Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). אנו מודים למעבדה לביולוגיה מולקולרית ומחקר ציטומטריה ב- OUHSC על השימוש במתקן הליבה, שסיפק הדמיה קונפוקלית.

כל נהלי בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה. דגימות נוחות המעי הדק מפרימט לא אנושי פג (NHP, 90% הריון, בבון זיתים, Papio anubis) התקבלו לאחר המתת חסד למחקר נפרד (פרוטוקול #101523-16-039-I).
1. הקמת מודל NEC-in-a...

הפיתוח האחרון של מודלים אנטרואידיים הנגזרים מקריפטות אפיתל מעיים מאפשר רקמה חוץ-גופית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שבה ניתן לחקור פתוגנזה אנטרוקוליטיס נמקית. למרות הכללת כל סוגי התאים הממוינים העיקריים של אפיתל המעי, אנטרואידים תלת-ממדיים עדיין כפופים למספר מגבלות משמעותיות. ה?...

דלקת המעי הגס (NEC), מחלה דלקתית חמורה של המעי הדק המתרחשת בעד 10% מהפגים, קשורה בדרך כלל לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2. שיעורי תמותה המתקרבים ל-50% בתינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (<1500 גרם), הדורשים התערבות כירורגית, אינם נדירים3. בעוד שהאטיולוגיה המדויקת של NEC אינה מובנת כיום, גורמי סיכון, כגון הזנת פורמולה, נחשבים למורכבים עם אנומליות פיזיולוגיות, כגון דיסביוזיס, אפיתל מעיים לא בשל, ומחסום מעיים לא מתפקד, בהתפתחות המחלה 2,4. למרות מאמץ משמעותי, התקדמות מועטה במניעה או בטיפול ב- NEC התרחשה בעשורהאחרון 5. שיטה חדשנית במבחנה לחקר NEC ותפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים נדרשת כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה של המחלה, כפי שממצאים ממודלים של בעלי חיים תרגמו עד כה בצורה גרועה למיטה6.
מספר מודלים של מבחנה שימשו כדי לחקור את המנגנונים הפועלים במהלך NEC. קו תאי האפיתל במעיים האנושיים, Caco-2, הוא בין המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במבחנה של NEC 7,8. תאי Caco-2 מחקים תכונות מורפולוגיות של גבול המברשת של המעי הדק, אך כקו תאים, אינם מתמיינים למגוון הרחב של סוגי תאי in vivo, כולל תאי גביע המייצרים ריר, הנדרשים למודל הניתן לתרגום גבוה. HT-29-MTX, תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי, כוללים פנוטיפ מעורב של אנטרוציטים ותאי גביע, אך עדיין חסרים סוגי תאים מבוססי קריפטה של אפיתל המעי9. IEC-6 ו-IEC-18 הם קווי תאים שאינם מותמרים עם מורפולוגיה לא בשלה דמוית קריפטה, אך אינם נגזרים מרקמה אנושית, מה שמגביל את יכולת התרגום שלהם. קווי תאי המעי FHs 74-Int ו-H4 מופקים מרקמת עובר אנושית ואינם יוצרים צמתים הדוקים או מונולרים מקוטבים10,11, ולכן הם לא בשלים בהשוואה אפילו לפגים ביותר הרגישים ל-NEC. בדרך כלל, מודלים של NEC במבחנה משתמשים בטיפולי ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), קולטן מרכזי הגורם לדלקת מעיים ב-NEC12. נזק המתווך באמצעות טיפול במיני חמצן תגובתי (ROS), בדרך כלל באמצעות מי חמצן, משמש לעתים קרובות כדי לגרום לנזק חמצוני דמוי NEC ואפופטוזיס13,14. כגורם העיקרי לדלקת מעיים, גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α), מרכיב במורד הזרם של איתות TLR4 דלקתי, משמש בדרך כלל גם במודלים אלה במבחנה כדי לחקות פתוגנזה in vivo 15.
אורגנואידים, המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs), צברו פופולריות כמודל חוץ גופי של המעי בשל יכולתם לשחזר את ארכיטקטורת ה-in vivo המורכבת ואת הרכב התאים של הרקמה שממנה הם נגזרים16,17. מערכת חוץ גופית קשורה, אנטרואידים, הם אורגנואידים שמקורם בקריפטות מעיים שנכרתו שקל יותר להקים ולתחזק מאשר אורגנואידים שמקורם ב-iPSC. אנטרוידים גדלים בדרך כלל במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (3D) (ECM) עם גישה ניסיונית המוגבלת לפני השטח של התא הבזולטרלי. שיטות כגון מיקרו-הזרקה18,19, פותחו כדי להתגבר על מחסום זה בפני השטח האפיקלי, אך הצטברות של פסולת תאית מרופטת וליחה בתוך הלומן הופכת את המיקרו-הזרקה לקשה מבחינה טכנית ולא עקבית. מכיוון שפלטפורמות מיקרו-הזרקה רובוטיות מותאמות אישית אינן נגישות באופן נרחב20, השתנות מעבדה למעבדה ביכולת הטכנית ובטכניקה הכללית הופכת למשתנים משמעותיים שיש להתגבר עליהם באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה. מונו-שכבות דו-ממדיות (2D) שמקורן באנטרוידים תלת-ממדיים מנותקים, שעדיין כוללים את כל סוגי התאים העיקריים של אפיתל המעי, מאפשרות גישה לפני השטח האפיקליים, אך באופן מסורתי היה קשה לתחזק אותן ללא שכבת הזנה של מיופיברובלסטים מזנכימליים21. בעוד שניתן להשתמש בתמיכות חדירות של תרביות תאים כדי לגשת הן לצד האפיקלי והן לצד הבזולטרלי של מונולרים אנטרואידים ללא שימוש במיופיברובלסטים בסיסיים, תוספות אלה דורשות כריתה והרכבה של הממברנה לפני השימוש בשיטות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, וכתוצאה מכך תהליך תובעני וקשה יותר מבחינה טכנית בעת שימוש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות22. NEC עוצב במבחנה באמצעות אנטרואידים תלת-ממדיים מסורתיים 23,24,25 ותומך חדירב-26,27, ודלקת מעיים שוכפלה לאחרונה עם מודלים של מעיים על שבב 28,29. בעוד שמודלים של בטן על שבב המשלבים מיקרופלואידיקה הם, ללא ספק, המודלים המתקדמים ביותר הניתנים לתרגום, טכנולוגיה זו יקרה, מורכבת ובלתי נגישה לרוב החוקרים30.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות אנטרואידיות אפיקליות אפשרה גישה קלה יותר למשטח האפיקלי של אנטרוידים תלת-ממדיים מבלי להסתכן בפגיעה בשלמות המבנית של האפיתל במבחנה 31,32,33. אנטרוידים Apical-out חולקים את הרכב סוג התא ואת תפקוד המחסום של אפיתל מעיים in vivo, אך בניגוד לאנטרוידים תלת-ממדיים טיפוסיים, המשטחים האפיקליים של תאים אלה פונים למדיום התרבית, מה שמאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית על ספיגת חומרים מזינים, זיהום מיקרוביאלי והפרשה לומינלית31. יתרון נוסף של אנטרואידים אפיקליים הוא היכולת להפיץ באופן הומוגני חומרים ניסיוניים לאנטרואידים. נפחי טיפול משתנים המבוססים על גודל אנטרואיד אינם נדרשים, כפי שהם עם מיקרו הזרקה, והיכולת לשמור על אנטרוידים אלה בתרבית השעיה שוללת כל הפרעה ECM על דיפוזיה של סוכן ניסיוני32.
דלקת אנטרוקוליטיס נמקית היא מחלה רב-גורמית המערבת מספר סוגי תאי אפיתל מעיים ומגוון גורמים סביבתיים ופתופיזיולוגיים34. הרכב התאים המגוון של אנטרואידים במעיים הוא שיפור ברור לעומת מונוקולטורים במידול מחלה מורכבת כגון NEC. באופן מעניין, בעוד שחשיפה דלקתית אחת מספיקה לעתים קרובות כדי לגרום נזק במונוקולטורות חוץ גופיות , נראה כי אנטרואידים, כמו במודלים של עכברים23, דורשים מינימום של שני מרכיבים דלקתיים כדי לגרום לנזק דמוי NEC6. כאן, אנו מציגים מודל NEC-in-a-dish apical-out, המשתמש באנטרוואידים אפיקליים בשילוב עם היפוקסיה (תכונה קלינית חשובה של NEC6) ו- LPS או TNF-α, כמודל משופר ורלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במבחנה כדי לחקור תגובות אפיתל לדלקת דמוית NEC, ואולי גם לזהות מטרות טיפוליות. אנו מתארים פרוטוקול להיפוך הקוטביות של אנטרואידים תלת-ממדיים במעי הדק, כמו גם פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה במחסום האפיתל ושינויים בביטוי חלבונים צומתיים. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר בדיקת כדאיות אנטרואידית פשוטה כדי לקבוע את ההשפעה של מודל ה-NEC-in-a-dish שלנו, בעל שתי הלהיטים והאפיקליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

אנטרוקוליטיס נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית המשפיעה על פגים, המאופיינת בדלקת מעיים ונמק. אנטרואידים התגלו לאחרונה כמערכת מבטיחה למודל פתולוגיות במערכת העיכול. עם זאת, השיטות המשמשות כיום למניפולציה אנטרואידית חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של האפיתל (תלת-ממדי [3D]) או שהן גוזלות זמן ועתירות משאבים (מונולרים דו-ממדיים [2D]). שיטות אלה דורשות לעתים קרובות שלבים נוספים, כגון מיקרו-הזרקה, כדי שהמודל יהפוך לניתן לתרגום פיזיולוגי. כאן אנו מתארים פרוטוקול רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וזול לחקר NEC במבחנה על ידי היפוך קוטביות אנטרואידית, וכתוצאה מכך המשטח האפיקלי פונה כלפי חוץ (apical-out). כמו כן מסופק פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לבחינת שלמות מחסום אנטרואידי וביטוי חלבונים צומתי לאחר חשיפה לגורם נמק גידולי - אלפא (TNF-α) או ליפופוליסכריד (LPS) בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. כמו כן, נבדקת הכדאיות של אנטרוידים אפיקליים תלת-ממדיים החשופים ל-LPS נורמוקסי או היפוקסי או ל-TNF-α במשך 24 שעות. אנטרוידים שנחשפו ל-LPS או ל-TNF-α, בשילוב עם היפוקסיה, הפגינו הפרעה בארכיטקטורת האפיתל, אובדן ביטוי של חלבון צומת הדבקות וירידה בכדאיות התא. פרוטוקול זה מתאר מודל חדש של NEC-in-a-dish המציג פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית וחסכונית לזיהוי מטרות אפיתל פוטנציאליות לטיפולי NEC ולחקר תגובת המעיים המוקדמת לטיפולים.

השימוש באנטרוואידים כדי לדגום דלקת מעיים, אפילו בהקשר של דלקת אנטרוקוליטיס נמקית, נפוץ כיום. עם זאת, רוב השיטות המשמשות כיום חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של אנטרואידים, מה ששולל את הרלוונטיות הפיזיולוגית של תרכובות המיועדות לשימוש בסופו של דבר כטיפולים אוראליים, או שהן קשות מבחינה טכני?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

פרוטוקול זה מתאר את המודל הראשון של apical-out in-a-dish ומהווה שיפור קריטי לעומת מודלים אנטרואידיים רוחביים בסיסיים בצלחת בעת יצירת מודלים חוץ-גופיים של טיפולים פוטנציאליים המיועדים למתן אוראלי. שיטה זו מאפשרת גישה למשטח האפיקלי של אנטרואידים. ניתן להוסיף תרכובות למדיית התאים והתרכובות נקלטות באופן אפי כפי שהן היו נקלטות.חוקרים המעוניינים להקים מערכת חוץ-גופית של דלקת מעיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים דרך הפה עשויים למצוא טכניקה זו שימושית במיוחד. רקמות שמקורן בגילאים ומינים שונים עשויות לדרוש סטנדרטיזציה נוספת. כך שייתכן שיהיה צורך בחולים תוך קביעת זמני היפוך קוטביות.להיפוך הקוטביות של אנטרוידים תלת-ממדיים שואפים מדיה מכל באר של צלחת באר 24 של אנטרוידים בזולטרליים תלת-ממדיים מבוססים. הוסף 500 מיקרוליטרים של חמישה מילימולרים קרים כקרח, EDTA או PBS לכל באר של צלחת באר 24 ושבש בעדינות מכנית את תמצית קרום המרתף או כיפת המטריצה החוץ-תאית על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים עם פיפטה P 200. מעבירים את תכולת ארבע הבארות לצינור של 15 מיליליטר.לאחר מכן להוסיף שמונה מיליליטר של EDTA קר כקרח לחתוך PBS לצינור. להעביר את 20 הבארות הנותרות באותו אופן. דגירה של הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה על פלטפורמה מסתובבת או שייקר ב-330 סל"ד.לאחר הדגירה צנטריפוגה את הצינורות ולהשליך את supernatant מכל צינור. שלב ושטוף את הכדורים עם חמישה מיליליטר של DMEM F12. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים תלויים ולהסיר את supernatant לפני הוספת 12 מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה לצינור להבטיח כי כדורי התא הם resuspended.Pippet 500 microliters של ההשעיה enteroid לתוך כל באר של 24 לוח חיבור נמוך במיוחד היטב. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד חמישה ימים או עד האנטרוידים יש קוטביות הפוכה. ביום הראשון לנמנע, העבירו את תכולתן של ארבע בארות של צלחת באר 24 לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר.חזרו על הפעולה לכל הבארות הרצויות עם כל טיפול בצינור נפרד. צנטריפוגה את הצינורות ולתלות את הכדור ב 300 microliters של 4% מ aldehyde fixative בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות לשטוף את הכדורים עם 500 microliters של PBS.הוסף 500 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X 100 לצינורות. לדגור את הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על סיבוב או שייקר ב 200 סל"ד במשך 15 דקות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה האחרונה, להוסיף 500 microliters של 10% NDS ב PBS T לדגור בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. במהלך הדגירה, להכין פתרון נוגדנים ראשוני. למחרת מוסיפים 250 עד 500 מיקרוליטרים PBS T לצינורות בהתאם לגודל הכדור, ומניחים אותם על המסובב או השייקר ב 200 סל"ד למשך שעה אחת בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס.מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית ודוגרים את הצינורות בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס בחושך. למחרת, המשך להרכבת אנטרואידים אפיקליים מוכתמים על ידי סיבוב הצינורות והסרת 100 מיקרוליטרים של סופרנטנט. יש להשעות את התאים ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של סופר-נאטנט ולהעביר את תרחיף התאים ל-500 צינורות מיקרוליטר.צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה מיני למשך 20 שניות. הסר את supernatant ולתלות מחדש את הכדורים ב 100 microliters של טמפרטורת החדר כתם חומצת גרעין אדומה רחוקה. לאחר 20 דקות של דגירה, צנטריפוגה של התאים לתלות את הכדורים ב 100 microliters של PBS.לאחר השטיפה השנייה צנטריפוגה להסיר 70 microliters של supernatant ו resuse את הכדורים בנפח הנותר של PBS. לאחר מכן העבירו את מתלה התא לכיסוי מסומן בגודל 24 על 60 מילימטר. החל 75 microliters של mountant ישירות על הדגימה ולהסיר את כל בועות עם קצה פיפטה.לאחר ריפוי בן לילה בחושך, יש למרוח שכבה דקה של גליצרול על תלושי הכיסוי, ולאחר מכן להרכיב את מחליק הכיסוי על מגלשת הזכוכית וללחוץ אותה בעדינות למקומה. הקישו כדי להסיר בועות בין תלוש הכיסוי לשקופית. אפשרו לכיסוי להחליק בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעתיים לפני שתדמיינו את האנטרואידים בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.עבור טיפולים אנטרואידיים, להקים אנטרוקוליטיס נמקית אפיקלית במודל צלחת במשך 24 שעות כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני ביצוע הבדיקה, הסר 100 מיקרוליטרים של מדיה מכל באר והשאיר את 400 המיקרוליטרים הנותרים. הוסף 400 מיקרוליטרים של ריאגנט לבדיקת כדאיות התא לכל באר.ערבבו במרץ את התוכן על שייקר צלחת במשך חמש דקות במהירות של 200 סל"ד כדי לגרום לתזה של התאים. לאחר מכן, להעביר 200 microliters לבאר אחת של צלחת תחתית ברורה היטב 96. חזור על 600 המיקרוליטרים הנותרים ויוצר ארבעה שכפולים טכניים לכל באר.באמצעות קורא לוחות המסוגל להאיר, רשום ערכים באינטגרציה של 0.25 אלפיות השנייה והשווה את הערכים היחסיים בין הטיפולים. הכתם האימונופלואורסצנטי הייצוגי של הבקרה אישר את לוקליזציה אפיקלית של גרעינים כלפי לומן ואת זיהוי הנבל בקצה החיצוני של האפיתל. בהשוואה לבקרה, חשיפה לליפו פוליסכריד, נמק גידולי אלפא, או היפוקסיה בלבד לא גרמה לשינויים גלויים במורפולוגיית התא הגולמי E-cadherin או לוקליזציה של נבל או עוצמת פלואורסצנטית.טיפול עם ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה שיבש את ארכיטקטורת האפיתל והדגים אובדן משמעותי של הצטלבות היצמדות וביטוי חלבון גבול המברשת שנחשף על ידי אובדן שמיעה ECA וכתם נבל. הכדאיות של התא האפיקלי נקבעה בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. בתנאים נורמוקסיים בהשוואה לבקרת ליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא לא השפיעו באופן משמעותי על כדאיות התאים של אנטרואידים.עם זאת, ירידות משמעותיות בכדאיות נצפו בליפו פוליסכריד או נמק גידולי אלפא בשילוב עם היפוקסיה בהשוואה להיפוקסיה בלבד. תוך כדי ביסוס מודל אפיקלי החוצה בתוך המנה. זכור לשמור על EDTA בהשעיית התא קר כקרח.זה ישפר את היפוך הקוטביות ויבטיח שכל ECM נוזלי כראוי והוסר. יישומים אחרים במורד הזרם כגון QPCR, RNA-seq, כתם מערבי או הערכות תפקודיות של חדירות מחסום יכולים להתבצע עוד יותר כדי לאפיין את התגובה לאיתות דלקתי בהיפוקסיה.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

אין ויטרו הערכה של הגנה שריר הלב בעקבות היפותרמיה-תנאים מקדים במודל מיוציטים לב אנושי

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...