Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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このコンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によって支援されています。OUHSCの分子生物学・サイトメトリー研究研究所には、共焦点イメージングを提供するコア施設の使用に感謝します。

この研究におけるすべての動物処置は、オクラホマ大学健康科学センター施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。早産非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの小腸便宜サンプルは、別の研究(プロトコル#101523-16-039-I)のために安楽死後に得られた。
1. 頂端外腸科NECインディッシュモデルの構築
<ol><li>培地および?...

腸上皮陰窩に由来する腸様モデルの最近の開発は、壊死性腸炎の病因を研究するためのより生理学的に関連する in vitro 組織を可能にする。腸上皮のすべての主要な分化細胞型を含むにもかかわらず、3Dエンテロイドは依然としていくつかの重要な制限を受ける。従来の、側底外側エンテロイドは、3D ECMヒドロゲルドームに懸濁されており、その組成および密度は、組織培養環境<sup class...

壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最大10%に発生する小腸の重篤な炎症性疾患であり、一般的に高い罹患率および死亡率と関連している1,2。外科的介入を必要とする超低出生体重(<1500g)乳児の死亡率が50%に近づくことは珍しくありません3。NECの正確な病因は現在解明されていませんが、フォーミュラフィーディングなどの危険因子は、この疾患の発症において、ジスバイオシス、未熟な腸上皮、機能不全の腸障壁などの生理学的異常と化合物化すると考えられています2,4。多大な努力にもかかわらず、NECの予防や治療は過去10年間にほとんど進展していません5。NECおよび関連する腸上皮バリア機能障害を研究するための新規なin vitro法は、動物モデルからの所見がこれまでのところベッドサイドにうまく翻訳されていないため、疾患の病因の理解を進めるために必要である6。
NEC中に作用するメカニズムを調査するために、多くのin vitroモデルが利用されている。ヒト腸管上皮細胞株であるCaco-2は、NEC 7,8の最も一般的に利用されているインビトロモデルの1つです。Caco-2細胞は、小腸のブラシボーダー形態学的特徴をエミュレートするが、細胞株として、高度に翻訳可能なモデルに必要な粘液産生杯細胞を含む多種多様なin vivo細胞型に分化しない。HT−29−MTXは、ヒト結腸腺癌細胞、混合腸細胞および杯細胞表現型を含むが、腸上皮の陰窩ベースの細胞型を依然として欠いている9。IEC-6およびIEC-18は、未熟な回腸陰窩様形態を有する非形質転換細胞株であるが、ヒト組織に由来するものではなく、それらの翻訳能力を制限する。FHs74-IntおよびH4腸細胞株は、ヒト胎児組織に由来し、タイトジャンクションまたは分極単層10,11を形成しないため、NECの影響を受けやすい最も未熟児と比較して未熟である。典型的には、NECインビトロモデルは、NEC12における腸の炎症を開始する主要な受容体であるtoll様受容体4(TLR4)を誘導するために、リポ多糖(LPS)治療を利用する。活性酸素種(ROS)処理を介して媒介される損傷は、典型的には過酸化水素を介して、NEC様酸化的損傷およびアポトーシスを誘導するためにしばしば使用される13、14。腸内炎症の主な駆動因子として、炎症性TLR4シグナル伝達の下流成分である腫瘍壊死因子−α(TNF−α)もまた、インビボ病因を模倣するためにこれらのインビトロモデルにおいて一般的に利用されている15。
誘導性多能性幹細胞(iPSC)から生成されたオルガノイドは、それらが由来する組織の複雑なin vivoアーキテクチャおよび細胞型組成を再現する能力のために、腸のin vitroモデルとして人気が高まっている16,17。関連するin vitro系であるエンテロイドは、切除された腸陰窩に由来するオルガノイドであり、iPSC由来オルガノイドよりも容易に確立および維持される。エンエロイドは、典型的には、基底側細胞表面への実験的アクセスが制限された三次元(3D)細胞外マトリックス(ECM)中で増殖される。マイクロインジェクション18,19などの方法は、頂端表面に対するこの障壁を克服するために開発されてきたが、内腔内のスラウド細胞破片および粘液の蓄積は、マイクロインジェクションを技術的に困難かつ一貫性のないものにする。カスタムロボットマイクロインジェクションプラットフォームは広くアクセスできないため、技術能力と一般的な技術におけるラボ間のばらつきは、マイクロインジェクションプロトコルで克服すべき重要な変数になります。解離した3D腸突起に由来する2次元(2D)単層は、依然として腸上皮のすべての主要な細胞型を含み、頂端表面へのアクセスを可能にするが、間葉系筋線維芽細胞21のフィーダー層なしで維持することは伝統的に困難であった。細胞培養透過性支持体は、根底にある筋線維芽細胞を使用せずにエンテロイド単層の頂端側および基底側の両方にアクセスするために使用することができるが、これらの挿入物は、共焦点顕微鏡法などのモダリティで使用する前に膜の切除および取り付けを必要とし、従来の顕微鏡法22を使用する場合、より技術的に要求の厳しい困難なプロセスをもたらす。NECは、従来の3Dエンテロイド23,24,25および透過性サポート26,27を使用してインビトロでモデル化されており、腸の炎症は最近、腸内オンチップモデル28,29で再現されている。マイクロフルイディクスを組み込んだガット・オン・ア・チップ・モデルは、群を抜いて最も先進的で翻訳可能なモデルですが、この技術は高価で複雑で、ほとんどの研究者にとってアクセスできません30。
頂端アウト腸突起技術の最近の進歩は、in vitro上皮の構造的完全性への損傷を危険にさらすことなく、3D腸ロイドの頂端表面への容易なアクセスを可能にした31,32,33。頂端外腸ロイドは、in vivo腸上皮の細胞型組成およびバリア機能を共有するが、典型的な3D腸状腸炎とは異なり、これらの細胞の頂端表面は培養培地に面しており、栄養素の吸収、微生物感染、および管腔分泌に関するより生理学的に関連性のある研究を可能にする31。頂端アウトエンテロイドのさらなる利点は、実験薬剤をエンテロイドに均質に分配する能力である。マイクロインジェクションの場合のように、エンテロイドサイズに基づいて治療量を変えることは必要なく、浮遊培養においてこれらのエンテロイドを維持する能力は、実験薬剤拡散32に対するECM干渉を否定する。
壊死性腸炎は、複数の腸上皮細胞型および様々な環境的および病態生理学的因子を含む多因子疾患である34。腸管腸薬の多様な細胞組成は、NECなどの複雑な疾患をモデル化する上での単一培養に対する明らかな改善である。興味深いことに、単一の炎症性曝露がin vitro単培養において損傷を誘発するのに十分であることが多いが、エンテロイドは、マウスモデル23と同様に、NEC様損傷を誘発するために少なくとも2つの炎症性成分を必要とするようである6。ここでは、NEC様炎症に対する上皮応答を研究し、潜在的に治療標的を特定するための改良された生理学的関連性の高いin vitroモデルとして、頂端アウト腸ロイドを低酸素症(NEC6の重要な臨床的特徴)およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて使用する頂端アウトNECインディッシュモデルを提示する。我々は、小腸3Dエンテロイドの極性を逆転させるためのプロトコル、ならびに上皮バリア破壊および接合タンパク質発現変化を同定するための免疫蛍光染色プロトコルについて記載する。最後に、我々はさらに、我々のデュアルヒット、アディッシュ内のNECインディッシュモデルの影響を決定するために、単純な腸突起生存率アッセイを実証した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

壊死性腸炎(NEC)は、腸の炎症および壊死を特徴とする早産児に影響を及ぼす壊滅的な疾患である。エンテロイドは最近、胃腸病理をモデル化する有望なシステムとして浮上している。しかし、腸内障操作のために現在利用されている方法は、上皮の頂端表面へのアクセスを欠いているか(3次元[3D])、または時間がかかり、リソースを大量に消費する(2次元[2D]単分子層)。これらの方法は、モデルが生理学的に翻訳可能になるために、マイクロインジェクションなどの追加のステップを必要とすることが多い。ここでは、腸突起極性を反転させることによってNECを in vitroで 研究するための生理学的関連性のある安価なプロトコルを記載し、頂端表面が外側を向く(apical-out)。正常酸素または低酸素条件下での腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)またはリポ多糖(LPS)への曝露後のエンテロイドバリア完全性および接合タンパク質発現を調べるための免疫蛍光染色プロトコルも提供される。正常酸素性または低酸素性のLPSまたはTNF-αに24時間曝露された3D頂端アウト腸ロイドの生存率も評価される。LPSまたはTNF-αのいずれかに曝露されたエンテロイドは、低酸素症と組み合わせて、上皮構造の破壊、接着接合タンパク質発現の喪失、および細胞生存率の低下を示した。このプロトコルは、NEC療法の潜在的な上皮標的を特定し、治療薬に対する早産腸応答を研究するための生理学的関連性と費用対効果の高いプラットフォームを提示する新しい頂端アウトNECインディッシュモデルを記述しています。

腸の炎症をモデル化するための腸溶の使用は、壊死性腸炎の文脈の中でも、現在一般的である。しかしながら、現在利用されているほとんどの方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを欠いているか、経口治療薬としての最終的な使用を意図した化合物の生理学的関連性を否定するか、またはエンテロイド由来単分子層と同様に技術的に困難で時間がかかる。NECの現在のin vitro?...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

このプロトコルは、極性が逆の小腸炎を利用し、頂端表面へのアクセスを可能にする頂端外壊死性腸炎(NEC)-in-a-dishモデルを記述する。NEC関連上皮破壊を検出するための免疫蛍光染色プロトコールと、NECインディッシュプロトコルに供するアピカルアウトエンテロイドの生存率を決定する方法を提供します。

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

このプロトコルは、最初の頂端アウトインアディッシュモデルについて説明し、経口投与を目的とした潜在的な治療法のin vitroモデリングを確立する際の基底側外側アウト腸内ディッシュモデルよりも重要な改善です。この方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを可能にする。化合物は細胞培地に添加することができ、化合物はin vivoの場合と同様に頂端に取り込まれます。潜在的な経口治療薬をテストするために腸の炎症のin vitroシステムを確立することに関心のある研究者は、この技術が特に有用であると判断するかもしれません。異なる年齢や種から供給された組織は、さらなる標準化を必要とするかもしれません。したがって、極性反転時間を確立しながら患者が必要になる場合があります。3Dエンテロイドの極性を逆転させるために、確立された3D基底外側外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。500マイクロリットルの5ミリモルの氷冷、EDTA、またはPBSを24ウェルプレートの各ウェルに加え、P 200ピペットで5〜6回上下にピペッティングすることにより、基底膜抽出物または細胞外マトリックスドームを穏やかに機械的に破壊します。4つのウェルの内容物を15ミリリットルの記録チューブに移します。次に、8ミリリットルの氷冷EDTAスラッシュPBSをチューブに追加します。残りの20ウェルを同様に移す。チューブを摂氏4度で330RPMの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを遠心分離し、各チューブから上清を廃棄する。ペレットを5ミリリットルのDMEM F12と組み合わせて洗浄します。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去してから、12ミリリットルの抗生物質を含まない培地をチューブに追加し、細胞ペレットが再懸濁されるようにします。500マイクロリットルの腸内懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルにピペットする。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2〜5日間、またはエンテロイドが極性が逆になるまでインキュベートします。棄権初日目に、24ウェルプレートの4つのウェルの内容物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。別々のチューブで各処理を行い、すべての所望のウェルについて繰り返します。チューブを遠心分離し、室温でアルデヒド固定液から4%の300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。30分後、ペレットを500マイクロリットルのPBSで洗浄する。500マイクロリットルの0.1%トリトンX 100をチューブに追加します。チューブを室温で1時間インキュベートします。次に、チューブをローテーターまたはシェーカーに200 RPMで2〜8°Cで15分間置きます。最後のインキュベーションの後、PBS Tに500マイクロリットルの10%NDSを加え、室温で45分間インキュベートします。インキュベーション中に、一次抗体溶液を調製します。翌日、ペレットのサイズに応じて250〜500マイクロリットルのPBS Tをチューブに加え、摂氏2〜8度で1時間、200RPMでローテーターまたはシェーカーに置きます。200マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、暗所で摂氏2〜8度でチューブをインキュベートします。翌日、チューブを回転させ、100マイクロリットルの上清を除去して、染色された頂端アウトエンテロイドの取り付けに進みます。残りの100マイクロリットルの上清に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を500マイクロリットルのチューブに移します。チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを100マイクロリットルの室温遠赤色核酸染色剤に再懸濁する。20分間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。2回目の洗浄および遠心分離の後、70マイクロリットルの上清を除去し、ペレットをPBSの残量に再懸濁する。次に、セル懸濁液をラベルの付いた24 x 60ミリメートルのカバースリップに移します。75マイクロリットルの封入剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を取り除きます。暗闇で一晩硬化させた後、グリセロールの薄層をカバースリップに塗布し、カバースリップをスライドガラスに取り付けて、所定の位置にそっと押し込みます。タップして、カバースリップとスライドの間の気泡を取り除きます。カバースリップを室温で暗所で2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でエンテロイドをイメージングします。腸管治療の場合、本文に記載されているように、皿モデルで24時間根尖性壊死性腸炎を確立します。アッセイを実行する前に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り除き、残りの400マイクロリットルを残します。400マイクロリットルの細胞生存率アッセイ試薬を各ウェルに加えます。内容物をプレートシェーカーで200 RPMで5分間激しく混合し、細胞溶解を誘導します。次に、200マイクロリットルを96ウェルクリアボトムプレートの単一ウェルに移します。残りの600マイクロリットルについても繰り返し、ウェルごとに4つのテクニカルレプリケートを作成します。発光が可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、処理間の相対値を比較します。コントロールの代表的な免疫蛍光染色により、内腔に向かう核の頂端部局在と上皮の外縁での悪役の検出が確認されました。対照と比較して、リポ多糖、腫瘍壊死アルファ、または低酸素症単独への曝露は、総細胞形態E-カドヘリンまたは悪役局在または蛍光強度の明白な変化を誘発しなかった。低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファによる治療は、上皮構造を破壊し、ECA聴覚の喪失および悪役染色によって明らかにされた接着接合部およびブラシ境界タンパク質発現の有意な喪失を示した。頂端アウト細胞生存率は、正常酸素または低酸素条件下で決定した。対照と比較して正常酸素条件下では、リポ多糖または腫瘍壊死αはエンテロイドの細胞生存率に有意に影響しなかった。しかし、低酸素症単独と比較して、低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファでは、生存率の有意な低下が観察されました。.アピカルアウトインアディッシュモデルを確立しながら。EDTAをセル懸濁液の氷冷状態に保つことを忘れないでください。これにより、極性反転が強化され、すべてのECMが適切に液化および除去されます。QPCR、RNA-seq、ウェスタンブロッティング、バリア透過性の機能評価などの他のダウンストリームアプリケーションは、低酸素状態における炎症性シグナル伝達に対する応答を特徴付けるためにさらに実行できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

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インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

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