Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children's Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Wir danken dem Labor für Molekularbiologie und Zytometrieforschung am OUHSC für die Nutzung der Core Facility, die konfokale Bildgebung zur Verfügung stellte.

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) wurden nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I).
1. Etablierung eines apikalen enteroiden NEC-in-a-dish-Modells
<ol><li>Vorbereitung von Medien und enteroiden Beh...

Die jüngste Entwicklung enteroider Modelle, die aus intestinalen Epithelkrypten abgeleitet werden, ermöglicht ein physiologisch relevanteres In-vitro-Gewebe , in dem die nekrotisierende Enterokolitis-Pathogenese untersucht werden kann. Trotz der Einbeziehung aller wichtigen differenzierten Zelltypen des Darmepithels unterliegen 3D-Enteroide immer noch mehreren signifikanten Einschränkungen. Die herkömmlichen, basolateralen Enteroide sind in 3D-ECM-Hydrogelkuppeln suspendiert, deren Zusammensetzung und Dichte...

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC), eine schwere entzündliche Erkrankung des Dünndarms, die bei bis zu 10% der Frühgeborenen auftritt, ist häufig mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden 1,2. Sterblichkeitsraten von fast 50% bei Säuglingen mit sehr niedrigem Geburtsgewicht (<1500 g), die einen chirurgischen Eingriff erfordern, sind nicht ungewöhnlich3. Während die genaue Ätiologie von NEC derzeit nicht verstanden wird, wird angenommen, dass Risikofaktoren wie die Fütterung von Säuglingsnahrung bei der Entwicklung der Krankheit mit physiologischen Anomalien wie Dysbiose, einem unreifen Darmepithel und einer dysfunktionalen Darmbarriere verbunden sind 2,4. Trotz erheblicher Anstrengungen wurden in den letzten zehn Jahren nur geringe Fortschritte bei der Prävention oder Behandlung von NEC erzielt5. Eine neuartige In-vitro-Methode zur Untersuchung von NEC und der damit verbundenen intestinalen Epithelbarriere-Dysfunktion ist erforderlich, um das Verständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern, da Erkenntnisse aus Tiermodellen bisher schlecht auf das Krankenbett übertragen wurden6.
Eine Reihe von In-vitro-Modellen wurde verwendet, um die Mechanismen während des NEC zu untersuchen. Die humane Darmepithelzelllinie, Caco-2, gehört zu den am häufigsten verwendeten In-vitro-Modellen von NEC 7,8. Caco-2-Zellen emulieren morphologische Merkmale des Dünndarms, differenzieren sich aber als Zelllinie nicht in die Vielzahl von In-vivo-Zelltypen, einschließlich schleimproduzierender Kelchzellen, die für ein hochübersetzbares Modell erforderlich sind. HT-29-MTX, menschliche Dickdarm-Adenokarzinomzellen, umfassen einen gemischten Enterozyten- und Becherzellphänotyp, aber es fehlen immer noch kryptabasierte Zelltypen des Darmepithels9. IEC-6 und IEC-18 sind nicht transformierte Zelllinien mit einer unreifen ilealen kryptenartigen Morphologie, die jedoch nicht aus menschlichem Gewebe stammen, was ihre Translationskapazität einschränkt. FHs 74-Int und H4 Darmzelllinien stammen aus menschlichem fetalem Gewebe und bilden keine Tight Junctions oder polarisierten Monoschichten10,11 und sind daher im Vergleich zu selbst den frühgeborensten Säuglingen, die für NEC anfällig sind, unreif. Typischerweise verwenden NEC-In-vitro-Modelle Lipopolysaccharid-Behandlungen (LPS), um den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) zu induzieren, einen Hauptrezeptor, der eine Darmentzündung in NEC12 auslöst. Schäden, die durch die Behandlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), typischerweise über Wasserstoffperoxid, vermittelt werden, werden häufig verwendet, um NEC-ähnliche oxidative Schäden und Apoptose zu induzieren13,14. Als Haupttreiber der Darmentzündung wird Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), eine nachgeschaltete Komponente des entzündlichen TLR4-Signalwegs, auch häufig in diesen In-vitro-Modellen verwendet, um die In-vivo-Pathogenese nachzuahmen15.
Organoide, die aus induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugt werden, haben als In-vitro-Modell des Darms aufgrund ihrer Fähigkeit, die komplexe In-vivo-Architektur und Zelltypzusammensetzung des Gewebes, aus dem sie stammen, zu rekapitulieren, an Popularität gewonnen16,17. Ein verwandtes In-vitro-System, Enteroide, sind Organoide, die aus resezierten Darmkrypten gewonnen werden, die leichter etabliert und aufrechterhalten werden können als iPSC-abgeleitete Organoide. Enteroide werden typischerweise in einer dreidimensionalen (3D) extrazellulären Matrix (ECM) gezüchtet, wobei der experimentelle Zugang auf die basolaterale Zelloberfläche beschränkt ist. Methoden wie die Mikroinjektion18,19 wurden entwickelt, um diese Barriere zur apikalen Oberfläche zu überwinden, aber der Aufbau von abgelösten Zelltrümmern und Schleim im Lumen macht die Mikroinjektion sowohl technisch schwierig als auch inkonsistent. Da kundenspezifische Roboter-Mikroinjektionsplattformen nicht allgemein zugänglich sind20, werden Labor-zu-Labor-Variabilität in Bezug auf technische Fähigkeiten und allgemeine Technik zu bedeutenden Variablen, die mit Mikroinjektionsprotokollen überwunden werden müssen. Zweidimensionale (2D) Monoschichten aus dissoziierten 3D-Enteroiden, die immer noch alle wichtigen Zelltypen des Darmepithels umfassen, ermöglichen den Zugang zur apikalen Oberfläche, waren aber traditionell ohne eine Feederschicht aus mesenchymalen Myofibroblasten schwer aufrechtzuerhalten21. Während Zellkultur-durchlässige Träger verwendet werden können, um sowohl die apikale als auch die basolaterale Seite enteroider Monoschichten ohne die Verwendung von darunter liegenden Myofibroblasten zu erreichen, erfordern diese Einsätze eine Exzision und Montage der Membran vor der Verwendung mit Modalitäten wie konfokaler Mikroskopie, was zu einem technisch anspruchsvolleren und schwierigeren Prozess bei Verwendung herkömmlicher Mikroskopiemethoden führt22. NEC wurde in vitro unter Verwendung herkömmlicher 3D-Enteroide 23,24,25 und durchlässiger Träger 26,27 modelliert, und Darmentzündungen wurden kürzlich mit Darm-on-a-Chip-Modellen 28,29 repliziert. Während Darm-on-a-Chip-Modelle mit Mikrofluidik bei weitem die fortschrittlichsten und übersetzbarsten Modelle sind, ist diese Technologie teuer, komplex und für die meisten Forscher unzugänglich30.
Jüngste Fortschritte bei apikalen enteroiden Techniken haben einen leichteren Zugang zur apikalen Oberfläche von 3D-Enteroiden ermöglicht, ohne die strukturelle Integrität des In-vitro-Epithels zu schädigen31,32,33. Apikale Enteroide teilen sich die Zelltypzusammensetzung und Barrierefunktion des In-vivo-Darmepithels, aber im Gegensatz zu typischen 3D-Enteroiden sind die apikalen Oberflächen dieser Zellen dem Kulturmedium zugewandt, was physiologisch relevantere Studien zur Nährstoffaufnahme, mikrobiellen Infektion und luminalen Sekretion ermöglicht31. Ein weiterer Vorteil von apikalen Enteroiden ist die Fähigkeit, experimentelle Wirkstoffe homogen auf Enteroide zu verteilen. Unterschiedliche Behandlungsvolumina basierend auf der enteroiden Größe sind nicht erforderlich, wie dies bei der Mikroinjektion der Fall ist, und die Fähigkeit, diese Enteroide in Suspensionskultur zu halten, negiert jegliche ECM-Interferenz bei der experimentellen Wirkstoffdiffusion32.
Die nekrotisierende Enterokolitis ist eine multifaktorielle Erkrankung, an der mehrere intestinale Epithelzelltypen und eine Vielzahl von umweltbedingten und pathophysiologischen Faktoren beteiligtsind 34. Die vielfältige Zellzusammensetzung der Darmenteroide ist eine deutliche Verbesserung gegenüber Monokulturen bei der Modellierung einer komplexen Erkrankung wie NEC. Während eine einzige entzündliche Exposition in In-vitro-Monokulturen oft ausreicht, um Schäden zu induzieren, scheinen Enteroide, wie beiMausmodellen 23, mindestens zwei entzündliche Komponenten zu benötigen, um NEC-ähnliche Schäden zu induzieren6. Hier präsentieren wir ein apikales NEC-in-a-dish-Modell, das apikale Enteroide in Kombination mit Hypoxie (ein wichtiges klinisches Merkmal von NEC6) und entweder LPS oder TNF-α als verbessertes und physiologisch relevanteres In-vitro-Modell verwendet, um epitheliale Reaktionen auf NEC-ähnliche Entzündungen zu untersuchen und möglicherweise therapeutische Ziele zu identifizieren. Wir beschreiben ein Protokoll zur Umkehrung der Polarität von Dünndarm-3D-Enteroiden sowie ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zur Identifizierung von epithelialen Barrierestörungen und Veränderungen der junctionalen Proteinexpression. Schließlich demonstrieren wir einen einfachen enteroiden Lebensfähigkeitstest, um die Auswirkungen unseres Dual-Hit-Apical-Out-NEC-in-a-Dish-Modells zu bestimmen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine verheerende Erkrankung bei Frühgeborenen, die durch Darmentzündungen und Nekrosen gekennzeichnet ist. Enteroide haben sich kürzlich als vielversprechendes System zur Modellierung gastrointestinaler Pathologien herausgestellt. Derzeit verwendete Methoden zur enteroiden Manipulation haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche des Epithels (dreidimensional [3D]) oder sind zeit- und ressourcenintensiv (zweidimensionale [2D] Monoschichten). Diese Methoden erfordern oft zusätzliche Schritte, wie z.B. Mikroinjektion, damit das Modell physiologisch übersetzbar wird. Hier beschreiben wir ein physiologisch relevantes und kostengünstiges Protokoll zur Untersuchung von NEC in vitro durch Umkehrung der enteroiden Polarität, was dazu führt, dass die apikale Oberfläche nach außen zeigt (apikal-out). Ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zur Untersuchung der Integrität der enteroiden Barriere und der junctionalen Proteinexpression nach Exposition gegenüber Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) oder Lipopolysaccharid (LPS) unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen wird ebenfalls bereitgestellt. Die Lebensfähigkeit von 3D-apikalen Enteroiden, die normoxischen oder hypoxischen LPS oder TNF-α für 24 h ausgesetzt waren, wird ebenfalls bewertet. Enteroide, die entweder LPS oder TNF-α ausgesetzt waren, zeigten in Kombination mit Hypoxie eine Störung der Epithelarchitektur, einen Verlust der Adhärenz-Junction-Proteinexpression und eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt ein neues apikales NEC-in-a-dish-Modell, das eine physiologisch relevante und kostengünstige Plattform darstellt, um potenzielle epitheliale Ziele für NEC-Therapien zu identifizieren und die frühgeborene Darmreaktion auf Therapeutika zu untersuchen.

Die Verwendung von Enteroiden zur Modellierung von Darmentzündungen, auch im Zusammenhang mit nekrotisierender Enterokolitis, ist heute üblich. Die meisten derzeit verwendeten Methoden haben jedoch entweder keinen Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden, was die physiologische Relevanz von Verbindungen, die für eine eventuelle Verwendung als orale Therapeutika bestimmt sind, negiert, oder sie sind technisch schwierig und zeitaufwendig, wie bei enteroid-abgeleiteten Monoschichten. Um den Nutzen aktueller in ...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Dieses Protokoll beschreibt das erste apikale In-a-Dish-Modell und stellt eine entscheidende Verbesserung gegenüber basalen lateralen enteroiden In-a-Dish-Modellen dar, wenn eine In-vitro-Modellierung potenzieller Therapeutika für die orale Verabreichung erstellt wird. Diese Methode ermöglicht den Zugang zur apikalen Oberfläche von Enteroiden. Verbindungen können zu Zellmedien hinzugefügt werden und die Verbindungen werden apikal aufgenommen, wie sie es in vivo wären.Forscher, die daran interessiert sind, ein In-vitro-System der Darmentzündung zu etablieren, um potenzielle orale Therapeutika zu testen, können diese Technik besonders nützlich finden. Gewebe aus verschiedenen Altersgruppen und Arten kann eine weitere Standardisierung erfordern. Daher können Patienten bei der Festlegung von Polaritätsumkehrzeiten erforderlich sein.Um die Polarität von 3D-Enteroiden umzukehren, saugen sie Medien aus jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte etablierter basolateraler 3D-Enteroide ab. Fügen Sie 500 Mikroliter fünf Millimolar eiskalt, EDTA oder PBS in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu und brechen Sie den Basalmembranextrakt oder die extrazelluläre Matrixkuppel sanft mechanisch auf, indem Sie fünf- bis sechsmal mit einer P 200-Pipette auf und ab pipettieren. Den Inhalt von vier Bohrlöchern in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Dann fügen Sie acht Milliliter eiskaltes EDTA-Slash PBS in die Röhre hinzu. Übertragen Sie die restlichen 20 Bohrlöcher auf die gleiche Weise. Inkubieren Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für eine Stunde auf einer rotierenden Plattform oder einem Shaker bei 330 U/min.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen und verwerfen Sie den Überstand aus jedem Röhrchen. Kombinieren und waschen Sie die Pellets mit fünf Milliliter DMEM F12. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie 12 Milliliter antibiotikafreies Medium in das Röhrchen geben, um sicherzustellen, dass die Zellpellets resuspendiert werden.Pippet 500 Mikroliter der enteroiden Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis fünf Tage oder bis die Enteroide die Polarität umgekehrt haben. Am ersten Tag der Abstinenz wird der Inhalt von vier Vertiefungen einer 24-Well-Platte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Wiederholen Sie dies für alle gewünschten Vertiefungen bei jeder Behandlung in einem separaten Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern von 4% aus Aldehyd-Fixiermittel bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten die Pellets mit 500 Mikrolitern PBS waschen.Fügen Sie 500 Mikroliter 0,1% Triton X 100 zu den Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf einen Rotator oder Shaker bei 200 U/min für 15 Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius.Nach der letzten Inkubation 500 Mikroliter 10% NDS in PBS T hinzufügen und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation eine primäre Antikörperlösung vor. Am nächsten Tag werden je nach Größe des Pellets 250 bis 500 Mikroliter PBS T in die Röhrchen gegeben und bei 200 U/min für eine Stunde bei zwei bis acht Grad Celsius auf den Rotator oder Shaker gelegt.Fügen Sie 200 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei zwei bis acht Grad Celsius im Dunkeln. Am nächsten Tag montieren Sie gefärbte apikale Enteroide, indem Sie die Röhrchen drehen und 100 Mikroliter Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 100 Mikrolitern Überstand und übertragen Sie die Zellsuspension in 500 Mikroliter Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Minizentrifuge für 20 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikroliter Raumtemperatur weit roter Nukleinsäurefärbung. Nach 20 Minuten Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern PBS.Nach dem zweiten Waschen und Zentrifugieren 70 Mikroliter des Überstands entfernen und die Pellets im verbleibenden PBS-Volumen resuspendieren. Anschließend wird die Zellsuspension auf einen beschrifteten 24 x 60 Millimeter großen Abdeckstreifen überführt. Tragen Sie 75 Mikroliter Mountant direkt auf die Probe auf und entfernen Sie Blasen mit einer Pipettenspitze.Nach dem Aushärten über Nacht im Dunkeln eine dünne Schicht Glycerin auf die Deckgläser auftragen, dann die Deckgläser auf den Glasobjektträger montieren und vorsichtig an Ort und Stelle drücken. Tippen Sie, um alle Blasen zwischen dem Abdeckschein und dem Schieber zu entfernen. Lassen Sie den Deckschein zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln aushärten, bevor Sie die Enteroide mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop abbilden.Für enteroide Behandlungen etablieren Sie eine apikale nekrotisierende Enterokolitis in einem Schalenmodell für 24 Stunden, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie vor der Durchführung des Tests 100 Mikroliter Medien aus jeder Vertiefung, wobei die restlichen 400 Mikroliter übrig bleiben. Fügen Sie 400 Mikroliter Zelllebensfähigkeits-Assay-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu.Mischen Sie den Inhalt auf einem Plattenschüttler fünf Minuten lang bei 200 U/min, um die Zelllyse zu induzieren. Als nächstes übertragen Sie 200 Mikroliter in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Clear-Bodenplatte. Wiederholen Sie dies für die restlichen 600 Mikroliter, wodurch vier technische Replikate pro Bohrloch entstehen.Mit einem lumineszenzfähigen Plattenleser können Sie Werte bei einer Integration von 0,25 Millisekunden aufzeichnen und die relativen Werte zwischen den Behandlungen vergleichen. Die repräsentative Immunfluoreszenzfärbung der Kontrolle bestätigte die apikale Lokalisation der Kerne in Richtung Lumen und die Detektion von Bösewichten am äußeren Rand des Epithels. Im Vergleich zur Kontrolle induzierte die Exposition gegenüber Lipopolysaccharid, Tumornekrose alpha oder Hypoxie allein keine offensichtlichen Veränderungen in der grobzelligen Morphologie E-Cadherin oder Bösewichtlokalisierung oder Fluoreszenzintensität.Die Behandlung mit Lipopolysaccharid oder Tumornekrose alpha in Kombination mit Hypoxie störte die Epithelarchitektur und zeigte einen signifikanten Verlust der Adhärenzverbindung und der Bürstengrenzproteinexpression, der durch den Verlust des ECA-Gehörs und die Färbung des Bösewichts nachgewiesen wurde. Die Lebensfähigkeit apikaler Zellen wurde unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen bestimmt. Unter normoxischen Bedingungen im Vergleich zum Kontrolllipo beeinflusste Polysaccharid oder Tumornekrose alpha die Zelllebensfähigkeit von Enteroiden nicht signifikant.Es wurden jedoch signifikante Abnahmen der Lebensfähigkeit bei Lipopolysaccharid oder Tumornekrose alpha in Kombination mit Hypoxie im Vergleich zu Hypoxie allein beobachtet. Bei der Etablierung eines apikalen In-a-Dish-Modells. Denken Sie daran, EDTA in der Zellsuspension eiskalt zu halten.Dies verbessert die Polaritätsumkehr und stellt sicher, dass die gesamte ECM ordnungsgemäß verflüssigt und entfernt wird. Andere nachgeschaltete Anwendungen wie QPCR, RNA-seq, Western Blotting oder funktionelle Bewertungen der Barrierepermeabilität können weiter durchgeführt werden, um die Reaktion auf entzündliche Signale bei Hypoxie zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

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