Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children's Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. We bedanken het Laboratorium voor Moleculaire Biologie en Cytometrie onderzoek van OUHSC voor het gebruik van de Core Facility, die confocale beeldvorming leverde.

Alle dierprocedures in deze studie werden goedgekeurd door het University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Dunne darm gemaksmonsters van een premature niet-menselijke primaat (NHP, 90% dracht, olijfbaviaan, Papio anubis) werden verkregen na euthanasie voor een afzonderlijke studie (Protocol #101523-16-039-I).
1. Opstelling van het apicale-uit enteroïde NEC-in-een-schotelmodel
<ol><li>Voorbereiding van media- en entero?...

De recente ontwikkeling van enteroïde modellen afgeleid van intestinale epitheliale crypten zorgt voor een meer fysiologisch relevant in vitro weefsel om necrotiserende enterocolitis pathogenese te bestuderen. Ondanks het feit dat alle belangrijke gedifferentieerde celtypen van het darmepitheel zijn opgenomen, zijn 3D-enteroïden nog steeds onderhevig aan verschillende significante beperkingen. De conventionele, basolaterale enteroïden worden gesuspendeerd in 3D ECM-hydrogelkoepels, waarvan de samenstelling en...

Necrotiserende enterocolitis (NEC), een ernstige ontstekingsziekte van de dunne darm die voorkomt bij maximaal 10% van de te vroeg geboren baby's, wordt vaak geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2. Sterftecijfers van bijna 50% bij baby's met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g), die chirurgische ingrepen vereisen, zijn niet ongewoon3. Hoewel de exacte etiologie van NEC momenteel niet wordt begrepen, wordt gedacht dat risicofactoren, zoals kunstvoeding, zich vermengen met fysiologische anomalieën, zoals dysbiose, een onrijp darmepitheel en een disfunctionele darmbarrière, bij de ontwikkeling van de ziekte 2,4. Ondanks aanzienlijke inspanningen is er de afgelopen tien jaar weinig vooruitgang geboekt in de preventie of behandeling van NEC5. Een nieuwe in vitro methode om NEC en geassocieerde intestinale epitheliale barrièredisfunctie te bestuderen, is vereist om het begrip van de pathogenese van de ziekte te bevorderen, omdat bevindingen van diermodellen tot nu toe slecht zijn vertaald naar het bed6.
Een aantal in vitro modellen zijn gebruikt om de mechanismen die spelen tijdens NEC te onderzoeken. De menselijke intestinale epitheelcellijn, Caco-2, is een van de meest gebruikte in vitro modellen van NEC 7,8. Caco-2-cellen emuleren morfologische kenmerken van de dunne darm, maar differentiëren als cellijn niet in de grote verscheidenheid aan in vivo celtypen, waaronder slijmproducerende bokaalcellen, die nodig zijn voor een zeer vertaalbaar model. HT-29-MTX, menselijke colon adenocarcinoom cellen, omvatten een gemengd enterocyten- en bokaalcelfenotype, maar missen nog steeds op crypten gebaseerde celtypen van het darmepitheel9. IEC-6 en IEC-18 zijn niet-getransformeerde cellijnen met een onrijpe ileale crypte-achtige morfologie, maar zijn niet afgeleid van menselijk weefsel, waardoor hun translationele capaciteit wordt beperkt. FHs 74-Int en H4 darmcellijnen zijn afgeleid van menselijk foetaal weefsel en vormen geen tight junctions of gepolariseerde monolagen 10,11, en zijn dus onvolgroeid in vergelijking met zelfs de meest premature baby's die vatbaar zijn voor NEC. Meestal gebruiken NEC in vitro modellen lipopolysaccharide (LPS) behandelingen om toll-like receptor 4 (TLR4) te induceren, een belangrijke receptor die darmontsteking in NEC12 initieert. Schade gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS) behandeling, meestal via waterstofperoxide, wordt vaak gebruikt om NEC-achtige oxidatieve schade en apoptose 13,14 te induceren. Als de belangrijkste aanjager van darmontsteking wordt tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), een stroomafwaartse component van de inflammatoire TLR4-signalering, ook vaak gebruikt in deze in vitro modellen om in vivo pathogenese na te bootsen15.
Organoïden, gegenereerd uit induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's), zijn in populariteit gegroeid als een in vitro model van de darm vanwege hun vermogen om de complexe in vivo architectuur en celachtige samenstelling van het weefsel waaruit ze zijn afgeleid te recapituleren16,17. Een verwant in vitro systeem, enteroïden, zijn organoïden afgeleid van gereseceerde darmcrypten die gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en onderhouden dan van iPSC afgeleide organoïden. Enteroïden worden meestal gekweekt in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix (ECM) met experimentele toegang beperkt tot het basolaterale celoppervlak. Methoden, zoals micro-injectie18,19, zijn ontwikkeld om deze barrière naar het apicale oppervlak te overwinnen, maar de opbouw van afgesleten cellulair puin en slijm in het lumen maakt micro-injectie zowel technisch moeilijk als inconsistent. Aangezien aangepaste robotische micro-injectieplatforms niet breed toegankelijk zijn20, worden lab-to-lab variabiliteit in technische vaardigheden en algemene techniek belangrijke variabelen die moeten worden overwonnen met micro-injectieprotocollen. Tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van gedissocieerde 3D-enteroïden, die nog steeds alle belangrijke celtypen van het darmepitheel omvatten, bieden toegang tot het apicale oppervlak, maar zijn traditioneel moeilijk te onderhouden zonder een feederlaag van mesenchymale myofibroblasten21. Hoewel celkweekdoorlatende steunen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen tot zowel de apicale als de basolaterale zijden van enteroïde monolagen zonder het gebruik van onderliggende myofibroblasten, vereisen deze inserts excisie en montage van het membraan voor gebruik met modaliteiten zoals confocale microscopie, wat resulteert in een technisch veeleisender en moeilijker proces bij gebruik van traditionele microscopiemethoden22. NEC is in vitro gemodelleerd met behulp van traditionele 3D-enteroïden 23,24,25 en permeabele ondersteunt26,27, en darmontsteking is onlangs gerepliceerd met darm-op-een-chip modellen28,29. Hoewel gut-on-a-chip-modellen met microfluïdica verreweg de meest geavanceerde en vertaalbare modellen zijn, is deze technologie duur, complex en ontoegankelijk voor de meeste onderzoekers30.
Recente ontwikkelingen in apiical-out enteroïde technieken hebben gemakkelijker toegang tot het apicale oppervlak van 3D-enteroïden mogelijk gemaakt zonder het risico te lopen de structurele integriteit van het in vitro epitheel te beschadigen 31,32,33. Apicale enteroïden delen de celtypesamenstelling en barrièrefunctie van in vivo darmepitheel, maar, in tegenstelling tot typische 3D-enteroïden, worden de apicale oppervlakken van deze cellen geconfronteerd met het kweekmedium, waardoor meer fysiologisch relevante studies mogelijk zijn over de absorptie van voedingsstoffen, microbiële infectie en luminale secretie31. Een bijkomend voordeel van apicale enteroïden is het vermogen om experimentele middelen homogeen te verdelen over enteroïden. Het variëren van behandelingsvolumes op basis van enteroïde grootte is niet vereist, zoals bij micro-injectie, en het vermogen om deze enteroïden in suspensiecultuur te houden, ontkent elke ECM-interferentie op experimentele agentdiffusie32.
Necrotiserende enterocolitis is een multifactoriële ziekte waarbij meerdere intestinale epitheelceltypen en een verscheidenheid aan omgevings- en pathofysiologische factorenbetrokken zijn 34. De gevarieerde celsamenstelling van intestinale enteroïden is een duidelijke verbetering ten opzichte van monoculturen bij het modelleren van een complexe ziekte zoals NEC. Interessant is dat, terwijl een enkele inflammatoire blootstelling vaak voldoende is om schade te veroorzaken in in vitro monoculturen, enteroïden, zoals bij muismodellen23, minimaal twee ontstekingscomponenten nodig lijken te hebben om NEC-achtige schade te induceren6. Hier presenteren we een apicale NEC-in-een-schotelmodel, met behulp van apicale enteroïden in combinatie met hypoxie (een belangrijk klinisch kenmerk van NEC6) en LPS- of TNF-α, als een verbeterd en meer fysiologisch relevant in vitro model om epitheliale reacties op NEC-achtige ontsteking te bestuderen en mogelijk therapeutische doelen te identificeren. We beschrijven een protocol voor het omkeren van de polariteit van dunne darm 3D-enteroïden, evenals een immunofluorescent kleuringsprotocol om epitheliale barrièreverstoring en junctionele eiwitexpressieveranderingen te identificeren. Ten slotte demonstreren we verder een eenvoudige enteroïde levensvatbaarheidstest om de impact van ons dual-hit, apiical-out NEC-in-a-dish-model te bepalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende ziekte die premature baby's treft, gekenmerkt door darmontsteking en necrose. Enteroïden zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend systeem om gastro-intestinale pathologieën te modelleren. Momenteel gebruikte methoden voor enteroïde manipulatie hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel (driedimensionaal [3D]) of zijn tijdrovend en resource-intensief (tweedimensionale [2D] monolagen). Deze methoden vereisen vaak extra stappen, zoals micro-injectie, om het model fysiologisch vertaalbaar te maken. Hier beschrijven we een fysiologisch relevant en goedkoop protocol voor het bestuderen van NEC in vitro door enteroïde polariteit om te keren, wat resulteert in het apicale oppervlak naar buiten gericht (apiical-out). Een immunofluorescentiekleuringsprotocol om de integriteit van de enteroïde barrière en junctionele eiwitexpressie na blootstelling aan tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) of lipopolysaccharide (LPS) onder normoxische of hypoxische omstandigheden te onderzoeken, wordt ook verstrekt. De levensvatbaarheid van 3D apiical-out enteroïden blootgesteld aan normoxische of hypoxische LPS of TNF-α gedurende 24 uur wordt ook geëvalueerd. Enteroïden blootgesteld aan LPS of TNF-α vertoonden, in combinatie met hypoxie, verstoring van de epitheliale architectuur, een verlies van adherens junction eiwitexpressie en een vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. Dit protocol beschrijft een nieuw apicale NEC-in-een-schotelmodel dat een fysiologisch relevant en kosteneffectief platform presenteert om potentiële epitheliale doelen voor NEC-therapieën te identificeren en de premature intestinale respons op therapeutica te bestuderen.

Het gebruik van enteroïden om darmontsteking te modelleren, zelfs binnen de context van necrotiserende enterocolitis, is nu gebruikelijk. De meeste methoden die momenteel worden gebruikt, hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden, waardoor de fysiologische relevantie van verbindingen die bedoeld zijn voor uiteindelijk gebruik als orale therapieën wordt ontkend, of zijn technisch moeilijk en tijdrovend, zoals bij enteroïde-afgeleide monolagen. Om het nut van de huidige in vitro enter...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Dit protocol beschrijft het eerste apicale-out in-een-schotelmodel en is een kritische verbetering ten opzichte van basale laterale enteroïde in-een-schotelmodellen bij het vaststellen van in vitro modellering van potentiële therapieën bedoeld voor orale toediening. Deze methode geeft toegang tot het apicale oppervlak van enteroïden. Verbindingen kunnen worden toegevoegd aan celmedia en de verbindingen worden apisch opgenomen zoals ze in vivo zouden zijn.Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het opzetten van een in vitro systeem van darmontsteking om potentiële orale therapieën te testen, kunnen deze techniek bijzonder nuttig vinden. Weefsel afkomstig van verschillende leeftijden en soorten kan verdere standaardisatie vereisen. Dus patiënten kunnen bij het vaststellen van polariteitsomkeringstijden nodig zijn.Voor het omkeren van de polariteit van 3D-enteroïden aspirateert u media uit elke put van een 24 putplaat van gevestigde 3D-basolaterale enteroïden. Voeg 500 microliter van vijf millimolaire ijskoude, EDTA of PBS toe aan elke put van een 24 putplaat en verstoor voorzichtig mechanisch het keldermembraanextract of de extracellulaire matrixkoepel door vijf tot zes keer op en neer te pipetteren met een P 200-pipet. Breng de inhoud van vier putjes over in een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens acht milliliter ijskoude EDTA slash PBS toe aan de buis. Breng de resterende 20 putten op dezelfde manier over. Incubeer de buizen bij vier graden Celsius gedurende een uur op een roterend platform of shaker bij 330 RPM.Na incubatiecentrifugeer je de buizen en gooi je het supernatant uit elke buis. Combineer en was de pellets met vijf milliliter DMEM F12. Centrifugeer vervolgens de cellensuspensie en verwijder het supernatant voordat u 12 milliliter antibioticumvrij medium aan de buis toevoegt, zodat de celpellets worden geresuspendeerd.Pippet 500 microliter van de enteroïde suspensie in elke put van een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee tot vijf dagen of totdat de enteroïden de polariteit hebben omgekeerd. Breng op de eerste dag de inhoud van vier putten van een 24 putplaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Herhaal dit voor alle gewenste putten met elke behandeling in een aparte buis. Centrifugeer de buizen en resuspeneer de pellet in 300 microliter van 4% uit aldehydefixatiemiddel bij kamertemperatuur. Was de pellets na 30 minuten met 500 microliter PBS.Voeg 500 microliter van 0,1% Triton X 100 toe aan de buizen. Incubeer de buizen gedurende een uur bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buizen op een rotator of shaker bij 200 RPM gedurende 15 minuten bij twee tot acht graden Celsius.Voeg na de laatste incubatie 500 microliter 10% NDS toe aan PBS T en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens incubatie primaire antilichaamoplossing voor. Voeg de volgende dag 250 tot 500 microliter PBS T toe aan de buizen, afhankelijk van de grootte van de pellet, en plaats ze op de rotator of shaker bij 200 RPM gedurende een uur bij twee tot acht graden Celsius.Voeg 200 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe en incubeer de buisjes bij twee tot acht graden Celsius in het donker. Ga de volgende dag verder met het monteren van gekleurde apicale enteroïden door de buizen te draaien en 100 microliter supernatant te verwijderen. Resuspensie de cellen in de resterende 100 microliter supernatant en breng de celsuspensie over naar 500 microliterbuizen.Centrifugeer de buizen gedurende 20 seconden in een minicentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 100 microliter kamertemperatuur verrode nucleïnezuurvlek. Na 20 minuten incubatie centrifugeer je de cellen en resuspensieer je de pellets in 100 microliter PBS.Verwijder na de tweede wasbeurt en centrifugatie 70 microliter van het supernatant en resuspenseer de pellets in het resterende volume PBS. Breng vervolgens de celsuspensie over op een gelabelde afdekslip van 24 bij 60 millimeter. Breng 75 microliter mountant rechtstreeks op het monster aan en verwijder eventuele bubbels met een pipetpunt.Breng na een nacht uitharden in het donker een dun laagje glycerol aan op de afdekslips, monteer vervolgens de dekselglijders op de glazen schuif en druk deze voorzichtig op zijn plaats. Tik om eventuele luchtbellen tussen de afdeksleuf en de schuif te verwijderen. Laat de cover slip twee uur op kamertemperatuur in het donker instellen voordat je de enteroïden met 20 keer vergroting in beeld brengt met een confocale microscoop.Voor enteroïde behandelingen, stel een apicale necrotiserende enterocolitis vast in een schotelmodel gedurende 24 uur zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voordat u de test uitvoert, verwijdert u 100 microliter media uit elke put en laat u de resterende 400 microliter over. Voeg 400 microliter cel levensvatbaarheidstestreagens toe aan elk putje.Meng de inhoud krachtig op een platenschudder gedurende vijf minuten bij 200 RPM om cellyse te induceren. Breng vervolgens 200 microliter over op een enkele put van een 96 goed heldere bodemplaat. Herhaal dit voor de resterende 600 microliter en maak vier technische replica's per put.Met behulp van een plaatlezer die in staat is tot luminescentie, registreer waarden bij 0,25 milliseconden integratie en vergelijk de relatieve waarden tussen behandelingen. De representatieve immunofluorescentiekleuring van de controle bevestigde de apicale lokalisatie van kernen naar het lumen en de detectie van schurk aan de buitenrand van het epitheel. Vergeleken met de controle veroorzaakte blootstelling aan lipopolysaccharide, tumornecrose alfa of hypoxie alleen geen openlijke veranderingen in de bruto celmorfologie E-cadherine of schurkenlokalisatie of fluorescerende intensiteit.Behandeling met lipopolysaccharide of tumornecrose alfa in combinatie met hypoxie verstoorde de epitheliale architectuur en toonde een significant verlies van adherence junction en brush border protein expressie onthuld door het verlies van ECA-gehoor en schurkenkleuring. De levensvatbaarheid van de apicale uitcel werd bepaald onder normoxische of hypoxische omstandigheden. Onder normoxische omstandigheden in vergelijking met de controle lipo polysaccharide of tumornecrose had alfa geen significante invloed op de levensvatbaarheid van de cellen van enteroïden.Er werden echter significante verminderingen van de levensvatbaarheid waargenomen bij lipopolysaccharide of tumornecrose alfa in combinatie met hypoxie in vergelijking met hypoxie alleen. Tijdens het opzetten van apicale out-in-a-dish model. Vergeet niet om EDTA in de cel suspensie ijskoud te houden.Dit zal de omkering van de polariteit verbeteren en ervoor zorgen dat alle ECU op de juiste manier vloeibaar wordt gemaakt en verwijderd. Andere downstream-toepassingen zoals QPCR, RNA-seq, western blotting of functionele evaluaties van barrièrepermeabiliteit kunnen verder worden uitgevoerd om de reactie op inflammatoire signalering bij hypoxie te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Een model van experimentele steatose in vitro:hepatocytencelcultuur in lipide-overbelasting-geconditioneerd medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Een neonatale BALB / c muismodel van necrotiserende enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...