgs, D. R., Gibbons, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+tackle+challenging+ChIP-Seq,+with+long-range+cross-linking,+Using+ATRX+as+an+example.">How to tackle challenging ChIP-Seq, with long-range cross-linking, Using ATRX as an example.</a> Methods in Molecular Biology. 1832, 105-130 (2018).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing.">In situ chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Current Protocols. 1 (8), 174 (2021).</li><li>Tjong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+3D+genome+structure+analysis+reveals+driving+forces+in+spatial+genome+organization.">Population-based 3D genome structure analysis reveals driving forces in spatial genome organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1663-1672 (2016).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+dynamics+of+chromosomal+organization+at+single-cell+resolution.">Cell-cycle dynamics of chromosomal organization at single-cell resolution.</a> Nature. 547 (7661), 61-67 (2017).</li><li>Ramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+multiplex+single-cell+Hi-C.">Massively multiplex single-cell Hi-C.</a> Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).</li><li>Meng, L., Wang, C., Shi, Y., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Si-C+is+a+method+for+inferring+super-resolution+intact+genome+structure+from+single-cell+Hi-C+data.">Si-C is a method for inferring super-resolution intact genome structure from single-cell Hi-C data.</a> Nature Communications. 12 (1), 4369 (2021).</li><li>Tavares-Cadete, F., Norouzi, D., Dekker, B., Liu, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+3C+reveals+that+the+human+genome+during+interphase+is+largely+not+entangled.">Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 27 (12), 1105-1114 (2020).</li><li>Vermeulen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-contact+4C:+long-molecule+sequencing+of+complex+proximity+ligation+products+to+uncover+local+cooperative+and+competitive+chromatin+topologies.">Multi-contact 4C: long-molecule sequencing of complex proximity ligation products to uncover local cooperative and competitive chromatin topologies.</a> Nature Protocols. 15 (2), 364-397 (2020).</li><li>Oomen, M. E., Hedger, A. K., Watts, J. K., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+chromatin+interactions+between+and+along+sister+chromatids+with+SisterC.">Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC.</a> Nature Methods. 17 (10), 1002-1009 (2020).</li><li>Mitter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+sister+chromatids+in+the+replicated+human+genome.">Conformation of sister chromatids in the replicated human genome.</a> Nature. 586 (7827), 139-144 (2020).</li><li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+Details+of+Mammalian+Chromosome+Architecture.">Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li><li>Hughes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hundreds+of+cis-regulatory+landscapes+at+high+resolution+in+a+single,+high-throughput+experiment.">Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment.</a> Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).</li><li>Fullwood, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome.">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Hücre işleme için kritik adımlar Daha az sayıda giriş hücresi kullanmak mümkün olsa da, bu protokol, derin sıralamadan sonra uygun karmaşıklığı sağlamak için sıralama şeridi başına ~ 5 × 106 hücre (~ 400 M okuma) için optimize edilmiştir. Hücreler en iyi fiksasyondan önce sayılır. Ultra derin kütüphanelerin oluşturulması için, genellikle istenen okuma derinliğine ulaşılana kadar şerit (ve hücre) sayısını çoğaltırız. Optimal fiksasyon için, FA fiksasyonundan önce serum içeren ortam PBS ile değiştirilmeli ve fiksatif çözeltiler derhal ve konsantrasyon gradyanları15,22 olmadan eklenmelidir. Hücre hasadı için, tripsinizasyona göre kazıma tercih edilir, çünkü tripsinizasyondan sonra daha düz bir şekilden küresel bir şekle geçiş, nükleer konformasyonu etkileyebilir. DSG ilavesinden sonra, gevşek ve topaklanmış hücre peletleri kolayca kaybolur. Bu aşamada hücreleri kullanırken dikkatli olun ve kümelenmeyi azaltmak için% 0.05'e kadar BSA ekleyin.
Yöntemdeki değişiklikler Bu protokol insan hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir17. Yine de, kromozom konformasyonu yakalama deneyimine dayanarak, bu protokol çoğu ökaryotik hücre için çalışmalıdır. Önemli ölçüde daha düşük bir giriş için (~ 1 × 106 hücre), lizis ve konformasyon yakalama prosedürleri için hacimlerin yarısını kullanmanızı öneririz [adım 2.1-2.4]. Bu aynı zamanda DNA izolasyonunun [adım 2.5] 1.7 mL tüplere sahip bir masa üstü santrifüjde gerçekleştirilmesine izin verecek ve bu da düşük DNA konsantrasyonları için peletlemeyi iyileştirebilecektir. DNA'nın nicelleştirilmesi (adım 2.6.6) nasıl ilerleneceğini gösterecektir. Düşük miktarlarda izole DNA (1-5 μg) için, boyut seçimini atlamanızı (adım 3.3) ve hacmi bir CFU ile 130 μL'den ~ 45 μL'ye düşürdükten sonra biyotin çıkarılmasına devam etmenizi öneririz.
Bu protokol, FA ve DSG ile daha sonra çapraz bağlandıktan ve DpnII ve DdeI ile sindirimden sonra yüksek kaliteli veriler sağlamak için özel olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ChIP-seq23 ve ChIA-PET24'te de kullanılan FA ve ardından EGS (etilen glikol bis (süksinimidil süksinat)) gibi alternatif çapraz bağlama stratejileri eşit derecede iyi çalışabilir17. Benzer şekilde, sindirim için DpnII ve HinfI18 veya MboI, MseI ve NlaIII19 gibi farklı enzim kombinasyonları kullanılabilir. Enzim kombinasyonlarını uyarlarken, spesifik 5' çıkıntıları doldurabilen ve her kokteyl için en uygun tamponları kullanabilen biyotinile nükleotidleri kullandığınızdan emin olun. DpnII kendi tamponu ile birlikte gelir ve enzim üreticisi DdeI sindirimi için özel bir tampon önerir. Bununla birlikte, bu protokolde DpnII ve DdeI ile çift sindirim için, Kısıtlama Tamponu önerilir, çünkü her iki enzim için% 100 aktivitede derecelendirilmiştir.
Konformasyon yakalama sorunlarını giderme Kromozom konformasyonu yakalamadaki üç temel adım: çapraz bağlama, sindirim ve religasyon, sonuçlar jel üzerinde görselleştirilmeden önce gerçekleştirilmiştir. Bu üç adımın her birinin kalitesini belirlemek ve sorunların nerede ortaya çıkmış olabileceğini ayırt etmek için, sindirimden önce (CI) ve sonra (DC) alikotlar alınır ve bağlı Hi-C örneği ile birlikte jel üzerine yüklenir (Şekil 2). Bu jel, Hi-C örneğinin kalitesini ve protokole devam etmeye değip değmeyeceğini belirlemek için kullanılır. CI ve DC olmadan, potansiyel suboptimal adım (lar) ı belirlemek zordur. Suboptimal ligasyonun, ligasyonun kendisindeki bir sorundan, doldurmadan veya çapraz bağlama ile ilgili bir problemden kaynaklanabileceğini belirtmek gerekir. Çapraz bağlama sorunlarını gidermek için, kütüphane başına 1 × 107 hücreden fazlasını kullanmadığınızdan ve yeni çapraz bağlama reaktifleri ve temiz hücrelerle (yani, PBS ile durulanır) başlamadığınızdan emin olun. Ligasyon için, hücrelerin ve ligasyon karışımının buz üzerinde tutulduğundan emin olun. 16 ° C'de 4 saatlik inkübasyondan hemen önce T4 DNA ligazını ekleyin ve iyice karıştırın.
Sorun giderme kitaplığı hazırlığı PCR titrasyonundan sonra jel üzerinde 10'dan fazla PCR döngüsüne ihtiyaç duyuluyorsa veya PCR ürünü görülmüyorsa (Şekil 4), Hi-C numunesini kaydetmek için birkaç seçenek vardır. PCR titrasyonundan geri döndüğünüzde, ilk seçenek PCR'yi tekrar denemektir. Hala yeterli ürün yoksa, boncukları 1x TLE tamponuyla iki kez yıkadıktan sonra başka bir A-tailing ve adaptör ligasyonu (adım 3.6) denemesi mümkündür. Bu ek A-tailing ve adaptör ligasyonundan sonra, daha önce olduğu gibi PCR titrasyonuna geçilebilir. Hala bir ürün yoksa, son seçenek adım 3.3'ten 0.8x fraksiyonunu seslendirmek ve oradan devam etmektir.
Hi-C3.0'ın sınırlamaları ve avantajları Hi-C'nin, hücre popülasyonundaki lokus çiftleri arasındaki etkileşimlerin ortalama sıklığını yakalayan popülasyon tabanlı bir yöntem olduğunu anlamak önemlidir. Bazı hesaplamalı analizler, bir popülasyon25'ten konformasyon kombinasyonlarını çözmek için tasarlanmıştır, ancak prensip olarak, Hi-C hücreler arasındaki farklılıklara kördür. Tek hücreli Hi-C 26,27 yapmak mümkün olsa da ve hesaplamalı çıkarımlar 28 yapılabilse de, tek hücreli Hi-C ultra yüksek çözünürlüklü 3C bilgisi elde etmek için uygun değildir. Hi-C'nin ek bir sınırlaması, yalnızca çift yönlü etkileşimleri algılamasıdır. Çok temaslı etkileşimleri tespit etmek için, kısa okuma dizilimi (Illumina)16 ile birlikte sık kesiciler kullanılabilir veya PacBio veya Oxford Nanopore platformlarından uzun okuma dizilemesi kullanarak çok temaslı 3C29 veya 4C30 gerçekleştirilebilir. Kardeş kromatitler arasındaki ve boyunca temasları özel olarak tespit etmek için Hi-C türevleri de geliştirilmiştir31,32.
Hi-C19 ve Micro-C33, kilobaz altı çözünürlüklerde temas haritaları oluşturmak için kullanılabilse de, her ikisi de büyük miktarda sıralama okuması gerektirir ve bu maliyetli bir girişim haline gelebilir. Maliyet olmadan benzer veya daha yüksek çözünürlüğe ulaşmak için, spesifik genomik bölgeler (capture-C 34) veya spesifik protein etkileşimleri (ChiA-PET 35, PLAC-seq36, Hi-ChIP37) için zenginleştirme uygulanabilir. Bu zenginleştirme uygulamalarının gücü ve dezavantajı, yalnızca sınırlı sayıda etkileşimin örneklenmesidir. Bu tür zenginleştirmelerle, Hi-C'nin küresel yönü (ve küresel normalleşme seçeneği) kaybolur.
Hi-C3.0'ın önemi ve potansiyel uygulamaları Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, ultra derin 3C'yi mümkün kılarken aynı zamanda TAD'ler ve bölmeler17 gibi büyük ölçekli katlama özelliklerini de algılamak için tasarlanmıştır (Şekil 6). Bu protokol, her Hi-C kütüphanesi için tüp başına 5 × 106 hücre ile başlar; bu, 1 milyara kadar çift uçlu okuma elde etmek için bir akış hücresi üzerinde bir veya iki şeridi sıralamak için fazlasıyla yeterli malzeme olmalıdır. Ultra derin dizileme için, haritalanan okumaların ve PCR kopyalarının sayısına bağlı olarak 5 × 106 hücreli çoklu tüpler hazırlanmalıdır. En yüksek çözünürlükte (<1 kb), döngüsel etkileşimler çoğunlukla CTCF bölgeleri arasında bulunur, ancak destekleyici-arttırıcı etkileşimler de tespit edilebilir. Okuyucular, veri analizinin ayrıntılı bir açıklaması için Akgöl Oksuz ve ark.17'ye başvurabilirler.

Kromozom konformasyon yakalama 2002 yılından beri kullanılmaktadır1. Temel olarak, her konformasyon yakalama varyantı, 3D kromatin organizasyonunu korumak için DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerinin sabitlenmesine dayanır. Bunu DNA parçalanması, genellikle kısıtlama sindirimi izler ve son olarak, uzamsal olarak proksimal lokusları benzersiz kovalent DNA dizilerine dönüştürmek için yakındaki DNA uçlarının bağlanması. İlk 3C protokolleri, spesifik "bire bir" etkileşimleri örneklemek için PCR'yi kullandı. Sonraki 4C analizleri "bire bir" etkileşimlerin 2'sinin tespitine izin verirken, 5C "çok-çok" etkileşimleritespit etti 3. Kromozom konformasyon yakalama, genom çapında Hi-C4 ve 3C-seq5, TCC6 ve Micro-C7,8 gibi karşılaştırılabilir teknikler kullanılarak "hepsi bir arada" genomik etkileşimlerin tespit edilmesine izin veren yeni nesil, yüksek verimli dizilemeyi (NGS) uyguladıktan sonra tam meyvesini verdi (ayrıca Denker ve De Laat9 tarafından yapılan incelemeye bakınız).
Hi-C'de, biyotinile nükleotidler, sindirimden sonra ve ligasyondan önce 5' çıkıntıları işaretlemek için kullanılır (Şekil 1). Bu, streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak uygun şekilde sindirilmiş ve bağlanmış parçaların seçilmesine izin verir ve GCC10'dan ayrılır. Hi-C protokolünde önemli bir güncelleme, sahte ligasyon ürünlerini azaltmak için bozulmamış çekirdeklerde (yani in situ) sindirim ve religasyonu gerçekleştiren Rao ve ark.11 tarafından uygulanmıştır. Dahası, HindIII sindirimini MboI (veya DpnII) sindirimi ile değiştirmek, parça boyutunu azalttı ve Hi-C'nin çözünürlük potansiyelini arttırdı. Bu artış, nispeten küçük ölçekli yapıların tespitine ve küçük cis elementleri arasındaki DNA döngüleri, örneğin döngü ekstrüzyonu11,12 tarafından üretilen CTCF'ye bağlı bölgeler arasındaki döngüler gibi temas noktalarının daha kesin bir genomik lokalizasyonuna izin verdi. Ancak, bu potansiyelin bir bedeli vardır. İlk olarak, çözünürlükte iki kat artış, sıralamada dört kat (2 2) artış gerektirir13 okur. İkincisi, küçük parça boyutları, sindirilmemiş ve bağlanmış parçalar için sindirilmemiş komşu parçaların yanlış alınması olasılığını arttırır14. Belirtildiği gibi, Hi-C'de, sindirilmiş ve bağlanmış fragmanlar, ligasyon kavşağında biyotin varlığı ile sindirilmemiş fragmanlardan farklıdır. Bununla birlikte, sadece ligasyon bağlantılarının14,15 aşağı çekilmesini sağlamak için bağlanmamış uçlardan uygun biyotin çıkarılması gerekir.
NGS'nin azalan maliyeti ile kromozom katlanmasını daha ayrıntılı olarak incelemek mümkün hale gelir. DNA fragmanlarının boyutunu azaltmak ve böylece çözünürlüğü artırmak için, Hi-C protokolü daha sık kesme kısıtlama enzimleri16 veya kısıtlama enzimleri kombinasyonlarını kullanmak için uyarlanabilir17,18,19. Alternatif olarak, Micro-C'deki MNase 7,8 ve DNase Hi-C20'deki DNase, optimum sindirim elde etmek için titre edilebilir.
3C yöntemlerinin temellerinin yakın tarihli bir sistematik değerlendirmesi, her uzunluk ölçeğinde kromozom katlama özelliklerinin tespitinin,% 1 FA ile sıralı çapraz bağlanma ve ardından 3 mM DSG17 ile büyük ölçüde geliştiğini göstermiştir. Ayrıca, HindIII sindirimli Hi-C, bölmeler gibi büyük ölçekli katlama özelliklerini tespit etmek için en iyi seçenekti ve Micro-C, DNA döngüleri gibi küçük ölçekli katlama özelliklerini tespit etmede üstündü. Bu sonuçlar, FA ve DSG çapraz bağlayıcılarının kombinasyonunu kullanan ve ardından DpnII ve DdeI endonükleazları21 ile çift sindirimi kullanan tek, yüksek çözünürlüklü bir "Hi-C 3.0" stratejisinin geliştirilmesine yol açtı. Hi-C 3.0, tüm uzunluk ölçeklerinde katlama özelliklerini doğru bir şekilde algıladığı için genel kullanım için etkili bir strateji sağlar17. Hi-C 3.0 protokolünün deneysel kısmı burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve sıralamadan sonra beklenebilecek tipik sonuçlar gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig01.jpg"> Şekil 1: Altı adımda Hi-C prosedürü. Hücreler önce FA, sonra DSG ile sabitlenir (1). Daha sonra, lizis, DdeI ve DpnII ile çift sindirimden önce gelir (2). Biotin, çıkıntı dolgusu ile eklenir ve DNA saflaştırmasından (4) önce proksimal körelmiş uçlar bağlanır (3). Biotin, sonikasyon ve boyut seçiminden önce bağlanmamış uçlardan çıkarılır (5). Son olarak, biyotinin aşağı çekilmesi, PCR ile adaptör ligasyonu ve kütüphane amplifikasyonuna izin verir (6). Kısaltmalar: FA = formaldehit; DSG = dissüksinimidil glutarat; B = Biotin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3232L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC500396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annealing Buffer (5x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP 10 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beckman ultracentrifuge tube 35 mL</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding Buffer (2x)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-14-dATP 0.4 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>dilute from 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical polypropylene tubes 50 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1062-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 &#181;L</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045/520077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris Sonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>E220/E220evolution/M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask 175 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates 150 mm x 25 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 1 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dATP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdeI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0175L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix 25 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>8853010002/8853030002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSG</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>20593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dTTP 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A409-4</td>
			<td>Diluted from 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1302-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading dye (6x )</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine in ultrapure water 2.5 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630 detergent</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>198596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow DNA polymerase 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Fragment 3--&#62;5&#8217; exo-, 5 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ligation buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Particle separator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes 1.7 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Streptavidin C1 beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3.1 (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR (strip) tubes</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>TBS0201/ TCS0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermocycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu Ultra II Buffer (10x)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Comes with Pfu Ultra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tube 15 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase lock tubes 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Argos technologies</td>
			<td>EW-04397-40 or rocking platform</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 1%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP13111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate pH = 5.2, 3 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase 1 U/&#181;L</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>100004817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase 3 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligation buffer (5x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y90001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase 10 U/&#181;L</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Low EDTA Buffer (TLE)</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (10%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq adapter oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT))</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry</td>
			<td>250 nmole and HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 detergent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween Wash Buffer</td>
			<td>See recipe in supplemental materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>(G560)SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing chromosome conformation across length scales

Kromozom konformasyon yakalama (3C), üç boyutlu kromatin etkileşimlerini tespit etmek için kullanılır. Tipik olarak, kromatin etkileşimlerini düzeltmek için formaldehit (FA) ile kimyasal çapraz bağlanma kullanılır. Daha sonra, bir kısıtlama enzimi ile kromatin sindirimi ve ardından parça uçlarının bağlanması, üç boyutlu (3D) yakınlığı benzersiz ligasyon ürünlerine dönüştürür. Son olarak, çapraz bağların tersine çevrilmesi, protein uzaklaştırılması ve DNA izolasyonundan sonra, DNA kesilir ve yüksek verimli dizileme için hazırlanır. Lokus çiftlerinin yakınlık ligasyonu sıklığı, bir hücre popülasyonunda üç boyutlu uzayda kolokalizasyon sıklığının bir ölçüsüdür.
Sıralanmış bir Hi-C kütüphanesi, tüm lokus çiftleri arasındaki etkileşim frekansları hakkında genom çapında bilgi sağlar. Hi-C'nin çözünürlüğü ve hassasiyeti, kromatin temaslarını ve kromatinin sık ve düzgün parçalanmasını sağlayan verimli çapraz bağlamaya dayanır. Bu yazıda, iki çapraz bağlayıcıyı (formaldehit [FA] ve dissüksinimidil glutarat [DSG]) birleştirerek çapraz bağlamanın verimliliğini artıran, ardından iki kısıtlama enzimi (DpnII ve DdeI) kullanılarak daha ince bir sindirim ile geliştirilmiş bir in situ Hi-C protokolü olan Hi-C 3.0 açıklanmaktadır. Hi-C 3.0, döngüler ve topolojik olarak ilişkili alanlar (TAD'lar) gibi daha küçük ölçeklerde genom katlama özelliklerinin ve ayrıca bölmeler gibi daha büyük çekirdek genişliğindeki ölçeklerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesi için tek bir protokoldür.

Bu makaledeki rakamlar, daha önce Lafontaine ve ark.21 tarafından yayınlanmış olanın ayrı, tekrarlanan bir deneyinden oluşturulmuştur. Yüksek verimli sıralama verileri elde edildikten sonra, Hi-C verilerini işlemek için Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) kullanıldı. Benzer bir boru hattı, 4D Nucleome projesinin veri portalında bulunabilir (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kısaca, Nextflow boru hattı damıtıcısı (https://github.com/open2c/distiller-nf), (1) Hi-C moleküllerinin dizilerini referans genoma hizalamak, (2) .sam hizalamasını ayrıştırmak ve Hi-C çiftleriyle dosyaları oluşturmak, (3) PCR kopyalarını filtrelemek ve (4) çiftleri Hi-C etkileşimlerinin bağlanmış matrislerine toplamak için uygulanmıştır. Soğutucular olarak adlandırılan bu HDF5 formatlı matrisler daha sonra (1) bir HiGlass sunucusunda (https://higlass.io/) görüntülenebilir ve (2) bölmeler, TAD'lar ve döngüler gibi katlanma özelliklerini çıkarmak ve ölçmek için Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) tarafından tutulan "cooltools" koleksiyonunda bulunan çok sayıda açık kaynaklı hesaplama aracı kullanılarak analiz edilebilir.
Hi-C3.0 kütüphanelerinin bazı kalite göstergeleri, okuma çiftlerini birkaç basit metrik/gösterge kullanılarak bir referans genomla eşleştirdikten hemen sonra değerlendirilebilir. İlk olarak, sıralı okuma çiftlerinin tipik olarak ~% 50'si insan hücreleri için benzersiz bir şekilde eşlenebilir. Kromozomların polimerik doğası nedeniyle, bu haritalanmış okumaların çoğu (~% 60-% 90), bir kromozom (cis) içindeki etkileşimleri temsil eder ve etkileşim frekansları artan genomik mesafe (mesafeye bağlı bozunma) ile hızla bozunur. Mesafeye bağlı bozunum, genomik mesafenin bir fonksiyonu olarak temas olasılığını (kromozom kolu başına) gösteren bir "ölçekleme grafiğinde" en iyi şekilde görselleştirilebilir. Farklı çapraz bağlayıcıların ve enzimlerin kullanılmasının, uzun ve kısa menzilli mesafelerde mesafeye bağlı bozunmayı değiştirebileceğinibulduk17. DSG çapraz bağlamanın eklenmesi, Mnase gibi enzimler ve daha küçük parçalar üreten DpnII-DdeI kombinasyonları ile birleştirildiğinde kısa mesafelerdeki etkileşimlerin tespit edilebilirliğini arttırır (Şekil 6A).
Mesafeye bağlı bozunma doğrudan 2B etkileşim matrislerinden de gözlemlenebilir: etkileşimler merkezi diyagonalden daha uzağa yerleştirildiğinde daha seyrek hale gelir (Şekil 6B). Ek olarak, bölmeler, TAD'lar ve döngüler gibi genomik katlama özellikleri, Hi-C matrislerinden ve ölçekleme grafiklerinden genel genom çapında ortalama mesafeye bağlı bozunumdan sapmalar olarak tanımlanabilir. Önemli olarak, FA'ya ek olarak DSG ile çapraz bağlanma, kromozomların polimer doğası nedeniyle sınırsız olan rastgele ligasyonları azaltır ve bu nedenle kromozomlar arasında (trans halinde) meydana gelme olasılığı daha yüksektir (Şekil 6C). Rastgele ligasyonun azaltılması, özellikle kromozomaller arası ve çok uzun menzilli (>10-50 Mb) kromozomal etkileşimler için sinyal-gürültü oranlarının artmasına neden olur.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2.jpg"> Şekil 6: Haritalanmış ve filtrelenmiş Hi-C kütüphanelerinin temsili sonuçları . (A) Parça uzunluğuna (üstte) göre sıralanmış ve FA veya FA + DSG (altta) ile çapraz bağlanan çeşitli enzimler için temas olasılığı ve türevi olan ölçekleme grafikleri. MNAse (microC) veya DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) ile sindirim, DSG'nin FA'ya (altta) eklenmesiyle birlikte kısa menzilli temasları (üstte) önemli ölçüde artırır. (B) Sütunlar, sadece FA çapraz bağlamadan sonra DpnII sindiriminin ve FA + DSG çapraz bağlamadan sonra DpnII veya DdeI sindiriminin Hi-C ısı haritalarını gösterir. Beyaz oklar, DSG çapraz bağlama ve DdeI sindiriminden sonra "noktaların" artan gücünü gösterir ve DNA döngülerinin daha iyi tespit edilmesini sağlar. Satırlar, C paneliyle hizalanarak artan çözünürlükte kromozom 3'ün farklı kısımlarını gösterir: üst sıra: tüm kromozom 3 (0-198.295.559 Mb); orta sıra: 186-196 Mb; alt satır: 191,0-191,5 Mb. (C) A'da gösterilen bölgeler için kapsama grafikleri. Siyah oklar, yalnızca FA çapraz bağlama için daha düşük kapsama alanını (%cis okumaları) gösterir. Kısaltmalar: FA = formaldehit; DSG = dissüksinimidil glutarat; chr = kromozom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Eşlenen tüm okumalar yararlı değildir. İkinci bir kalite göstergesi, PCR kopyalarının sayısıdır. Tam yinelenen okumaların, ligasyon ve sonikasyondan sonra tesadüfen gerçekleşmesi pek olası değildir. Bu nedenle, bu tür okumalar muhtemelen PCR amplifikasyonundan kaynaklanmıştır ve filtrelenmesi gerekir. Kopyalar genellikle düşük karmaşıklıktaki kütüphaneleri büyütmek için çok fazla PCR döngüsü gerektiğinde ortaya çıkar. Genel olarak, Hi-C için, çoğu kütüphanenin titrasyon PCR tarafından belirlendiği gibi yalnızca 5-8 döngü nihai PCR amplifikasyonuna ihtiyacı vardır (bkz. adım 3.9; Şekil 4). Bununla birlikte, yeterli karmaşıklığa sahip kütüphaneler, 14 döngü PCR amplifikasyonundan sonra bile elde edilebilir.
Optik kopyalar olarak adlandırılan başka bir yinelenen okuma kategorisi, desenli akış hücreleri (HiSeq4000 gibi) kullanan Illumina dizileme platformlarındaki amplifikasyon işleminden kaynaklanabilir. Optik kopyalar, akış hücresinin aşırı yüklenmesinden, (büyük) kümelerin iki ayrı küme olarak adlandırılmasına neden olmasından veya PCR'nin ilk turundan sonra orijinal çift uçlu molekülün yerel olarak yeniden kümelenmesinden bulunur. Her iki optik kopya türü de yerel olduğundan, akış hücresindeki konumlarına göre PCR kopyalarından tanımlanabilir ve ayırt edilebilirler. %15 > PCR kopyalarına sahip kütüphanelerin yenilenmesi gerekirken, optik kopyalara sahip kütüphaneler yükleme işlemini optimize ettikten sonra yeniden yüklenebilir.
Ek Tablo S1: Tamponlar ve çözeltiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64001/64001_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales at JoVE.com

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Bu protokol, düşük bir arka plan sinyaliyle birden fazla uzunluk ölçeğinde kromozom katlama özelliklerini doğru bir şekilde algılar. Örneğin, promotör arttırıcı etkileşimleri, kromozom bölmeleri bağlamında analiz edilebilir. Kısıtlama endonükleazlarının kullanımı, girdi materyalinin sindirim seviyesini optimize etmeyi engeller.Ligasyon ürünlerini yakalamak için jel izolasyonu ile seçim gerekmez. En yaygın sorun, DSG fiksasyonundan sonra hücrelerin kaybı ve yüksek kaliteli kütüphaneler üretmek için yeterli DNA'nın yakalanmasıdır. Başlamak için, ortamı 5 x 10 içeren 150 milimetrelik plakadan altıncı hücrelere kadar bir vakum kapanına bağlı bir Pasteur pipetle aspire edin.Hücreleri 10 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın. Hücreleri çapraz bağlamak için,% 1'lik formaldehit çözeltisinin 23.125 mililitresini 15 santimetrelik plakaya dökün. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin, plakayı her iki dakikada bir elle hafifçe sallayın.Daha sonra, 1.25 mililitre 2.5 molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmeden önce, çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürmek için plakayı yavaşça döndürün. Çapraz bağlamayı durdurmak için 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyona devam edin. Hücreleri plakadan bir hücre kazıyıcı veya kauçuk polisi ile kazıyın ve hücre süspansiyonunu pipetli 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın. Peleti bir kez 10 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya DPBS ile yıkayın. Ardından, DSG çapraz bağlamaya geçmeden önce tekrar santrifüj yapın.DSG ile çapraz bağlantı için, peletlenmiş hücreleri 9.9 mililitre DPBS içinde yeniden askıya alın. Ardından, 100 mikrolitre 300 milimolar DSG ekleyin. Tüpü ters çevirerek karıştırın ve hücreleri oda sıcaklığında bir rotatorda 40 dakika boyunca çapraz bağlayın.Çapraz bağlamadan sonra, 1.925 mililitre 2.5 molar glisin ekleyin, karıştırmak için ters çevirin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca 2.000 kez G'de santrifüj edin ve peleti 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce bir mililitre% 0.05 sığır serum albümin DPBS'sinde yeniden askıya alın. Hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2.000 kez G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.Kromozom onay yakalamaya geçmeden önce peleti sıvı azot içinde anında dondurun. Çapraz bağlı hücre alikotunu, 10 mikrolitre proteaz inhibitörü kokteyli içeren bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın ve buz üzerinde 15 dakikalık inkübasyon için bir Dounce homojenizatörüne aktarın. Hücreleri homojenize etmek için havaneli A'yı yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin ve hücrelerin 30 vuruştan önce soğumasını sağlamak için bir dakika boyunca inkübe edin.Son vuruştan sonra, lizatı 1.7 mililitrelik bir tüpe aktarın. Lised süspansiyonu beş dakika boyunca 2.500 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve ıslak peleti yeniden askıya almak için hafifçe veya girdap yapın.Minimum kümelerle yoğurt benzeri bir madde elde etmek için süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Santrifüjlemeden önce peleti 500 mikrolitre buz gibi soğuk kısıtlama tamponunda yeniden askıya alın. İkinci yıkamadan sonra, hücre boyutuna bağlı olarak, peletin taşıma hacmine yaklaşık 340 mikrolitre ekledikten sonra pipetle pipetleyerek peleti 360 mikrolitre kısıtlama tamponunda yeniden askıya alın.Kromatin bütünlüğünü test etmek için 18 mikrolitre lizat ayırın veya kalan lizatı CI.To, toplam 380 mikrolitre hacim oluşturmak için hi-C tüpüne 38 mikrolitre% 1 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve kabarcıklar sokmadan pipetle dikkatlice karıştırın. Kromatini açmak için numuneleri 10 dakika boyunca sallamadan 65 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tüpü hemen buzun üzerine yerleştirin.Triton X-100 ile sindirim karışımını hazırladıktan sonra, toplam 487 mikrolitre hacim yapmak için bu karışımın 107 mikrolitresini hi-C tüpüne ekleyin ve kromatini aralıklı çalkalama ile bir termomikserde gece boyunca 37 santigrat derecede sindirin. Ertesi gün, kalan endonükleaz aktivitesini devre dışı bırakmak için örnekleri 20 dakika boyunca 65 santigrat dereceye aktarın. Numuneyi buz üzerine yerleştirdikten sonra, 10 mikrolitre sindirim kontrolü veya DC ayırın ve dört santigrat derecede saklayın.Yoğuşmayı kapaktan pipetle veya eğirerek çıkarın. Daha sonra, toplam 535 mikrolitre hacim oluşturmak için 58 mikrolitre biyotin doldurma karışımı ekleyin. Bir termomikserde dört saat boyunca 23 santigrat derecede inkübe etmeden önce kabarcık oluşturmadan yavaşça pipet alın.Kuluçkadan sonra, 665 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyerek numune hacmini 1.200 mikrolitre yapın. Numuneyi pipetleyerek, karıştırın ve bir termomikserde dört saat boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, hi-C numune tüpüne iki fraksiyonda 50 mikrolitre proteinaz-K ekleyin ve aralıklı sallama ile 65 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.DNA saflaştırması için,% 100 buz gibi soğuk etanol ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı pelet olmayan taraftan tamamen çıkarın ve numuneyi 10 dakika boyunca veya peletler gözle görülür şekilde kuruyana kadar havayla kurutun. Peletler kuruduktan sonra, pipetleme veya döndürme yoluyla 450 mikrolitre Tris low-EDTA'da çözünür.Çözünür süspansiyonu, üç kilodalton moleküler ağırlık kesimi ile 0,5 milimetre santrifüj filtre ünitesine veya CFU'ya aktarın. CFU'yu 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın ve akışı atın. İkinci yıkamadan sonra, kolona 80 mikrolitre Tris düşük EDTA ekleyin.Kolonu maksimum hızda iki dakikalık santrifüjleme için yeni bir toplama tüpüne dönüştürün. Son olarak, numuneleri% 0.8'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin. PCR titrasyon sonuçlarına sahip Agarose jeli, çoğu kütüphanenin beş ila sekiz döngü nihai PCR amplifikasyonu gerektirdiğini göstermiştir.Son güçlendirilmiş PCR kütüphanesinin hücre sindirimi, bir agaroz jeli üzerindeki daha küçük parçalar tarafından gözlemlendiği gibi, uygun ligasyon bağlantılarının varlığını doğrular ve sıralamadan önce bir kalite kontrolü görevi görür. Sıralamadan sonra, haritalanan veriler, DpnII ve DdeI kombinasyonunun, geleneksel formaldehit çapraz bağlamaya DSG eklenmesiyle kısa menzilli temasları önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Geliştirilmiş bir sinyal, doğrudan 2D etkileşim matrislerinden uzun ve kısa mesafelerde de gözlemlenebilir.Kompartman sinyalleri uzun mesafelerde CRISPR'dir ve kromatin döngüleri tarafından oluşturulan noktalar kısa mesafelerde daha belirgindir. Formaldehit'e ek olarak, DSG ile çapraz bağlanma, rastgele ligasyonları azaltır ve cis'teki göreceli kapsamı iyileştirir. Çapraz bağlama sırasında ve sonrasında hücreleri kaybetmemek önemlidir.Hücre peletleri gevşek veya görünmez olabilir ve hücreler bazı tamponlardaki pipet uçlarına yapışabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Hızlandırılmış radyasyon Biodosimetry tarafından otomatik Disentrik kromozom tanımlama (ADCI) ve doz tahmini

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...