Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. HC는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 P20GM134973에 의해 지원됩니다. KB는 어린이 병원 재단 (CHF)과 장로교 건강 재단 (PHF) 보조금의 지원을 받습니다. 우리는 공초점 이미징을 제공 한 핵심 시설의 사용에 대한 OUHSC의 분자 생물학 및 세포 측정 연구 연구소에 감사드립니다.

이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 조산 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 비봉, 파피오 아누비스)로부터의 소장 편의 샘플을 별도의 연구를 위해 안락사 후 수득하였다(프로토콜 #101523-16-039-I).
1. 아피칼 아웃 엔테로이드 NEC-in-a-dish 모델 구축
<ol><li>배지 및 엔테로이드 치료?...

장 상피 크립트에서 유래 된 엔테로이드 모델의 최근 개발은 괴사 성 장염 병인을 연구하는보다 생리학적으로 관련된 시험관 내 조직을 허용합니다. 장 상피의 모든 주요 분화된 세포 유형을 포함함에도 불구하고, 3D 엔테로이드는 여전히 몇 가지 중요한 제한의 대상이 된다. 종래의, 기저측성-아웃 엔테로이드는 3D ECM 하이드로겔 돔에 현탁되며, 그 조성 및 밀도는 조직 배양 환경<sup class="xr...

조산아의 최대 10 %에서 발생하는 소장의 심각한 염증성 질환 인 괴사 성 장염 (NEC)은 일반적으로 높은 이환률 및 사망률 1,2과 관련이 있습니다. 외과 적 개입이 필요한 매우 낮은 출생 체중 (<1500g) 유아의 사망률이 50 %에 근접하는 것은 드문 일이 아닙니다3. NEC의 정확한 병인은 현재 이해되지 않았지만, 수식 먹이기와 같은 위험 요소는 질병2,4의 발달에서 dysbiosis, 미성숙 장 상피 및 기능 장애 장 장벽과 같은 생리 학적 이상을 가진 화합물로 생각됩니다. 상당한 노력에도 불구하고, NEC의 예방 또는 치료에 거의 진전이 없었다 지난 십 년동안 5. NEC 및 관련 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하기위한 새로운 시험관 내 방법은 동물 모델의 연구 결과가 지금까지 침대 옆으로 잘못 번역 된 것처럼 질병의 병인에 대한 이해를 증진시키는 데 필요합니다6.
다수의 시험관내 모델이 NEC 동안 작용 메카니즘을 조사하기 위해 이용되었다. 인간 장 상피 세포주인 Caco-2는 NEC 7,8의 시험관내 모델에서 가장 일반적으로 활용되는 모델 중 하나입니다. Caco-2 세포는 소장의 테두리 형태학적 특징을 에뮬레이트하지만, 세포주로서, 점액 생성 잔 세포를 포함하는 매우 다양한 생체내 세포 유형으로 분화되지 않으며, 고도로 번역가능한 모델에 요구된다. HT-29-MTX, 인간 결장 선암종 세포는, 혼합된 장내세포 및 잔 세포 표현형을 포함하지만, 여전히 장내 상피9의 크립트계 세포 유형이 결여되어 있다. IEC-6 및 IEC-18은 미성숙 장폐색-유사 형태를 갖는 형질전환되지 않은 세포주이지만, 인간 조직으로부터 유래되지 않으며, 이들의 번역 능력을 제한한다. FHs 74-Int 및 H4 장 세포주는 인간 태아 조직으로부터 유래되고 단단한 접합부 또는 편광 단층10,11을 형성하지 않으며, 따라서 NEC에 감수성인 가장 미숙아에 비해 미성숙하다. 전형적으로, 시험관내 NEC 모델은 NEC12에서 장 염증을 개시하는 주요 수용체인 톨 유사 수용체 4(TLR4)를 유도하기 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 치료법을 이용한다. 반응성 산소 종(ROS) 처리를 통해 매개되는 손상은, 전형적으로 과산화수소를 통해, NEC와 같은 산화적 손상 및 아폽토시스(apoptosis)13,14를 유도하는데 종종 사용된다. 장 염증의 주요 동인으로서, 염증성 TLR4 신호전달의 하류 성분인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 또한 생체내 병인(15)을 모방하기 위해 이들 시험관내 모델에서 일반적으로 활용된다.
유도성 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 생성 된 오가노이드는 이들이 유래 된 조직의 복잡한 생체 내 구조 및 세포 유형 조성을 재구성 할 수있는 능력으로 인해 장의 시험관 내 모델로서 인기를 얻었습니다16,17. 관련 시험관내 시스템인 엔테로이드는 iPSC 유래 오가노이드보다 더 쉽게 확립되고 유지되는 절제된 장내 크립트로부터 유래된 오가노이드이다. 엔테로이드는 전형적으로 기저측성 세포 표면에 제한된 실험적 접근을 갖는 3차원(3D) 세포외 매트릭스(ECM)에서 성장한다. 미세 주입18,19와 같은 방법은 정점 표면에 대한 이러한 장벽을 극복하기 위해 개발되었지만 루멘 내에 슬로프 된 세포 파편과 점액이 축적되면 미세 주입이 기술적으로 어렵고 일관성이 없습니다. 맞춤형 로봇 미세 주입 플랫폼이 널리 접근 할 수 없기 때문에20, 기술 능력 및 일반 기술의 실험실 간 변동성은 미세 주입 프로토콜로 극복하기위한 중요한 변수가됩니다. 해리된 3D 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단일층은, 여전히 장 상피의 모든 주요 세포 유형을 포함하며, 정점 표면에 대한 접근을 허용하지만, 전통적으로 중간엽 근섬유아세포(21)의 피더층 없이는 유지하기가 어려웠다. 세포 배양 투과성 지지체는 근본적인 근섬유아세포를 사용하지 않고 엔테로이드 단층의 정점 및 기저측 측면 모두에 접근하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 삽입물은 공초점 현미경과 같은 양식과 함께 사용하기 전에 막의 절제 및 장착이 필요하며, 이는 전통적인 현미경 검사법(22)을 사용할 때 기술적으로 더 까다롭고 어려운 과정을 초래한다. NEC는 전통적인 3D 엔테로이드 23,24,25 및 투과성 지지 체 26,27을 사용하여 시험관 내에서 모델링되었으며, 장 염증은 최근 장내 온 칩 모델28,29로 복제되었습니다. 미세유체학을 통합한 장-온-어-칩 모델은 지금까지 가장 진보되고 번역 가능한 모델이지만, 이 기술은 비싸고, 복잡하며, 대부분의 조사자(30)가 접근할 수 없다.
apical-out enteroid 기술의 최근 발전은 시험관내 상피31,32,33의 구조적 완전성에 대한 손상의 위험없이 3D 엔테로이드의 정점 표면에 더 쉽게 접근 할 수있게했습니다. Apical-out enteroids는 생체 내 장 상피의 세포 유형 조성 및 장벽 기능을 공유하지만, 일반적인 3D 엔테로이드와 달리 이들 세포의 정점 표면은 배양 배지에 직면하여 영양 흡수, 미생물 감염 및 발광 분비에 대한보다 생리 학적으로 관련된 연구를 가능하게합니다31. apical-out enteroids의 추가적인 이점은 실험 제제를 엔테로이드에 균질하게 분배하는 능력이다. 엔테로이드 크기에 기초한 다양한 치료 부피는 미세주입과 마찬가지로 요구되지 않으며, 현탁 배양물에서 이러한 엔테로이드를 유지하는 능력은 실험제 확산(32)에 대한 임의의 ECM 간섭을 무효화한다.
괴사성 장염은 여러 장 상피 세포 유형 및 다양한 환경 및 병리 생리학적 요인34를 포함하는 다인자 질환이다. 장 장내 장내 세포의 다양한 세포 조성은 NEC와 같은 복잡한 질병을 모델링 할 때 단일 배양에 비해 명확한 개선입니다. 흥미롭게도, 단일 염증 노출이 종종 시험관내 단일배양물에서 손상을 유도하기에 충분한 반면, 엔테로이드는 마우스 모델(23)과 마찬가지로, NEC 유사 손상을 유도하기 위해 최소 두 개의 염증 성분을 필요로 하는 것으로 보인다6. 여기에서, 우리는 저산소증 (NEC6의 중요한 임상 적 특징) 및 LPS 또는 TNF-α과 함께 apical-out enteroids를 사용하여 NEC와 같은 염증에 대한 상피 반응을 연구하고 잠재적으로 치료 표적을 확인하기 위해 개선 된 생리학 적으로 관련성이 높은 시험관 내 모델로서 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 제시합니다. 우리는 소장 3D 엔테로이드의 극성을 역전시키는 프로토콜과 상피 장벽 붕괴 및 접합 단백질 발현 변화를 확인하기위한 면역 형광 염색 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이중 히트, apical-out NEC-in-a-dish 모델의 영향을 결정하기 위해 간단한 엔테로이드 생존력 분석을 추가로 시연합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

괴사 성 장염 (NEC)은 장내 염증과 괴사를 특징으로하는 조산아에 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 엔테로이드는 최근 위장 병리를 모델링하는 유망한 시스템으로 부상했습니다. 그러나 현재 사용되는 엔테로이드 조작 방법은 상피의 정점 표면 (3 차원 [3D])에 대한 액세스가 부족하거나 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 (2 차원 [2D] 단층)입니다. 이러한 방법은 종종 모델이 생리적으로 번역 가능해지기 위해 미세 주입과 같은 추가 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 장내 극성을 역전시켜 시험관 내에서 NEC를 연구하기위한 생리 학적으로 관련되고 저렴한 프로토콜을 설명하며, 그 결과 정점 표면이 바깥쪽으로 향하게됩니다 (apical-out). 노목스 또는 저산소 조건 하에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출된 후 장내 장벽 완전성 및 접합 단백질 발현을 검사하기 위한 면역형광 염색 프로토콜이 또한 제공된다. 24시간 동안 노목성 또는 저산소 LPS 또는 TNF-α에 노출된 3D apical-out enteroids의 생존력도 또한 평가된다. 저산소증과 함께 LPS 또는 TNF-α에 노출된 엔테로이드는 상피 구조의 파괴, 부착물 접합 단백질 발현의 손실 및 세포 생존력의 감소를 나타내었다. 이 프로토콜은 NEC 요법의 잠재적 상피 표적을 식별하고 치료제에 대한 조기 장 반응을 연구하는 생리학적으로 관련되고 비용 효율적인 플랫폼을 제시하는 새로운 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 설명합니다.

장내 염증을 모델링하기 위해 엔테로이드를 사용하는 것은 괴사 성 장염의 맥락에서도 이제는 일반적입니다. 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 엔테로이드의 정점 표면에 대한 접근이 부족하여 경구 치료제로 궁극적으로 사용하기위한 화합물의 생리적 관련성을 부정하거나 엔테로이드 유래 단층과 마찬가지로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. NEC의 현재 시험관내 엔테로이...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

이 프로토콜은 최초의 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설명하며 경구 투여를 위한 잠재적 치료제의 시험관 내 모델링을 설정할 때 기저 측면 아웃 엔터로이드 인-어-디쉬 모델에 비해 중요한 개선입니다. 이 방법을 사용하면 엔터 로이드의 정점 표면에 접근 할 수 있습니다. 화합물은 세포 배지에 첨가 될 수 있으며 화합물은 생체 내에서와 같이 정점으로 흡수됩니다.잠재적인 경구 치료제를 테스트하기 위해 장 염증의 시험관 내 시스템을 구축하는 데 관심이 있는 연구자는 이 기술이 특히 유용할 수 있습니다. 다른 연령과 종에서 유래 한 조직은 추가 표준화가 필요할 수 있습니다. 따라서 환자는 극성 반전 시간을 설정하는 동안 필요할 수 있습니다.3D 엔터로이드의 극성을 반전시키기 위해 확립된 3D 기저측 아웃 엔테로이드의 24웰 플레이트의 각 웰에서 미디어를 흡입합니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 5밀리몰 아이스 콜드, EDTA 또는 PBS를 추가하고 P 200 피펫으로 5-6회 위아래로 피펫팅하여 기저막 추출물 또는 세포외 기질 돔을 기계적으로 부드럽게 방해합니다. 4 개의 우물의 내용물을 15 밀리리터의 연대기 튜브로 옮깁니다.그런 다음 8 밀리리터의 얼음처럼 차가운 EDTA 슬래시 PBS를 튜브에 첨가하십시오. 나머지 20 개의 우물을 같은 방식으로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 회전 플랫폼 또는 셰이커에서 330RPM으로 1시간 동안 배양합니다.배양 후 튜브를 원심분리하고 각 튜브로부터 상청액을 버린다. 펠릿을 5 밀리리터의 DMEM F12로 결합하고 세척하십시오. 그런 다음 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 제거한 후 튜브에 무항생제 배지 12ml를 추가하여 세포 펠릿이 재현탁되도록 합니다.피펫 500 마이크로리터의 엔테로이드 현탁액을 24 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰 내로 넣는다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 2-5일 동안 또는 엔테로이드가 극성을 바꿀 때까지 배양합니다. 기권 첫날, 24 웰 플레이트의 4 웰의 내용물을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.별도의 튜브에서 각 처리와 함께 원하는 모든 웰에 대해 반복하십시오. 튜브를 원심 분리하고 실온에서 알데히드 정착액으로부터 4 %의 300 마이크로 리터로 펠릿을 재현 탁하십시오. 30분 후 펠렛을 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.튜브에 0.1 % 트리톤 X 100 500 마이크로 리터를 추가하십시오. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브를 섭씨 2도에서 8도에서 15분 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.마지막 배양 후 PBS T에 500 마이크로 리터의 10 % NDS를 추가하고 실온에서 45 분 동안 배양합니다. 배양 중에 1 차 항체 용액을 준비하십시오. 다음날 펠릿의 크기에 따라 튜브에 250-500 마이크로 리터의 PBS T를 추가하고 섭씨 2-8도에서 1 시간 동안 200RPM의 회전 장치 또는 셰이커에 놓습니다.200 마이크로리터의 2차 항체 용액을 첨가하고 어둠 속에서 섭씨 2 내지 8도에서 튜브를 배양한다. 다음날, 튜브를 회전시키고 100 마이크로 리터의 상청액을 제거하여 염색 된 정점 엔터 로이드를 장착하십시오. 나머지 100 마이크로리터의 상청액에 세포를 재현탁시키고 세포 현탁액을 500 마이크로리터 튜브로 옮깁니다.미니 원심 분리기에서 튜브를 20 초 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하고 펠렛을 실온의 100 마이크로리터에 재현탁시켜 원적색 핵산 염색한다. 20분 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.2차 세척 및 원심분리 후 70 마이크로리터의 상청액을 제거하고 펠렛을 PBS의 나머지 부피에 재현탁시킨다. 이어서 세포 현탁액을 표지된 24 x 60 밀리미터 커버 슬립으로 옮긴다. 75마이크로리터의 마운팅제를 시편에 직접 바르고 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.어둠 속에서 밤새 경화 한 후 커버 슬립에 글리세롤을 얇게 바르고 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 부드럽게 제자리에 누릅니다. 탭하여 커버 슬립과 슬라이드 사이의 거품을 제거합니다. 커버 슬립을 어둠 속에서 실온에서 2시간 동안 방치한 후 컨포칼 현미경으로 20배 배율로 엔테로이드를 이미징합니다.장내 치료의 경우, 텍스트 원고에 설명 된대로 24 시간 동안 접시 모델에서 정점 괴사 성 장염을 확립하십시오. 분석을 수행하기 전에 각 웰에서 100 마이크로리터의 배지를 제거하여 나머지 400 마이크로리터를 남깁니다. 400 마이크로리터의 세포 생존율 분석 시약을 각 웰에 추가합니다.내용물을 플레이트 쉐이커에서 200RPM에서 5분 동안 격렬하게 혼합하여 세포 용해를 유도합니다. 다음으로, 200 마이크로 리터를 96 웰의 투명한 바닥 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 나머지 600 마이크로 리터에 대해 반복하여 웰 당 4 개의 기술 복제를 만듭니다.발광이 가능한 플레이트 리더를 사용하여 0.25밀리초 적분에서 값을 기록하고 처리 간의 상대 값을 비교합니다. 대조군의 대표적인 면역형광 염색은 내강을 향한 핵의 정점 국소화와 상피의 바깥쪽 가장자리에서 악당의 검출을 확인했다. 대조군과 비교하여 리포 다당류, 종양 괴사 알파 또는 저산소증 단독에 노출된 것은 전체 세포 형태 E-카드헤린 또는 악당 국소화 또는 형광 강도의 명백한 변화를 유도하지 않았습니다.저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파로 치료하면 상피 구조가 파괴되고 ECA 청력 및 악당 염색의 손실로 밝혀진 부착 접합부 및 브러시 경계 단백질 발현의 상당한 손실이 입증되었습니다. 정점 세포 생존율은 정상 또는 저산소 조건 하에서 결정되었다. 정상 조건 하에서 대조군과 비교하여 리포폴리사카라이드 또는 종양 괴사 알파는 엔테로이드의 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않았다.그러나, 저산소증 단독에 비해 저산소증과 함께 리포 다당류 또는 종양 괴사 알파에서 생존력의 현저한 감소가 관찰되었다. 정점 아웃 인 어 디쉬 모델을 설정하는 동안. EDTA를 세포 현탁액에 얼음처럼 차갑게 유지하는 것을 잊지 마십시오.이렇게 하면 극성 반전이 향상되고 모든 ECM이 적절하게 액화 및 제거됩니다. QPCR, RNA-seq, 웨스턴 블로팅 또는 장벽 투과성의 기능적 평가와 같은 다른 다운스트림 애플리케이션을 추가로 수행하여 저산소증에서 염증 신호 전달에 대한 반응을 특성화할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

연구

의학

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

시험관내실험용 스테토시스 모델 : 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...