Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). Ringraziamo il Laboratorio per la ricerca di biologia molecolare e citometria dell'OUHSC per l'uso della Core Facility, che ha fornito l'imaging confocale.

Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. Campioni di convenienza dell'intestino tenue da un primate pretermine non umano (NHP, 90% gestazione, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo #101523-16-039-I).
1. Istituzione del modello NEC-in-a-dish enteroide apical-out<...

Il recente sviluppo di modelli enteroidi derivati da cripte epiteliali intestinali consente un tessuto in vitro più fisiologicamente rilevante in cui studiare la patogenesi dell'enterocolite necrotizzante. Nonostante includano tutti i principali tipi di cellule differenziate dell'epitelio intestinale, gli enteroidi 3D sono ancora soggetti a diverse limitazioni significative. Gli enteroidi convenzionali basolaterali-out sono sospesi in cupole di idrogel ECM 3D, la cui composizione e densità possono limitare la ...

L'enterocolite necrotizzante (NEC), una grave malattia infiammatoria dell'intestino tenue che si verifica fino al 10% dei neonati pretermine, è comunemente associata ad elevata morbilità e mortalità 1,2. I tassi di mortalità che si avvicinano al 50% nei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g), che richiedono un intervento chirurgico, non sono rari3. Mentre l'esatta eziologia di NEC non è attualmente compresa, si ritiene che i fattori di rischio, come l'alimentazione artificiale, si aggravino con anomalie fisiologiche, come la disbiosi, un epitelio intestinale immaturo e una barriera intestinale disfunzionale, nello sviluppo della malattia 2,4. Nonostante gli sforzi significativi, nell'ultimo decennio si sono verificati pochi progressi nella prevenzione o nel trattamento del NEC5. È necessario un nuovo metodo in vitro per studiare la NEC e la disfunzione della barriera epiteliale intestinale associata per far progredire la comprensione della patogenesi della malattia, poiché i risultati dei modelli animali hanno, finora, tradotto male al lettodel paziente 6.
Un certo numero di modelli in vitro sono stati utilizzati per studiare i meccanismi in gioco durante NEC. La linea cellulare epiteliale intestinale umana, Caco-2, è tra i modelli in vitro più comunemente utilizzati di NEC 7,8. Le cellule Caco-2 emulano le caratteristiche morfologiche del bordo del pennello dell'intestino tenue, ma, come linea cellulare, non si differenziano nell'ampia varietà di tipi di cellule in vivo, comprese le cellule caliciformi che producono muco, richieste per un modello altamente traducibile. HT-29-MTX, cellule di adenocarcinoma del colon umano, includono un fenotipo misto di enterociti e cellule caliciformi, ma mancano ancora di tipi cellulari basati sulla cripta dell'epitelio intestinale9. IEC-6 e IEC-18 sono linee cellulari non trasformate con una morfologia immatura simile a una cripta ileale ma non derivano da tessuto umano, limitando la loro capacità traslazionale. Le linee cellulari intestinali FHs 74-Int e H4 derivano dal tessuto fetale umano e non formano giunzioni strette o monostrati polarizzati10,11, e quindi sono immature rispetto anche ai neonati più prematuri suscettibili alla NEC. Tipicamente, i modelli in vitro NEC utilizzano trattamenti lipopolisaccaridici (LPS) per indurre il recettore toll-like 4 (TLR4), un recettore importante che avvia l'infiammazione intestinale in NEC12. Il danno mediato attraverso il trattamento con specie reattive dell'ossigeno (ROS), tipicamente attraverso il perossido di idrogeno, è spesso usato per indurre danni ossidativi simili a NEC e apoptosi13,14. Come principale motore dell'infiammazione intestinale, il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), un componente a valle della segnalazione infiammatoria TLR4, è anche comunemente utilizzato in questi modelli in vitro per imitare la patogenesi in vivo 15.
Gli organoidi, generati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC), sono cresciuti in popolarità come modello in vitro dell'intestino grazie alla loro capacità di ricapitolare la complessa architettura in vivo e la composizione del tipo cellulare del tessuto da cui derivano16,17. Un sistema in vitro correlato, gli enteroidi, sono organoidi derivati da cripte intestinali resecate che sono più facilmente stabiliti e mantenuti rispetto agli organoidi derivati da iPSC. Gli enteroidi sono tipicamente coltivati in una matrice extracellulare tridimensionale (3D) (ECM) con accesso sperimentale limitato alla superficie cellulare basolaterale. Metodi, come la microiniezione18,19, sono stati sviluppati per superare questa barriera alla superficie apicale, ma l'accumulo di detriti cellulari e muco all'interno del lume rende la microiniezione sia tecnicamente difficile che incoerente. Poiché le piattaforme di microiniezione robotizzata personalizzate non sono ampiamente accessibili20, la variabilità da laboratorio a laboratorio nelle capacità tecniche e nella tecnica generale diventano variabili significative da superare con i protocolli di microiniezione. Monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi 3D dissociati, che comprendono ancora tutti i principali tipi di cellule dell'epitelio intestinale, consentono l'accesso alla superficie apicale ma sono stati tradizionalmente difficili da mantenere senza uno strato di alimentazione di miofibroblasti mesenchimali21. Mentre i supporti permeabili alla coltura cellulare possono essere utilizzati per accedere sia al lato apicale che basolaterale dei monostrati enteroidi senza l'uso di miofibroblasti sottostanti, questi inserti richiedono l'escissione e il montaggio della membrana prima dell'uso con modalità quali la microscopia confocale, risultando in un processo tecnicamente più impegnativo e difficile quando si utilizzano metodi di microscopia tradizionali22. NEC è stato modellato in vitro utilizzando enteroidi 3D tradizionali 23,24,25 e supporti permeabili 26,27, e l'infiammazione intestinale è stata recentemente replicata con modelli gut-on-a-chip 28,29. Mentre i modelli gut-on-a-chip che incorporano la microfluidica sono, di gran lunga, i modelli più avanzati e traducibili, questa tecnologia è costosa, complessa e inaccessibile alla maggior parte dei ricercatori30.
I recenti progressi nelle tecniche enteroidi apicali-out hanno permesso un accesso più facile alla superficie apicale degli enteroidi 3D senza rischiare di danneggiare l'integrità strutturale dell'epitelio in vitro 31,32,33. Gli enteroidi apicali-out condividono la composizione del tipo di cellula e la funzione barriera dell'epitelio intestinale in vivo, ma, a differenza dei tipici enteroidi 3D, le superfici apicali di queste cellule sono rivolte verso il terreno di coltura, consentendo studi più fisiologicamente rilevanti sull'assorbimento dei nutrienti, l'infezione microbica e la secrezione luminale31. Un ulteriore vantaggio degli enteroidi apical-out è la capacità di distribuire omogeneamente agenti sperimentali agli enteroidi. Non è richiesta una variazione dei volumi di trattamento in base alle dimensioni degli enteroidi, come avviene con la microiniezione, e la capacità di mantenere questi enteroidi nella coltura in sospensione annulla qualsiasi interferenza ECM sulla diffusione dell'agente sperimentale32.
L'enterocolite necrotizzante è una malattia multifattoriale che coinvolge più tipi di cellule epiteliali intestinali e una varietà di fattori ambientali e fisiopatologici34. La variegata composizione cellulare degli enteroidi intestinali è un netto miglioramento rispetto alle monocolture nella modellazione di una malattia complessa come la NEC. È interessante notare che, mentre una singola esposizione infiammatoria è spesso sufficiente per indurre danni in monocolture in vitro , gli enteroidi, come con i modelli murini23, sembrano richiedere un minimo di due componenti infiammatori per indurre danni simili a NEC6. Qui, presentiamo un modello apical-out NEC-in-a-dish, utilizzando enteroidi apical-out in combinazione con ipossia (un'importante caratteristica clinica di NEC6) e LPS o TNF-α, come modello in vitro migliorato e più fisiologicamente rilevante per studiare le risposte epiteliali all'infiammazione simile a NEC e, potenzialmente, identificare bersagli terapeutici. Descriviamo un protocollo per invertire la polarità degli enteroidi 3D dell'intestino tenue, nonché un protocollo di colorazione immunofluorescente per identificare la rottura della barriera epiteliale e le alterazioni dell'espressione proteica giunzionale. Infine, dimostriamo ulteriormente un semplice saggio di vitalità enteroide per determinare l'impatto del nostro modello NEC-in-a-dish a doppio colpo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante che colpisce i neonati pretermine, caratterizzata da infiammazione intestinale e necrosi. Gli enteroidi sono recentemente emersi come un sistema promettente per modellare le patologie gastrointestinali. Tuttavia, i metodi attualmente utilizzati per la manipolazione enteroide non hanno accesso alla superficie apicale dell'epitelio (tridimensionale [3D]) o richiedono molto tempo e risorse (monostrati bidimensionali [2D]). Questi metodi spesso richiedono passaggi aggiuntivi, come la microiniezione, affinché il modello diventi fisiologicamente traducibile. Qui, descriviamo un protocollo fisiologicamente rilevante e poco costoso per studiare NEC in vitro invertendo la polarità enteroide, con conseguente superficie apicale rivolta verso l'esterno (apical-out). Viene inoltre fornito un protocollo di colorazione immunofluorescente per esaminare l'integrità della barriera enteroide e l'espressione proteica giunzionale in seguito all'esposizione al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) o al lipopolisaccaride (LPS) in condizioni normossiche o ipossiche. Viene inoltre valutata la vitalità di enteroidi 3D apical-out esposti a LPS normossici o ipossici o TNF-α per 24 ore. Gli enteroidi esposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, hanno mostrato un'interruzione dell'architettura epiteliale, una perdita di espressione della proteina di giunzione aderente e una riduzione della vitalità cellulare. Questo protocollo descrive un nuovo modello apical-out NEC-in-a-dish che presenta una piattaforma fisiologicamente rilevante ed economica per identificare potenziali bersagli epiteliali per le terapie NEC e studiare la risposta intestinale pretermine alle terapie.

L'uso di enteroidi per modellare l'infiammazione intestinale, anche nel contesto dell'enterocolite necrotizzante, è ora comune. Tuttavia, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati non hanno accesso alla superficie apicale degli enteroidi, negando la rilevanza fisiologica dei composti destinati all'eventuale uso come terapie orali, o sono tecnicamente difficili e richiedono tempo, come con i monostrati derivati dagli enteroidi. Per aumentare l'utilità degli attuali modelli enteroidi in vitro di NEC, ab...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Questo protocollo descrive il primo modello apical-out in-a-dish ed è un miglioramento critico rispetto ai modelli enteroidi basali laterali out-a-dish quando si stabilisce la modellazione in vitro di potenziali terapie destinate alla somministrazione orale. Questo metodo consente l'accesso alla superficie apicale degli enteroidi. I composti possono essere aggiunti ai terreni cellulari e i composti vengono assorbiti apicamente come sarebbero in vivo.I ricercatori interessati a stabilire un sistema in vitro di infiammazione intestinale per testare potenziali terapie orali possono trovare questa tecnica particolarmente utile. I tessuti provenienti da età e specie diverse possono richiedere un'ulteriore standardizzazione. Quindi i pazienti mentre stabiliscono i tempi di inversione di polarità possono essere necessari.Per invertire la polarità degli enteroidi 3D, aspirare i mezzi da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di enteroidi basolaterali 3D stabiliti. Aggiungere 500 microlitri di cinque millimolari ghiacciati, EDTA o PBS a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e interrompere delicatamente meccanicamente l'estratto della membrana basale o la cupola della matrice extracellulare pipettando su e giù da cinque a sei volte con una pipetta P 200. Trasferire il contenuto di quattro pozzetti in un tubo cronico da 15 millilitri.Quindi aggiungere otto millilitri di PBS EDTA ghiacciato al tubo. Trasferire i restanti 20 pozzi nello stesso modo. Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per un'ora su una piattaforma rotante o agitatore a 330 RPM.Dopo l'incubazione centrifugare le provette ed eliminare il surnatante da ciascuna provetta. Unire e lavare il pellet con cinque millilitri di DMEM F12. Quindi centrifugare la sospensione delle cellule e rimuovere il surnatante prima di aggiungere 12 millilitri di mezzo privo di antibiotici al tubo assicurandosi che i pellet cellulari siano risospesi.Pippet 500 microlitri della sospensione enteroide in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due o cinque giorni o fino a quando gli enteroidi non hanno invertito la polarità. Il primo giorno di astensione, trasferire il contenuto di quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Ripetere l'operazione per tutti i pozzetti desiderati con ogni trattamento in un tubo separato. Centrifugare i tubi e risospendere il pellet in 300 microlitri di fissativo aldeidico al 4% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti lavare il pellet con 500 microlitri di PBS.Aggiungere 500 microlitri di 0,1% Triton X 100 ai tubi. Incubare i tubi per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, posizionare i tubi su un rotatore o agitatore a 200 RPM per 15 minuti da due a otto gradi Celsius.Dopo l'ultima incubazione, aggiungere 500 microlitri di NDS al 10% in PBS T e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti. Durante l'incubazione, preparare la soluzione anticorpale primaria. Il giorno successivo aggiungere da 250 a 500 microlitri di PBS T ai tubi a seconda delle dimensioni del pellet e posizionarli sul rotatore o sull'agitatore a 200 giri / min per un'ora da due a otto gradi Celsius.Aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale secondaria e incubare i tubi da due a otto gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, procedere al montaggio di enteroidi apicali colorati ruotando i tubi e rimuovendo 100 microlitri di surnatante. Risospendere le cellule nei restanti 100 microlitri di surnatante e trasferire la sospensione cellulare in provette da 500 microlitri.Centrifugare i tubi in una mini centrifuga per 20 secondi. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 100 microlitri di colorazione di acido nucleico rosso a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti di incubazione, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS.Dopo il secondo lavaggio e centrifugazione rimuovere 70 microlitri di surnatante e risospendere il pellet nel volume rimanente di PBS. Quindi trasferire la sospensione cellulare su un vetrino di copertura etichettato 24 per 60 millimetri. Applicare 75 microlitri di montante direttamente sul campione e rimuovere eventuali bolle con una punta di pipetta.Dopo la polimerizzazione durante la notte al buio, applicare un sottile strato di glicerolo sui vetrini del coperchio, quindi montare le scivolate di copertura sul vetrino e premerlo delicatamente in posizione. Tocca per rimuovere eventuali bolle tra la vetrina e la diapositiva. Lasciare che il vetrino del coperchio si fissi a temperatura ambiente al buio per due ore prima di visualizzare gli enteroidi a 20 volte l'ingrandimento con un microscopio confocale.Per i trattamenti enteroidi, stabilire un'enterocolite necrotizzante apicale in un modello piatto per 24 ore come descritto nel manoscritto testuale. Prima di eseguire il test, rimuovere 100 microlitri di mezzi da ciascun pozzetto lasciando i restanti 400 microlitri. Aggiungere 400 microlitri di reagente per il saggio di vitalità cellulare a ciascun pozzetto.Mescolare vigorosamente il contenuto su uno shaker a piastre per cinque minuti a 200 RPM per indurre la lisi cellulare. Quindi, trasferire 200 microlitri in un singolo pozzetto di una piastra a fondo chiaro 96. Ripetere per i restanti 600 microlitri creando quattro repliche tecniche per pozzetto.Utilizzando un lettore di piastre in grado di luminescenza, registrare i valori a 0,25 millisecondi di integrazione e confrontare i valori relativi tra i trattamenti. La colorazione rappresentativa dell'immunofluorescenza del controllo ha confermato la localizzazione apicale dei nuclei verso il lume e l'individuazione di cattivi sul bordo esterno dell'epitelio. Rispetto al controllo, l'esposizione al polisaccaride lipo, alla necrosi tumorale alfa o all'ipossia da sola non ha indotto cambiamenti evidenti nella morfologia delle cellule grossolane E-caderina o localizzazione del cattivo o intensità fluorescente.Il trattamento con lipopolisaccaride o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia ha interrotto l'architettura epiteliale e ha dimostrato una significativa perdita di aderenza della giunzione e dell'espressione proteica del bordo del pennello rivelata dalla perdita dell'udito ECA e dalla colorazione del cattivo. La vitalità delle cellule apicali è stata determinata in condizioni normossiche o ipossiche. In condizioni normossiche rispetto al controllo lipo polisaccaride o necrosi tumorale alfa non ha influenzato significativamente la vitalità cellulare degli enteroidi.Tuttavia, riduzioni significative della vitalità sono state osservate nel polisaccaride lipo o necrosi tumorale alfa in combinazione con ipossia rispetto alla sola ipossia. Stabilendo un modello apicale in-a-dish. Ricordarsi di mantenere l'EDTA nella sospensione cellulare ghiacciata.Ciò migliorerà l'inversione di polarità e assicurerà che tutta l'ECM sia correttamente liquefatta e rimossa. Altre applicazioni a valle come QPCR, RNA-seq, western blotting o valutazioni funzionali della permeabilità della barriera possono essere eseguite ulteriormente per caratterizzare la risposta alla segnalazione infiammatoria nell'ipossia.

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