Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم HC من خلال منحة P20GM134973 من المعاهد الوطنية للصحة. يتم دعم KB من خلال منحة مؤسسة مستشفى الأطفال (CHF) ومؤسسة الصحة المشيخية (PHF). نشكر مختبر البيولوجيا الجزيئية وأبحاث قياس الخلايا في OUHSC على استخدام المرفق الأساسي ، الذي يوفر التصوير البؤري المنسق.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما. تم الحصول على عينات راحة الأمعاء الدقيقة من الرئيسيات غير البشرية الخدج (NHP ، 90٪ من الحمل ، البابون الزيتون ، Papio anubis) بعد القتل الر?...

يسمح التطور الأخير للنماذج المعوية المشتقة من الخبايا الظهارية المعوية بأنسجة مختبرية أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة التسبب في التهاب الأمعاء والقولون الناخر. على الرغم من تضمين جميع أنواع الخلايا المتمايزة الرئيسية في ظهارة الأمعاء ، إلا أن الأمعاء 3D لا تزال تخضع للعدي...

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) ، وهو مرض التهابي حاد في الأمعاء الدقيقة يحدث في ما يصل إلى 10 ٪ من الأطفال الخدج ، يرتبط عادة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات 1,2. معدلات الوفيات التي تقترب من 50٪ في الرضع ذوي الوزن المنخفض جدا عند الولادة (<1500 جم) ، الذين يحتاجون إلى تدخل جراحي ، ليست غير شائعة3. في حين أن المسببات الدقيقة ل NEC غير مفهومة حاليا ، يعتقد أن عوامل الخطر ، مثل التغذية بالصيغة ، تتضاعف مع الشذوذ الفسيولوجي ، مثل dysbiosis ، وظهارة معوية غير ناضجة ، وحاجز معوي مختل وظيفيا ، في تطور المرض 2,4. على الرغم من الجهود الكبيرة المبذولة ، لم يحدث تقدم يذكر في الوقاية أو العلاج من NEC خلال العقد الماضي5. هناك حاجة إلى طريقة جديدة في المختبر لدراسة NEC واختلال الحاجز الظهاري المعوي المرتبط بها لتعزيز فهم التسبب في المرض ، حيث أن النتائج المستخلصة من النماذج الحيوانية قد ترجمت ، حتى الآن ، بشكل سيئ إلى جانب السرير6.
تم استخدام عدد من النماذج في المختبر للتحقيق في الآليات التي تعمل خلال NEC. خط الخلايا الظهارية المعوية البشرية ، Caco-2 ، هو من بين النماذج الأكثر استخداما في المختبر من NEC 7,8. تحاكي خلايا Caco-2 السمات المورفولوجية لحدود الفرشاة للأمعاء الدقيقة ، ولكن ، كخط خلوي ، لا تتمايز في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الجسم الحي ، بما في ذلك الخلايا الكأسية المنتجة للمخاط ، المطلوبة لنموذج قابل للترجمة بدرجة عالية. HT-29-MTX ، خلايا سرطان القولون الغدي البشري ، تشمل الخلايا المعوية المختلطة والنمط الظاهري لخلية الكأس ، ولكنها لا تزال تفتقر إلى أنواع الخلايا القائمة على السرداب من الظهارة المعوية9. IEC-6 و IEC-18 عبارة عن خطوط خلوية غير محولة ذات مورفولوجيا غير ناضجة تشبه السرداب اللفائفي ولكنها غير مشتقة من الأنسجة البشرية ، مما يحد من قدرتها الانتقالية. تستمد خطوط الخلايا المعوية FHs 74-Int و H4 من أنسجة الجنين البشري ولا تشكل تقاطعات ضيقة أو طبقات أحادية مستقطبة10,11 ، وبالتالي فهي غير ناضجة مقارنة حتى بأكثر الأطفال الخدج عرضة ل NEC. عادة ، تستخدم نماذج NEC في المختبر علاجات عديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على مستقبلات تشبه الرسوم 4 (TLR4) ، وهي مستقبل رئيسي يبدأ التهاب الأمعاء في NEC12. غالبا ما يستخدم الضرر الذي يتم بوساطة معالجة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، عادة عن طريق بيروكسيد الهيدروجين ، للحث على تلف الأكسدة الشبيه ب NEC وموت الخلايا المبرمج13,14. كمحرك رئيسي لالتهاب الأمعاء ، يستخدم عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وهو مكون مصب لإشارات TLR4 الالتهابية ، بشكل شائع في هذه النماذج في المختبر لتقليد التسبب في الجسم الحي 15.
نمت شعبية المواد العضوية ، الناتجة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) ، كنموذج في المختبر للأمعاء بسبب قدرتها على تلخيص المجمع في بنية الجسم الحي وتكوين الأنسجة من نوع الخلية التي تستمد منها16,17. نظام مخبري ذي صلة ، enteroids ، هي عضويات مشتقة من سراديب معوية مقطوعة يتم إنشاؤها وصيانتها بسهولة أكبر من المواد العضوية المشتقة من iPSC. عادة ما تزرع الأمعاء في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية (ECM) مع وصول تجريبي يقتصر على سطح الخلية القاعدية. تم تطوير طرق ، مثل الحقن المجهري 18,19 ، للتغلب على هذا الحاجز أمام السطح القمي ، ولكن تراكم الحطام الخلوي المتخادع والمخاط داخل التجويف يجعل الحقن المجهري صعبا وغير متسق من الناحية الفنية. نظرا لأن منصات الحقن المجهري الروبوتية المخصصة لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع20 ، فإن التباين من مختبر إلى مختبر في القدرة التقنية والتقنية العامة يصبح متغيرات مهمة للتغلب عليها باستخدام بروتوكولات الحقن المجهري. تسمح الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد (2D) المشتقة من الأمعاء ثلاثية الأبعاد المنفصلة ، والتي لا تزال تضم جميع أنواع الخلايا الرئيسية للظهارة المعوية ، بالوصول إلى السطح القمي ولكن كان من الصعب تقليديا الحفاظ عليها بدون طبقة مغذية من الخلايا الليفية العضلية الوسيطة21. في حين يمكن استخدام الدعامات النفاذة لزراعة الخلايا للوصول إلى كل من الجانبين القمي والقاعدي للطبقات الأحادية المعوية دون استخدام الخلايا الليفية العضلية الأساسية ، فإن هذه الإدخالات تتطلب استئصال الغشاء وتركيبه قبل الاستخدام بطرائق مثل المجهر البؤري ، مما يؤدي إلى عملية أكثر تطلبا من الناحية الفنية وصعوبة عند استخدام طرق الفحص المجهري التقليدية22. تم تصميم NEC في المختبر باستخدام المعوية التقليدية ثلاثية الأبعاد 23,24,25 ويدعمالنفاذية 26,27 ، وقد تم تكرار التهاب الأمعاء مؤخرا مع نماذج الأمعاء على رقاقة 28,29. في حين أن نماذج الأمعاء على رقاقة التي تتضمن الموائع الدقيقة هي ، إلى حد بعيد ، النماذج الأكثر تقدما والقابلة للترجمة ، فإن هذه التكنولوجيا باهظة الثمن ومعقدة ولا يمكن لمعظم الباحثين الوصول إليها30.
سمحت التطورات الحديثة في تقنيات الأمعاء القمية بالوصول بسهولة إلى السطح القمي للأمعاء ثلاثية الأبعاد دون المخاطرة بتلف السلامة الهيكلية للظهارة في المختبر 31،32،33. تشترك المعوية القمية في تكوين نوع الخلية ووظيفة الحاجز في الظهارة المعوية في الجسم الحي ، ولكن ، على عكس الأمعاء 3D النموذجية ، تواجه الأسطح القمية لهذه الخلايا وسط الثقافة ، مما يسمح بإجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية حول امتصاص العناصر الغذائية ، والعدوى الميكروبية ، والإفراز اللمعاني31. ميزة إضافية من المعوية القمية هي القدرة على توزيع العوامل التجريبية بشكل متجانس على الأمعاء. لا يلزم اختلاف أحجام العلاج بناء على حجم الأمعاء ، كما هو الحال مع الحقن المجهري ، والقدرة على الحفاظ على هذه الأمعاء في ثقافة التعليق تنفي أي تدخل ECM على انتشار العامل التجريبي32.
التهاب الأمعاء والقولون الناخر هو مرض متعدد العوامل ينطوي على أنواع متعددة من الخلايا الظهارية المعوية ومجموعة متنوعة من العوامل البيئية والفسيولوجية المرضية34. تكوين الخلايا المتنوعة من الأمعاء المعوية هو تحسن واضح على الثقافات الأحادية في نمذجة مرض معقد مثل NEC. ومن المثير للاهتمام ، في حين أن التعرض الالتهابي واحد غالبا ما يكون كافيا للحث على حدوث ضرر في المزارع الأحادية في المختبر ، يبدو أن الأمعاء ، كما هو الحال مع نماذج الفئران23 ، تتطلب ما لا يقل عن مكونين التهابيين للحث على تلف يشبه NEC6. هنا ، نقدم نموذجا ل NEC-in-a-dish ، باستخدام المعوية القمية الخارجية بالاشتراك مع نقص الأكسجة (ميزة سريرية مهمة ل NEC6) وإما LPS أو TNF-α ، كنموذج محسن وأكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر لدراسة الاستجابات الظهارية للالتهاب الشبيه ب NEC ، وربما تحديد الأهداف العلاجية. نحن نصف بروتوكولا لعكس قطبية الأمعاء المعوية الصغيرة 3D ، بالإضافة إلى بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لتحديد اضطراب الحاجز الظهاري وتغيرات التعبير عن البروتين الوصلة. وأخيرا، نعرض أيضا فحصا بسيطا لجدوى الأمعاء لتحديد تأثير نموذج NEC-in-in-a-dish المزدوج الضربة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC) هو مرض مدمر يصيب الأطفال الخدج ، ويتميز بالتهاب الأمعاء والنخر. ظهرت المعوية مؤخرا كنظام واعد لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الطرق المستخدمة حاليا للتلاعب المعوي إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للظهارة (ثلاثي الأبعاد [3D]) أو تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد (الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد [2D]). غالبا ما تتطلب هذه الطرق خطوات إضافية ، مثل الحقن المجهري ، حتى يصبح النموذج قابلا للترجمة الفسيولوجية. هنا ، نصف بروتوكولا ذا صلة فسيولوجية وغير مكلف لدراسة NEC في المختبر عن طريق عكس القطبية المعوية ، مما يؤدي إلى مواجهة السطح القمي للخارج (القمي للخارج). كما يتم توفير بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي لفحص سلامة الحاجز المعوي وتعبير البروتين الموصل بعد التعرض لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) أو عديد السكاريد الشحمي (LPS) في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. كما يتم تقييم جدوى المعوية القمية 3D المعرضة ل normoxic أو hypoxic LPS أو TNF-α لمدة 24 ساعة. أظهرت المعوية المعرضة إما LPS أو TNF-α ، بالاشتراك مع نقص الأكسجة ، اضطرابا في البنية الظهارية ، وفقدان تعبير بروتين الوصلة الملتصقة ، وانخفاض في صلاحية الخلايا. يصف هذا البروتوكول نموذجا جديدا ل NEC-in-a-dish من القمي يقدم منصة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وفعالة من حيث التكلفة لتحديد الأهداف الظهارية المحتملة لعلاجات NEC ودراسة الاستجابة المعوية المبكرة للعلاجات.

أصبح استخدام الأمعاء لنمذجة التهاب الأمعاء ، حتى في سياق التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، شائعا الآن. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق المستخدمة حاليا إما تفتقر إلى الوصول إلى السطح القمي للأمعاء ، مما يلغي الأهمية الفسيولوجية للمركبات المخصصة للاستخدام في نهاية المطاف كعلاجات عن طريق الفم ، أو ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

يصف هذا البروتوكول نموذجا لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر القمي (NEC) في طبق باستخدام الأمعاء المعوية الصغيرة ذات القطبية المعكوسة ، مما يسمح بالوصول إلى السطح القمي. نحن نقدم بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي للكشف عن الاضطراب الظهاري المرتبط ب NEC وطريقة لتحديد جدوى المعوية القمية الخارجة الخاضعة لبروتوكول NEC-in-a-dish.

في المختبر نموذج معوي قمي من التهاب الأمعاء والقولون الناخر

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

يصف هذا البروتوكول أول نموذج قمي خارج الطبق وهو تحسن حاسم على النماذج القاعدية الجانبية المعوية داخل الطبق عند إنشاء نمذجة في المختبر للعلاجات المحتملة المخصصة للإعطاء عن طريق الفم. تسمح هذه الطريقة بالوصول إلى السطح القمي للأمعاء. يمكن إضافة المركبات إلى وسائط الخلايا ويتم تناول المركبات بشكل قمي كما ستكون في الجسم الحي.قد يجد الباحثون المهتمون بإنشاء نظام في المختبر لالتهاب الأمعاء لاختبار العلاجات الفموية المحتملة أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص. قد تتطلب الأنسجة التي يتم الحصول عليها من مختلف الأعمار والأنواع مزيدا من التوحيد. لذلك قد تكون هناك حاجة للمرضى أثناء تحديد أوقات عكس القطبية.لعكس قطبية المعوية 3D شفط الوسائط من كل بئر من لوحة بئر 24 من المعوية القاعدية 3D المعمول بها. أضف 500 ميكرولتر من خمسة ملليمولات من الثلج البارد أو EDTA أو PBS إلى كل بئر من صفيحة البئر 24 وقم بتعطيل مستخلص الغشاء السفلي أو قبة المصفوفة خارج الخلية ميكانيكيا بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات باستخدام ماصة P 200. انقل محتويات أربعة آبار إلى أنبوب مؤرخ بسعة 15 ملليلتر.ثم أضف ثمانية ملليلترات من الثلج البارد EDTA مائل PBS إلى الأنبوب. نقل ال 20 بئرا المتبقية بنفس الطريقة. احتضن الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على منصة دوارة أو شاكر عند 330 دورة في الدقيقة.بعد الحضانة الطرد المركزي الأنابيب والتخلص من supernatant من كل أنبوب. الجمع بين وغسل الكريات مع خمسة ملليلتر من DMEM F12. ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلايا وإزالة المادة الفائقة قبل إضافة 12 ملليلتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى الأنبوب لضمان إنعاش كريات الخلايا.Pippet 500 ميكرولتر من التعليق المعوي في كل بئر من 24 بئر منخفضة للغاية مرفق البئر. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى خمسة أيام أو حتى تعكس الأمعاء القطبية. في اليوم الأول الممتنع عن التصويت، انقل محتويات أربعة آبار من صفيحة 24 بئرا إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر.كرر ذلك لجميع الآبار المرغوبة مع كل علاج في أنبوب منفصل. الطرد المركزي للأنابيب وإعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من 4٪ من مثبت الألدهيد في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة اغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من PBS.أضف 500 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X 100 إلى الأنابيب. احتضان الأنابيب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على دوار أو شاكر عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.بعد الحضانة الأخيرة ، أضف 500 ميكرولتر من 10٪ NDS في PBS T واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي. في اليوم التالي ، أضف 250 إلى 500 ميكرولتر PBS T إلى الأنابيب اعتمادا على حجم الكريات ، وضعها على الدوار أو الخلاط عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.أضف 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضن الأنابيب عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية في الظلام. في اليوم التالي ، تابع تركيب المعوية القمية الملطخة عن طريق تدوير الأنابيب وإزالة 100 ميكرولتر من supernatant. أعد تعليق الخلايا في ال 100 ميكرولتر المتبقية من supernatant وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب 500 ميكرولتر.الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 20 ثانية. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة بقعة الحمض النووي الأحمر البعيد. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من PBS.بعد الغسيل الثاني والطرد المركزي ، قم بإزالة 70 ميكرولتر من supernatant وإعادة تعليق الكريات في الحجم المتبقي من PBS. ثم انقل تعليق الخلية إلى زلة غطاء 24 × 60 ملم. ضع 75 ميكرولتر من الحامل مباشرة على العينة وقم بإزالة أي فقاعات بطرف ماصة.بعد المعالجة الليلية في الظلام ، ضع طبقة رقيقة من الجلسرين على زلات الغطاء ، ثم قم بتركيب الغطاء على الشريحة الزجاجية واضغط عليه برفق في مكانه. انقر لإزالة أي فقاعات بين انزلاق الغطاء والشريحة. اسمح لانزلاق الغطاء بضبطه في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين قبل تصوير الأمعاء عند تكبير 20 مرة باستخدام مجهر متحد البؤرة.بالنسبة للعلاجات المعوية ، قم بإنشاء التهاب الأمعاء والقولون القمي الناخر في نموذج طبق لمدة 24 ساعة كما هو موضح في مخطوطة النص. قبل إجراء الفحص ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر تاركا ال 400 ميكرولتر المتبقية. أضف 400 ميكرولتر من كاشف فحص صلاحية الخلية إلى كل بئر.امزج المحتويات بقوة على شاكر الطبق لمدة خمس دقائق عند 200 دورة في الدقيقة للحث على تحلل الخلايا. بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر إلى بئر واحد من 96 صفيحة ذات قاع واضح جيدا. كرر ذلك بالنسبة لل 600 ميكرولتر المتبقية مما يخلق أربعة نسخ طبق الأصل تقني لكل بئر.باستخدام قارئ لوحات قادر على التلألؤ ، سجل القيم عند تكامل 0.25 مللي ثانية وقارن القيم النسبية بين العلاجات. أكد تلطيخ التألق المناعي التمثيلي للتحكم التوطين القمي للنوى نحو التجويف والكشف عن الشرير عند الحافة الخارجية للظهارة. بالمقارنة مع السيطرة ، فإن التعرض لعديد السكاريد الليبي ، أو نخر الورم ألفا ، أو نقص الأكسجة وحده لم يحفز تغييرات علنية في مورفولوجيا الخلايا الإجمالية E-cadherin أو توطين الشرير أو كثافة الفلورسنت.أدى العلاج بعديد السكاريد الليبي أو نخر الورم ألفا بالاشتراك مع نقص الأكسجة إلى تعطيل البنية الظهارية وأظهر فقدانا كبيرا في تقاطع الالتصاق وتعبير البروتين الحدودي للفرشاة الذي كشف عنه فقدان السمع ECA وتلطيخ الشرير. تم تحديد صلاحية الخلية القمية في ظل ظروف النورموكسيك أو نقص الأكسجين. في ظل الظروف المعيارية مقارنة بالتحكم في عديد السكاريد ليبو أو نخر الورم ألفا لم يؤثر بشكل كبير على بقاء الخلايا المعوية.ومع ذلك ، لوحظت انخفاضات كبيرة في الجدوى في عديد السكاريد الليبو أو نخر الورم ألفا في تركيبة مع نقص الأكسجة مقارنة بنقص الأكسجة وحده. أثناء إنشاء نموذج قمي في طبق. تذكر أن تبقي EDTA في الجليد تعليق الخلية باردا.سيؤدي ذلك إلى تعزيز انعكاس القطبية وضمان تسييل جميع ECM وإزالتها بشكل صحيح. يمكن إجراء تطبيقات أخرى في المراحل النهائية مثل QPCR أو RNA-seq أو النشاف الغربي أو التقييمات الوظيفية لنفاذية الحاجز بشكل أكبر لتوصيف الاستجابة للإشارات الالتهابية في نقص الأكسجة.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em&gt; في المختبر</em&gt; صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

في المختبر نموذج الأوعية التاجية

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

نموذج حلقة الدم في المختبرية للتحقيق في التوافق الهيموسيتوفية وتنشيط الخلية المضيفة للأجهزة الطبية الوعائية

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

في المختبر تقييم حماية عضلة القلب بعد انخفاض حرارة الجسم- الشروط المسبقة في نموذج الخلايا العضلية القلب البشري

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

نموذج من Steatosis التجريبية في المختبر: ثقافة الخلية الكبدية في الدهون الزائد مشروط المتوسطة

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

نموذج فأر BALB/c الوليدي لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...