Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। एचसी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से अनुदान पी 20 जीएम 134973 द्वारा समर्थित किया गया है। केबी को चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन (सीएचएफ) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन (पीएचएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम कोर सुविधा के उपयोग के लिए ओयूएचएससी में आणविक जीवविज्ञान और साइटोमेट्री रिसर्च के लिए प्रयोगशाला का धन्यवाद करते हैं, जिसने कॉन्फोकल इमेजिंग प्रदान की।

इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं को ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। एक अलग अध्ययन (प्रोटोकॉल # 101523-16-039-आई) के लिए इच्छा?...

आंतों के उपकला क्रिप्ट से प्राप्त एंटरॉइड मॉडल का हालिया विकास इन विट्रो ऊतक में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक की अनुमति देता है जिसमें नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस रोगजनन का अध्ययन करना है। आंत?...

नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी), छोटी आंत की एक गंभीर भड़काऊ बीमारी जो 10% अपरिपक्व शिशुओं में होती है, आमतौर पर उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 से जुड़ी होती है। बहुत कम जन्म के वजन (<1500 ग्राम) शिशुओं में 50% तक पहुंचने वाली मृत्यु दर, सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है, असामान्य नहीं हैं3. जबकि एनईसी के सटीक एटियलजि को वर्तमान में समझा नहीं गया है, जोखिम कारक, जैसे कि फॉर्मूला फीडिंग, को शारीरिक विसंगतियों के साथ यौगिक माना जाता है, जैसे कि डिस्बिओसिस, एक अपरिपक्व आंतों का उपकला, और एक बेकार आंतों की बाधा, रोग 2,4 के विकास में। महत्वपूर्ण प्रयास के बावजूद, पिछले दशक में एनईसी की रोकथाम या उपचार में बहुत कम प्रगति हुई है5. एनईसी और संबद्ध आंतों के उपकला बाधा शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास इन विट्रो विधि रोग के रोगजनन की समझ को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है, क्योंकि पशु मॉडल के निष्कर्षों ने अब तक बेडसाइड6 में खराब अनुवाद किया है।
एनईसी के दौरान खेलने वाले तंत्र की जांच करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया गया है। मानव आंतों की उपकला कोशिका रेखा, कैको -2, एनईसी 7,8 के इन विट्रो मॉडल में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली है। कैको -2 कोशिकाएं छोटी आंत की ब्रश सीमा रूपात्मक विशेषताओं का अनुकरण करती हैं, लेकिन, एक सेल लाइन के रूप में, विवो सेल प्रकारों की विस्तृत विविधता में अंतर नहीं करती हैं, जिसमें बलगम-उत्पादक गोबलेट कोशिकाएं शामिल हैं, जो अत्यधिक अनुवाद योग्य मॉडल के लिए आवश्यक हैं। एचटी -29-एमटीएक्स, मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं में एक मिश्रित एंटरोसाइट और गोबलेट सेल फेनोटाइप शामिल हैं, लेकिन अभी भी आंतों के उपकला 9 के क्रिप्ट-आधारित सेलप्रकारों की कमी है। आईईसी -6 और आईईसी -18 एक अपरिपक्व इलियल क्रिप्ट जैसी आकृति विज्ञान के साथ गैर-रूपांतरित सेल लाइनें हैं, लेकिन मानव ऊतक से प्राप्त नहीं होती हैं, जो उनकी अनुवाद क्षमता को सीमित करती हैं। एफएच 74-इंट और एच 4 आंतों की कोशिका रेखाएं मानव भ्रूण के ऊतकों से प्राप्त होती हैं और तंग जंक्शन या ध्रुवीकृत मोनोलेयर10,11 नहीं बनाती हैं, और इस प्रकार एनईसी के लिए अतिसंवेदनशील सबसे समय से पहले शिशुओं की तुलना में अपरिपक्व हैं। आमतौर पर, एनईसी इन विट्रो मॉडल टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) उपचार का उपयोग करते हैं, एनईसी12 में आंतों की सूजन शुरू करने वाला एक प्रमुख रिसेप्टर। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उपचार के माध्यम से मध्यस्थता की गई क्षति, आमतौर पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के माध्यम से, अक्सर एनईसी जैसी ऑक्सीडेटिव क्षति और एपोप्टोसिस13,14 को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाती है। आंतों की सूजन के मुख्य चालक के रूप में, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α), भड़काऊ टीएलआर 4 सिग्नलिंग का एक डाउनस्ट्रीम घटक, आमतौर पर इन इन विट्रो मॉडल में विवो रोगजनन15 में नकल करने के लिए भी उपयोग किया जाता है।
इंड्यूसिबल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न ऑर्गेनोइड, विवो आर्किटेक्चर में कॉम्प्लेक्स को पुन: पेश करने की उनकी क्षमता और ऊतक की सेल-प्रकार की संरचना के कारण आंत के इन विट्रो मॉडल के रूप में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, जिससे वे16,17 प्राप्त होते हैं। एक संबंधित इन विट्रो सिस्टम, एंटरॉइड्स, विच्छेदित आंतों के क्रिप्ट से प्राप्त ऑर्गेनोइड हैं जो आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में अधिक आसानी से स्थापित और बनाए रखे जाते हैं। एंटरॉइड आमतौर पर एक त्रि-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में उगाए जाते हैं, जिसमें प्रयोगात्मक पहुंच बेसोलेटरल सेल सतह तक सीमित होती है। माइक्रोइंजेक्शन18,19 जैसे तरीके एपिकल सतह पर इस बाधा को दूर करने के लिए विकसित किए गए हैं, लेकिन लुमेन के भीतर सेलुलर मलबे और बलगम का निर्माण तकनीकी रूप से कठिन और असंगत दोनों माइक्रोइंजेक्शन प्रदान करता है। चूंकि कस्टम रोबोट माइक्रोइंजेक्शन प्लेटफ़ॉर्म व्यापक रूपसे सुलभ नहीं हैं, तकनीकी क्षमता और सामान्य तकनीक में प्रयोगशाला-से-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ दूर करने के लिए महत्वपूर्ण चर बन जाती है। दो आयामी (2 डी) मोनोलेयर पृथक 3 डी एंटरॉइड्स से प्राप्त होते हैं, जिसमें अभी भी आंतों के उपकला के सभी प्रमुख सेल प्रकार शामिल हैं, एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देते हैं लेकिन पारंपरिक रूप से मेसेनकाइमल मायोफिब्रोब्लास्ट्स21 की फीडर परत के बिना बनाए रखना मुश्किल है। जबकि सेल संस्कृति पारगम्य समर्थन का उपयोग अंतर्निहित मायोफिब्रोब्लास्ट्स के उपयोग के बिना एंटरॉइड मोनोलेयर्स के एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है, इन आवेषणों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे तौर-तरीकों के साथ उपयोग करने से पहले झिल्ली के छांटना और बढ़ते की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करते समय अधिक तकनीकी रूप से मांग और कठिन प्रक्रियाहोती है 22. एनईसी को पारंपरिक 3 डी एंटरॉइड्स23,24,25 और पारगम्य समर्थन 26,27 का उपयोग करके कृत्रिम परिवेशीय में मॉडलिंग की गई है, और आंतों की सूजन को हाल ही में आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल 28,29 के साथ दोहराया गया है। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक्स को शामिल करने वाले आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल अब तक के सबसे उन्नत और अनुवाद योग्य मॉडल हैं, यह तकनीक महंगी, जटिल और अधिकांश जांचकर्ताओंके लिए दुर्गम है।
एपिकल-आउट एंटरॉइड तकनीकों में हालिया प्रगति ने इन विट्रो उपकला 31,32,33 की संरचनात्मक अखंडता को नुकसान पहुंचाए बिना3 डी एंटरॉइड की एपिकल सतह तक आसान पहुंच की अनुमति दी है। एपिकल-आउट एंटरॉइड विवो आंतों के उपकला में सेल प्रकार की संरचना और बाधा समारोह को साझा करते हैं, लेकिन, विशिष्ट 3 डी एंटरॉइड्स के विपरीत, इन कोशिकाओं की एपिकल सतहें संस्कृति माध्यम का सामना करती हैं, जिससे पोषक तत्व अवशोषण, माइक्रोबियल संक्रमण और ल्यूमिनल स्राव31 पर अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक अध्ययन की अनुमति मिलती है। एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का एक अतिरिक्त लाभ एंटरॉइड्स को प्रयोगात्मक एजेंटों को समरूप रूप से वितरित करने की क्षमता है। एंटरॉइड आकार के आधार पर अलग-अलग उपचार की मात्रा की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि यह माइक्रोइंजेक्शन के साथ है, और निलंबन संस्कृति में इन एंटरोइड्स को बनाए रखने की क्षमता प्रयोगात्मक एजेंट प्रसार32 पर किसी भी ईसीएम हस्तक्षेप को नकारती है।
नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस एक बहुआयामी बीमारी है जिसमें कई आंतों के उपकला कोशिका प्रकार और विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय और पैथोफिजियोलॉजिकल कारक शामिलहैं। आंतों के एंटरॉइड्स की विविध कोशिका संरचना एनईसी जैसी जटिल बीमारी के मॉडलिंग में मोनोकल्चर पर एक स्पष्ट सुधार है। दिलचस्प बात यह है कि, जबकि एक एकल भड़काऊ जोखिम अक्सर इन विट्रो मोनोकल्चर में क्षति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होता है, एंटरोइड्स, माउस मॉडल23 के साथ, एनईसी जैसी क्षति को प्रेरित करने के लिए न्यूनतम दो भड़काऊ घटकों की आवश्यकता होती है6. यहां, हम हाइपोक्सिया (एनईसी6 की एक महत्वपूर्ण नैदानिक विशेषता) और या तो एलपीएस या टीएनएफ-α के संयोजन में एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का उपयोग करके एक एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल प्रस्तुत करते हैं, एनईसी जैसी सूजन के लिए उपकला प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक बेहतर और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक के रूप में और संभावित रूप से, चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करें। हम उपकला बाधा व्यवधान और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए छोटे आंतों के 3 डी एंटरोइड्स की ध्रुवीयता को उलटने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, साथ ही एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी। अंत में, हम आगे हमारे दोहरे हिट, एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक सरल एंटरॉइड व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) अपरिपक्व शिशुओं को प्रभावित करने वाली एक विनाशकारी बीमारी है, जो आंतों की सूजन और परिगलन की विशेषता है। एंटरॉइड्स हाल ही में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकृतियों को मॉडल करने के लिए एक आशाजनक प्रणाली के रूप में उभरे हैं। हालांकि, वर्तमान में एंटरॉइड हेरफेर के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों में या तो उपकला (त्रि-आयामी [3 डी]) की एपिकल सतह तक पहुंच की कमी है या समय लेने वाली और संसाधन-गहन (दो-आयामी [2 डी] मोनोलेयर) हैं। इन विधियों को अक्सर अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि माइक्रोइंजेक्शन, मॉडल को शारीरिक रूप से अनुवाद योग्य बनने के लिए। यहां, हम एंटरॉइड ध्रुवीयता को उलटकर इन विट्रो में एनईसी का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एपिकल सतह बाहर की ओर (एपिकल-आउट) का सामना करना पड़ता है। नॉरमोक्सिक या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α) या लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के संपर्क में आने के बाद एंटरॉइड बाधा अखंडता और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है। 24 घंटे के लिए नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले 3 डी एपिकल-आउट एंटरॉइड की व्यवहार्यता का भी मूल्यांकन किया जाता है। हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले एंटरोइड्स ने उपकला वास्तुकला के विघटन, जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति का नुकसान और सेल व्यवहार्यता में कमी का प्रदर्शन किया। यह प्रोटोकॉल एक नए एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो एनईसी उपचारों के लिए संभावित उपकला लक्ष्यों की पहचान करने और चिकित्सीय के लिए अपरिपक्व आंतों की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक और लागत प्रभावी मंच प्रस्तुत करता है।

आंत्र सूजन को मॉडल करने के लिए एंटरॉइड का उपयोग, यहां तक कि नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस के संदर्भ में भी, अब आम है। हालांकि, वर्तमान में उपयोग की जाने वाली अधिकांश विधियों में या तो एंटरोइड्स की एपिकल स...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

यह प्रोटोकॉल एक एपिकल-आउट नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) -इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो उलट ध्रुवीयता के साथ छोटे आंतों के एंटरॉइड का उपयोग करता है, जिससे एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति मिलती है। हम एनईसी से संबंधित उपकला व्यवधान का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एनईसी-इन-ए-डिश प्रोटोकॉल के अधीन एपिकल-आउट एंटरॉइड्स की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।

इन विट्रो में नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस का एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

यह प्रोटोकॉल पहले एपिकल-आउट इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है और मौखिक प्रशासन के लिए संभावित चिकित्सीय के इन विट्रो मॉडलिंग की स्थापना करते समय बेसल लेटरल आउट एंटरॉइड इन-ए-डिश मॉडल पर एक महत्वपूर्ण सुधार है। यह विधि एंटरॉइड्स की एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देती है। यौगिकों को सेल मीडिया में जोड़ा जा सकता है और यौगिकों को एपिक रूप से लिया जाता है क्योंकि वे विवो में होंगे।संभावित मौखिक चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए आंतों की सूजन की इन विट्रो प्रणाली स्थापित करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं को यह तकनीक विशेष रूप से उपयोगी लग सकती है। विभिन्न उम्र और प्रजातियों से प्राप्त ऊतक को आगे मानकीकरण की आवश्यकता हो सकती है। इसलिए ध्रुवीयता उत्क्रमण समय की स्थापना करते समय रोगियों की आवश्यकता हो सकती है।3 डी एंटरॉइड्स एस्पिरेट मीडिया की ध्रुवीयता को उलटने के लिए स्थापित 3 डी बेसोलेटरल आउट एंटरॉइड्स की 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं से एस्पिरेट मीडिया। 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में पांच मिलीमोलर बर्फ ठंड, ईडीटीए या पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे पी 200 पिपेट के साथ पांच से छह बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके तहखाने झिल्ली निकालने या बाह्य मैट्रिक्स गुंबद को यांत्रिक रूप से बाधित करें। चार कुओं की सामग्री को 15 मिलीलीटर क्रोनिक ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिर ट्यूब में आठ मिलीलीटर बर्फ ठंडा ईडीटीए स्लैश पीबीएस जोड़ें। शेष 20 कुओं को इसी तरह से स्थानांतरित करें। 330 आरपीएम पर एक घूर्णन मंच या शेकर पर एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।इनक्यूबेशन के बाद ट्यूबों अपकेंद्रित्र और प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। डीएमईएम एफ 12 के पांच मिलीलीटर के साथ छर्रों को मिलाएं और धो लें। फिर कोशिकाओं के निलंबन को अपकेंद्रित्र करें और ट्यूब में एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के 12 मिलीलीटर जोड़ने से पहले सतह पर तैरनेवाला को हटा दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सेल छर्रों को फिर से निलंबित कर दिया जाए।24 अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट के प्रत्येक कुएं में एंटरॉइड निलंबन के पिपेट 500 माइक्रोलीटर। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर दो से पांच दिनों के लिए या जब तक एंटरोइड्स ध्रुवीयता को उलट नहीं देते हैं, तब तक सेते हैं। पहले दिन, 24 अच्छी तरह से प्लेट के चार कुओं की सामग्री को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।एक अलग ट्यूब में प्रत्येक उपचार के साथ सभी वांछित कुओं के लिए दोहराएं। ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और कमरे के तापमान पर एल्डिहाइड फिक्सेटिव से 4% के 300 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। 30 मिनट के बाद छर्रों को पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ धो लें।ट्यूबों में 0.1% ट्राइटन एक्स 100 के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए ट्यूबों सेते हैं। इसके बाद, ट्यूबों को रोटेटर या शेकर पर 200 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर रखें।अंतिम इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस टी में 10% एनडीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। इनक्यूबेशन दौरान, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। अगले दिन गोली के आकार के आधार पर ट्यूबों में 250 से 500 माइक्रोलीटर पीबीएस टी जोड़ें, और उन्हें दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 200 आरपीएम पर रोटेटर या शेकर पर रखें।माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और अंधेरे में दो से आठ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेते हैं। अगले दिन, ट्यूबों को कताई करके और सतह पर तैरनेवाला के 100 माइक्रोलीटर को हटाकर एंटरॉइड्स को बढ़ते हुए सना हुआ एपिकल के लिए आगे बढ़ें। सतह पर तैरनेवाला के शेष 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को 500 माइक्रोलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।20 सेकंड के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र में ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और कमरे के तापमान के 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें लाल न्यूक्लिक एसिड दाग। इनक्यूबेशन के 20 मिनट के बाद, कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें।दूसरे धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला के 70 माइक्रोलीटर को हटा दें और पीबीएस की शेष मात्रा में छर्रों को फिर से निलंबित करें। फिर सेल निलंबन को लेबल 24 से 60 मिलीमीटर कवर पर्ची में स्थानांतरित करें। सीधे नमूने पर माउंटेंट के 75 माइक्रोलीटर लागू करें और एक पिपेट टिप के साथ किसी भी बुलबुले को हटा दें।अंधेरे में रात भर इलाज करने के बाद, कवर स्लिप्स पर ग्लिसरॉल की एक पतली परत लागू करें, फिर कवर स्लिप्स को ग्लास स्लाइड पर माउंट करें और धीरे-धीरे इसे जगह में दबाएं। कवर स्लिप और स्लाइड के बीच किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए टैप करें। कवर पर्ची को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ 20 गुना आवर्धन पर एंटरॉइड्स को इमेजिंग करने से पहले दो घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति दें।एंटरॉइड उपचार के लिए, पाठ पांडुलिपि में वर्णित 24 घंटे के लिए डिश मॉडल में नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस को एक एपिकल आउट स्थापित करें। परख करने से पहले, शेष 400 माइक्रोलीटर छोड़कर प्रत्येक कुएं से मीडिया के 100 माइक्रोलीटर हटा दें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें।सेल लिसिस को प्रेरित करने के लिए 200 आरपीएम पर पांच मिनट के लिए प्लेट शेकर पर सामग्री को सख्ती से मिलाएं। अगला, 200 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी तरह से स्पष्ट तली वाली प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। शेष 600 माइक्रोलीटर के लिए दोहराएं जो प्रति अच्छी तरह से चार तकनीकी प्रतिकृति बनाते हैं।ल्यूमिनेसेंस में सक्षम प्लेट रीडर का उपयोग करके, 0.25 मिलीसेकंड एकीकरण पर मूल्यों को रिकॉर्ड करें और उपचार के बीच सापेक्ष मूल्यों की तुलना करें। नियंत्रण के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला लुमेन की ओर नाभिक के एपिकल आउट स्थानीयकरण और उपकला के बाहरी किनारे पर खलनायक का पता लगाने की पुष्टि की। नियंत्रण की तुलना में, अकेले लिपो पॉलीसेकेराइड, ट्यूमर नेक्रोसिस अल्फा, या हाइपोक्सिया के संपर्क में सकल कोशिका आकृति विज्ञान ई-कैडरिन या खलनायक स्थानीयकरण या फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन नहीं हुआ।हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में लिपो पॉलीसेकेराइड या ट्यूमर नेक्रोसिस अल्फा के साथ उपचार ने उपकला वास्तुकला को बाधित किया और ईसीए सुनवाई और खलनायक धुंधला होने के नुकसान से पता चला पालन जंक्शन और ब्रश सीमा प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक महत्वपूर्ण नुकसान प्रदर्शित किया। एपिकल आउट सेल व्यवहार्यता नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत निर्धारित की गई थी। नियंत्रण लिपो पॉलीसेकेराइड या ट्यूमर नेक्रोसिस अल्फा की तुलना में नॉरमोक्सिक स्थितियों के तहत एंटरॉइड्स की सेल व्यवहार्यता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया।हालांकि, अकेले हाइपोक्सिया की तुलना में हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में लिपो पॉलीसेकेराइड या ट्यूमर नेक्रोसिस अल्फा में व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी देखी गई। एपिकल आउट इन-ए-डिश मॉडल की स्थापना करते समय। सेल निलंबन बर्फ ठंडा में ईडीटीए रखना याद रखें।यह ध्रुवीयता उत्क्रमण को बढ़ाएगा और यह सुनिश्चित करेगा कि सभी ईसीएम ठीक से तरलीकृत और हटा दिए गए हैं। अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग जैसे कि क्यूपीसीआर, आरएनए-सीक, पश्चिमी सोख्ता या बाधा पारगम्यता के कार्यात्मक मूल्यांकन को हाइपोक्सिया में भड़काऊ सिग्नलिंग की प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए आगे किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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एक में स्टेम सेल प्रत्यारोपण इन विट्रो में नकली मॉडल / Ischemia reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

भ्रूण शराब एक्सपोजर Zebrafish मॉडल में teratogenic परिवर्तन का आकलन

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

एक के रूप में मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (cEND) में खिंचाव<em&gt; इन विट्रो में</emब्लड ब्रेन बैरियर के&gt; घाव मस्तिष्क चोट मॉडल

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

एक के रूप में मस्तिष्क Microslices की excitotoxic उत्तेजना<em&gt; इन विट्रो</em&gt; स्ट्रोक के मॉडल

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

माउस के Isometric सिकुड़ना माप Mesenteric धमनी का उपयोग तार Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के विट्रो मॉडल में

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

वैस्कुलर मेडिकल डिवाइसेज की हेमोसिटोकम्पेबिलिटी और होस्ट सेल एक्टिवेशन की जांच करने के लिए एक इन विट्रो हेमोडायनामिक लूप मॉडल

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

ह्यूमन कार्डियक मायोसाइट्स मॉडल में हाइपोथर्मिया-प्रीसींडीशनिंग के बाद मायोकार्डियल प्रोटेक्शन का इन विट्रो असेसमेंट

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

प्रयोगात्मक स्टेटोसिस इन विट्रोका एक मॉडल: लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस का एक नवजात BALB / c माउस मॉडल

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...