Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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此内容仅由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。HC由美国国立卫生研究院的赠款P20GM134973提供支持。KB由儿童医院基金会（CHF）和长老会健康基金会（PHF）赠款支持。我们感谢OUHSC分子生物学和细胞计数研究实验室使用核心设施，该设施提供共聚焦成像。

本研究中的所有动物程序均由俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。在安乐死后，在一项单独的研究中，从早产非人灵长类动物（NHP，90%妊娠，橄榄狒狒， Papio anubis）中获得小肠方便样本（协议#101523-16-039-I）。
1. 建立顶端出肠状NEC盘式模型
<ol><li>培养基和肠道治疗的制备 注意：一旦按照标准无菌技术制备，培养基可以在4°C下...

最近开发的源自肠上皮隐窝的类肠模型允许更生理相关的 体外 组织，其中研究坏死性小肠结肠炎的发病机制。尽管包括肠上皮的所有主要分化细胞类型，但3D类肠细胞仍然受到一些显着的限制。将常规的基底外侧出的类肠物质悬浮在3D ECM水凝胶穹顶中，其组成和密度可限制组织培养环境39内的正常扩散。重要的是，这些类肠物质提供了对细胞顶端表面的有限访问，该表面 ...

坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是一种严重的小肠炎性疾病，见于多达 10% 的早产儿，通常与高发病率和死亡率相关1，2。在需要手术干预的极低出生体重（<1500克）婴儿中，死亡率接近50%并不少见3。虽然目前尚不了解NEC的确切病因，但危险因素（如配方奶喂养）被认为与生理异常（例如生态失调，未成熟的肠上皮和功能失调的肠屏障）在疾病发展中复合2，4。尽管作出了重大努力，但在过去十年中，在预防或治疗NEC方面进展甚微5.需要一种新的 体外 方法来研究NEC和相关肠上皮屏障功能障碍，以进一步了解该疾病的发病机制，因为到目前为止，动物模型的研究结果尚未转化为床边6。
已经利用许多体外模型来研究NEC期间起作用的机制。人肠上皮细胞系Caco-2是NEC7，8最常用的体外模型之一。Caco-2细胞模拟小肠的刷子边界形态特征，但是，作为细胞系，不会分化成高度可翻译的模型所需的各种体内细胞类型，包括产生粘液的杯状细胞。HT-29-MTX，人结肠腺癌细胞，包括混合肠细胞和高脚杯细胞表型，但仍缺乏基于隐窝的细胞类型的肠上皮9。IEC-6和IEC-18是非转化细胞系，具有未成熟的回肠隐窝样形态，但不是来自人体组织，限制了它们的转化能力。FHs 74-Int和H4肠细胞系来源于人胎儿组织，不形成紧密连接或极化单层10，11，因此与最易患NEC的早产儿相比，它们都是不成熟的。通常，NEC体外模型利用脂多糖（LPS）治疗来诱导Toll样受体4（TLR4），这是NEC12中引发肠道炎症的主要受体。通过活性氧（ROS）处理介导的损伤，通常通过过氧化氢，通常用于诱导NEC样氧化损伤和细胞凋亡13，14。作为肠道炎症的主要驱动因素，肿瘤坏死因子α（TNF-α）是炎症性TLR4信号传导的下游成分，在这些体外模型中也通常用于模拟体内发病机制15。
由诱导性多能干细胞（iPSCs）产生的类器官作为肠道的体外模型越来越受欢迎，因为它们能够概括复杂的体内结构和衍生它们的组织的细胞类型组成16，17。相关的体外系统，类肠动物，是从切除的肠隐窝中提取的类器官，比iPSC衍生的类器官更容易建立和维持。类肠细胞通常在三维（3D）细胞外基质（ECM）中生长，实验访问仅限于基底外侧细胞表面。已经开发了诸如显微注射18，19的方法，以克服顶端表面的这种障碍，但是腔内脱落的细胞碎片和粘液的积聚使得显微注射在技术上既困难又不一致。由于定制的机器人显微注射平台无法广泛使用20，因此技术能力和一般技术的实验室间差异成为显微注射方案需要克服的重要变量。来自解离的3D类肠细胞的二维（2D）单层，仍然包括肠上皮的所有主要细胞类型，允许进入顶端表面，但传统上很难维持没有间充质肌成纤维母细胞21的饲养层。虽然细胞培养渗透性载体可用于进入肠样单层的顶端和基底外侧，而无需使用下面的肌成纤维母细胞，但这些插入片段在与共聚焦显微镜等模态一起使用之前需要切除和安装膜，导致在使用传统显微镜方法22时技术要求更高且难度更大。NEC已经使用传统的3D类肠类化合物23，24，25和可渗透支持26，27进行体外建模，并且肠道炎症最近已经通过芯片上的肠道模型28，29进行了复制。虽然包含微流体的芯片上的肠道模型是迄今为止最先进和可转化的模型，但该技术昂贵，复杂且大多数研究人员都无法访问30。
顶端出肠技术的最新进展使得更容易进入3D类肠细胞的顶端表面，而不会对体外上皮31，32，33的结构完整性造成损害。顶端出肠类化合物共享体内肠上皮的细胞类型组成和屏障功能，但是，与典型的3D类肠细胞不同，这些细胞的顶端表面面向培养基，允许对营养吸收，微生物感染和腔内分泌进行更多生理相关的研究31。顶端出肠类药物的另一个优点是能够将实验药物均匀地分布到类肠道。不需要根据肠样大小改变治疗体积，因为它是显微注射，并且在悬浮培养物中维持这些肠道的能力否定了对实验剂扩散32的任何ECM干扰。
坏死性小肠结肠炎是一种多因素疾病，涉及多种肠上皮细胞类型和多种环境和病理生理因素34。肠道类固醇的不同细胞组成在模拟NEC等复杂疾病方面比单一栽培有了明显的改进。有趣的是，虽然单一的炎症暴露通常足以 在体外 单一培养中诱导损伤，但与小鼠模型23一样，类肠杆菌似乎需要至少两种炎症成分来诱导NEC样损伤6。在这里，我们提出了一个顶端出的NEC在培养皿模型中，使用顶端出肠类化合物结合缺氧（NEC6的重要临床特征）和LPS或TNF-α，作为一种改进的和生理上更相关的 体外 模型，以研究对NEC样炎症的上皮反应，并可能确定治疗靶点。我们描述了一种逆转小肠3D类肠细胞极性的方案，以及一种免疫荧光染色方案，用于识别上皮屏障破坏和连接蛋白表达改变。最后，我们进一步演示了一个简单的肠溶性测定，以确定我们的双重打击，顶端出的NEC在培养皿中模型的影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种影响早产儿的破坏性疾病，其特征是肠道炎症和坏死。类肠类药物最近已成为一种有前途的系统，用于模拟胃肠道病变。然而，目前使用的肠类操作方法要么无法进入上皮的顶端表面（三维[3D]），要么耗时且资源密集（二维[2D]单层）。这些方法通常需要额外的步骤，例如显微注射，以使模型在生理上可转化。在这里，我们描述了一种生理学上相关且廉价的方案，用于通过逆转肠极性 在体外 研究NEC，导致顶端表面朝外（顶端外）。还提供了免疫荧光染色方案，用于在常氧或缺氧条件下暴露于肿瘤坏死因子α（TNF-α）或脂多糖（LPS）后检查肠屏障完整性和连接蛋白表达。还评估了暴露于常氧或缺氧LPS或TNF-α 24 h的3D顶端类肠类药物的生存能力。暴露于LPS或TNF-α的类肠细胞与缺氧相结合，表现出上皮结构的破坏，贴壁连接蛋白表达的丧失以及细胞活力的降低。该协议描述了一种新的顶端NEC在培养皿中模型，该模型提供了一个生理学相关且具有成本效益的平台，以确定NEC治疗的潜在上皮靶点并研究治疗药物的早产肠道反应。

使用类肠杆菌来模拟肠道炎症，即使在坏死性小肠结肠炎的背景下，现在也很常见。然而，目前使用的大多数方法要么缺乏进入类肠素的顶端表面，否定了最终用作口服治疗的化合物的生理相关性，要么在技术上是困难和耗时的，如肠源性单层。为了增加NEC当前体外类肠模型的实用性，我们反转了类肠细胞的极性，并结合24小时缺氧和LPS或TNF-α，生成了顶端出的NEC在碟中模型。免疫荧光染?...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

该协议描述了一种顶端坏死性小肠结肠炎（NEC）在培养皿中的模型，该模型利用具有反向极性的小肠类化合物，允许进入顶端表面。我们提供免疫荧光染色方案来检测NEC相关的上皮破坏，并提供一种确定受NEC培养皿中方案影响的顶出类肠蛋白的活力的方法。

体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

该协议描述了第一个顶端出入培养皿模型，并且在建立用于口服给药的潜在疗法的体外建模时，是对基础外侧出肠样培养皿模型的关键改进。这种方法允许进入肠样的顶端表面。化合物可以添加到细胞培养基中，并且化合物像在体内一样被顶端吸收。有兴趣建立肠道炎症的体外系统以测试潜在口服疗法的研究人员可能会发现这种技术特别有用。来自不同年龄和物种的组织可能需要进一步标准化。因此，患者在建立极性逆转时可能需要时间。为了逆转 3D 肠样的极性，从已建立的 3D 基底外侧肠的 24 孔板的每个孔中吸出培养基。向 24 孔板的每个孔中加入 500 微升 5 毫摩尔冰冷、EDTA 或 PBS，并通过用 P 200 移液器上下移液五到六次，轻轻机械地破坏基底膜提取物或细胞外基质圆顶。将四个孔的内容物转移到15毫升编年史管中。然后在管中加入八毫升冰冷的EDTA斜线PBS。以相同的方式转移剩余的20个孔。将试管在 4 摄氏度下以 330 RPM 的旋转平台或摇床孵育一小时。孵育后离心管并从每个管中弃去上清液。将颗粒与五毫升 DMEM F12 混合并清洗。然后离心细胞悬液并除去上清液，然后将12毫升无抗生素培养基加入管中，确保细胞沉淀重悬。将500微升肠悬浮液移入每孔24孔的超低附着板中。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两到五天或直到肠极性反转。在弃权的第一天，将24孔板的四个孔的内容物转移到1.5毫升微量离心管中。对所有所需的孔重复此操作，每次处理都在单独的管中。离心管并在室温下将沉淀重悬于300微升4%的醛固定剂中。30分钟后，用500微升PBS洗涤颗粒。向试管中加入 500 微升 0.1% Triton X 100。将试管在室温下孵育一小时。接下来，将试管放在 200 RPM 的旋转器或摇床上 15 分钟，温度为 2 至 8 摄氏度。最后一次孵育后，在PBS T中加入500微升10%NDS，并在室温下孵育45分钟。在孵育过程中，制备一抗溶液。第二天，根据颗粒的大小向管中加入250至500微升PBS T，并将它们以200 RPM的速度在2至8摄氏度下放置在旋转器或摇床上一小时。加入200微升二抗溶液，并在黑暗中将试管在2至8摄氏度下孵育。第二天，通过旋转试管并除去100微升上清液来进行安装染色的顶端肠。将细胞重悬于剩余的100微升上清液中，并将细胞悬液转移到500微升管中。将试管在小型离心机中离心20秒。除去上清液并将沉淀重悬于100微升室温远红核酸染色剂中。孵育20分钟后，离心细胞并将沉淀重悬于100微升PBS中。第二次洗涤和离心后，除去70微升上清液并将沉淀重悬于剩余体积的PBS中。然后将细胞悬液转移到贴有标签的 24 x 60 毫米盖玻片上。将 75 微升封片剂直接涂在试样上，并用移液器吸头去除任何气泡。在黑暗中固化过夜后，在盖玻片上涂上一层薄薄的甘油，然后将盖玻片安装到载玻片上并轻轻按入到位。点击以去除盖玻片和幻灯片之间的任何气泡。让盖玻片在室温下在黑暗中凝固两个小时，然后用共聚焦显微镜以20倍放大倍率对肠样进行成像。对于肠样治疗，如文本手稿中所述，在培养皿模型中建立根尖坏死性小肠结肠炎 24 小时。在进行测定之前，从每个孔中取出100微升培养基，留下剩余的400微升。向每个孔中加入400微升细胞活力测定试剂。在摇板器上以200 RPM剧烈混合内容物五分钟，以诱导细胞裂解。接下来，将200微升转移到96孔透明底板的单孔中。对剩余的600微升重复此操作，每孔创建四个技术重复。使用能够发光的酶标仪，以0.25毫秒积分记录值，并比较处理之间的相对值。对照组代表性的免疫荧光染色证实了细胞核向管腔的顶端定位和上皮外缘的反面检测。与对照组相比，单独暴露于脂质多糖、肿瘤坏死α或缺氧不会诱导大细胞形态E-钙粘蛋白或反派定位或荧光强度的明显变化。用脂肪多糖或肿瘤坏死α联合缺氧治疗会破坏上皮结构，并显示出ECA听力丧失和恶棍染色所揭示的粘附连接和刷状边界蛋白表达的显着丧失。顶端细胞活力在常氧或缺氧条件下测定。在常氧条件下，与对照相比，脂多糖或肿瘤坏死α没有显着影响类肠的细胞活力。然而，与单独缺氧相比，在脂肪多糖或肿瘤坏死α联合缺氧中观察到活力显着降低。同时建立顶端出盘模式。请记住将EDTA保存在细胞悬液冰冷中。这将增强极性反转，并确保所有ECM都正确液化和去除。其他下游应用，如QPCR、RNA-seq、蛋白质印迹或屏障通透性的功能评估，可以进一步进行，以表征缺氧时对炎症信号的反应。

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

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科研

医学

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体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型

体外坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型