Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. O HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada pela Fundação Hospitalar Infantil (CHF) e pela Fundação Presbiteriana de Saúde (PHF). Agradecemos ao Laboratório de Biologia Molecular e Pesquisa de Citometria da OUHSC pelo uso da Instalação Central, que forneceu imagens confocal.

Todos os procedimentos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center. Amostras de conveniência do intestino delgado de um primata não humano pré-médio (NHP, 90% de gestação, babuíno de oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I).
1. Estabelecimento do modelo enteroid nec-in-a-dish apical-out
<ol><li>Pre...

O desenvolvimento recente de modelos enteróides derivados de criptes epiteliais intestinais permite um tecido in vitro mais fisiologicamente relevante no qual estudar a patogênese de enterocolite necrosante. Apesar de incluir todos os principais tipos de células diferenciadas do epitélio intestinal, os enteróides 3D ainda estão sujeitos a várias limitações significativas. Os enteróides convencionais de saída basolateral são suspensos em cúpulas de hidrogel 3D ECM, a composição e a densidade das qu...

A enterocolite necrosante (NEC), doença inflamatória grave do intestino delgado que ocorre em até 10% dos bebês prematuros, está comumente associada à alta morbidade e mortalidade 1,2. As taxas de mortalidade que se aproximam de 50% em bebês com baixo peso ao nascer (<1500 g), que necessitam de intervenção cirúrgica, não são incomuns3. Embora a etiologia exata da NEC não seja compreendida atualmente, acredita-se que fatores de risco, como a alimentação de fórmulas, se compõem com anomalias fisiológicas, como disbiose, epitélio intestinal imaturo e barreira intestinal disfuncional, no desenvolvimento da doença 2,4. Apesar do esforço significativo, pouco progresso na prevenção ou tratamento da NEC ocorreu na última década5. Um novo método in vitro para estudar nec e disfunção da barreira epitelial intestinal associada é necessário para avançar na compreensão da patogênese da doença, uma vez que os achados de modelos animais têm, até agora, traduzido mal para a cabeceira6.
Vários modelos in vitro foram utilizados para investigar os mecanismos em jogo durante a NEC. A linha de células epiteliais intestinais humanas, Caco-2, está entre os modelos in vitro mais utilizados da NEC 7,8. As células caco-2 emulam características morfológicas da borda da escova do intestino delgado, mas, como linha celular, não se diferenciam na grande variedade de tipos de células in vivo, incluindo células de cálice produtoras de muco, necessárias para um modelo altamente traduzível. HT-29-MTX, células humanas de adenocarcinoma de cólon, incluem um fenótipo de células de cálice e cálice misto, mas ainda não possuem tipos de células baseadas em criptografia do epitéliointestinal 9. IEC-6 e IEC-18 são linhas celulares não transformadas com uma morfologia imatura semelhante a criptologia ileal, mas não são derivadas do tecido humano, limitando sua capacidade translacional. As linhas de células intestinais FHs 74-Int e H4 são derivadas do tecido fetal humano e não formam junções apertadas ou monocamadas polarizadas10,11, sendo assim imaturas em comparação até mesmo com os bebês mais prematuros suscetíveis à NEC. Tipicamente, os modelos in vitro nec utilizam tratamentos de lipopolisacarídeo (LPS) para induzir o receptor 4 (TLR4), um receptor importante que inicia inflamação intestinal na NEC12. Os danos mediados através do tratamento reativo de espécies de oxigênio (ROS), tipicamente via peróxido de hidrogênio, é frequentemente usado para induzir danos oxidativos semelhantes à NEC e à apoptose13,14. Como principal condutor da inflamação intestinal, o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), um componente a jusante da sinalização inflamatória TLR4, também é comumente utilizado nestes modelos in vitro para imitar a patogênese in vivo 15.
Os organoides, gerados a partir de células-tronco pluripotentes indutíveis (iPSCs), cresceram em popularidade como modelo in vitro do intestino devido à sua capacidade de recapitular a complexa arquitetura in vivo e a composição do tipo celular do tecido do qual são derivados16,17. Um sistema in vitro relacionado, enteroids, são organoides derivados de criptas intestinais resseccionadas que são mais facilmente estabelecidas e mantidas do que organoides derivados do iPSC. Os enteróides são tipicamente cultivados em uma matriz extracelular tridimensional (3D) (ECM) com acesso experimental limitado à superfície celular basolateral. Métodos, como a microinjeção 18,19, foram desenvolvidos para superar essa barreira à superfície apical, mas o acúmulo de detritos celulares e muco sloughed dentro do lúmen torna a microinjeção tecnicamente difícil e inconsistente. Como as plataformas de microinjeção robótica personalizadas não são amplamente acessíveis20, a variabilidade de laboratório para laboratório em capacidade técnica e técnica geral tornam-se variáveis significativas para serem superadas com protocolos de microinjeção. Monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides 3D dissociados, ainda compreendendo todos os principais tipos celulares do epitélio intestinal, permitem o acesso à superfície apical, mas têm sido tradicionalmente difíceis de manter sem uma camada alimentador de miofibroblastsmesenquimais 21. Embora a cultura celular suportes permeáveis possam ser usados para acessar os lados apical e basolateral das monocamadas enteróides sem o uso de miofibroblasts subjacentes, essas inserções requerem excisão e montagem da membrana antes do uso com modalidades como microscopia confocal, resultando em um processo mais exigente e difícil ao usar métodos tradicionais de microscopia22. A NEC foi modelada in vitro usando enteróides 3D tradicionais 23,24,25 e suportes permeáveis 26,27, e a inflamação intestinal foi recentemente replicada com modelos 3D-on-a-chip28,29. Embora os modelos gut-on-a-chip que incorporam microfluidos sejam, de longe, os modelos mais avançados e traduzíveis, essa tecnologia é cara, complexa e inacessível para a maioria dos investigadores30.
Os recentes avanços nas técnicas de enteroid apical-out permitiram acesso mais fácil à superfície apical de enteróides 3D sem correr o risco de danos à integridade estrutural do epitélio in vitro 31,32,33. Os enteróides apical-out compartilham a composição do tipo celular e a função de barreira do epitélio intestinal in vivo, mas, ao contrário dos enteróides 3D típicos, as superfícies apical dessas células enfrentam o meio da cultura, permitindo estudos mais fisiologicamente relevantes sobre absorção de nutrientes, infecção microbiana e secreção luminal31. Uma vantagem adicional dos enteróides apical-out é a capacidade de distribuir homogeneamente agentes experimentais para enteróides. Não é necessário variar os volumes de tratamento com base no tamanho do enteroid, como é com a microinjeção, e a capacidade de manter esses enteróides na cultura de suspensão nega qualquer interferência de ECM na difusão de agente experimental32.
Enterocolite necrosante é uma doença multifatorial que envolve múltiplos tipos de células epiteliais intestinais e uma variedade de fatores ambientais e fisiopacionológicos34. A composição celular variada de enteróides intestinais é uma clara melhora sobre monoculturas na modelagem de uma doença complexa como a NEC. Curiosamente, enquanto uma única exposição inflamatória é muitas vezes suficiente para induzir danos em monoculturas in vitro , os enteróides, como acontece com os modelos de camundongos23, parecem exigir um mínimo de dois componentes inflamatórios para induzir danos semelhantes à NEC6. Aqui, apresentamos um modelo nec-in-a-dish apical-out, usando enteróides apical-out em combinação com hipóxia (uma característica clínica importante da NEC6) e LPS ou TNF-α, como um modelo in vitro melhorado e mais fisiologicamente relevante para estudar respostas epiteliais à inflamação semelhante à NEC e, potencialmente, identificar alvos terapêuticos. Descrevemos um protocolo para reverter a polaridade de pequenos enteróides intestinais 3D, bem como um protocolo de coloração imunofluorescente para identificar a interrupção da barreira epitelial e alterações na expressão da proteína juncional. Finalmente, demonstramos ainda um simples ensaio de viabilidade enteroid para determinar o impacto do nosso modelo NEC-in-a-dish de dois sucessos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

A enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora que afeta bebês prematuros, caracterizada por inflamação intestinal e necrose. Os enteróides surgiram recentemente como um sistema promissor para modelar patologias gastrointestinais. No entanto, atualmente utilizados métodos para manipulação enteróide ou não têm acesso à superfície apical do epitélio (tridimensional [3D]) ou são demorados e intensivos em recursos (monocamadas bidimensionais [2D]). Esses métodos muitas vezes requerem etapas adicionais, como a microinjeção, para que o modelo se torne fisiologicamente translacionável. Aqui, descrevemos um protocolo fisiologicamente relevante e barato para estudar nec in vitro , invertendo a polaridade enteroid, resultando na superfície apical voltada para fora (apical-out). Um protocolo de coloração imunofluorescente para examinar a integridade da barreira enteróide e a expressão da proteína juncional após a exposição ao fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α) ou lipopólise (LPS) sob condições normóxicas ou hipoxicas também são fornecidos. Também é avaliada a viabilidade de enteróides apical-out 3D expostos a LPS normóxicos ou hipoxicos ou TNF-α por 24 h. Enteroides expostos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, apresentaram interrupção da arquitetura epitelial, perda de expressão proteica de junção e redução da viabilidade celular. Este protocolo descreve um novo modelo nec-in-a-dish apical-out que apresenta uma plataforma fisiologicamente relevante e econômica para identificar potenciais alvos epiteliais para terapias NEC e estudar a resposta intestinal pré-clusão à terapêutica.

O uso de enteróides para modelar inflamação intestinal, mesmo dentro do contexto de enterocolite necrosante, agora é comum. No entanto, a maioria dos métodos atualmente utilizados ou não tem acesso à superfície apical dos enteróides, negando a relevância fisiológica dos compostos destinados a eventual uso como terapêutica oral, ou são tecnicamente difíceis e demorados, como acontece com as monocamadas derivadas de enteróides. Para aumentar a utilidade dos modelos enteroid in vitro atuais da NEC, i...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Este protocolo descreve o primeiro modelo apical-out em um prato e é uma melhoria crítica sobre modelos enteroid lateral basal em um prato ao estabelecer modelagem in vitro de potenciais terapêuticas destinadas à administração oral. Este método permite o acesso à superfície apical de enteróides. Os compostos podem ser adicionados à mídia celular e os compostos são tomados apicamente como seriam in vivo.Pesquisadores interessados em estabelecer um sistema in vitro de inflamação intestinal para testar potenciais terapêuticas orais podem achar essa técnica especialmente útil. Tecidos provenientes de diferentes idades e espécies podem exigir maior padronização. Assim, pacientes ao estabelecer tempos de reversão de polaridade podem ser necessários.Para reverter a polaridade dos enteroids 3D aspiram a mídia de cada poço de uma placa de 24 poços de enteróides basolaterais 3D estabelecidos. Adicione 500 microliters de cinco mililitros de gelo frio, EDTA ou PBS a cada poço de uma placa de 24 poços e interrompa suavemente o extrato da membrana do porão ou a cúpula da matriz extracelular, pipeta para cima e para baixo cinco a seis vezes com uma pipeta P 200. Transfira o conteúdo de quatro poços para um tubo narrado de 15 mililitros.Em seguida, adicione oito mililitros de EDTA fria cortar PBS ao tubo. Transfira os 20 poços restantes da mesma forma. Incubar os tubos a quatro graus Celsius por uma hora em uma plataforma rotativa ou agitar a 330 RPM.Após a incubação centrifugar os tubos e descartar o sobrenatante de cada tubo. Combine e lave as pelotas com cinco mililitros de DMEM F12. Em seguida, centrifuse a suspensão das células e remova o sobrenatário antes de adicionar 12 mililitros de meio livre de antibióticos ao tubo, garantindo que as pelotas celulares sejam resuspendidas.Pippet 500 microliters da suspensão enteróide em cada poço de uma placa de fixação 24 bem ultra-baixa. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a cinco dias ou até que as enteroids tenham invertido a polaridade. No primeiro dia, transfira o conteúdo de quatro poços de uma placa de poço de 24 para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro.Repita para todos os poços desejados a cada tratamento em um tubo separado. Centrifugar os tubos e resuspensar a pelota em 300 microliters de 4% de fixação de aldeído à temperatura ambiente. Após 30 minutos lave as pelotas com 500 microliters de PBS.Adicione 500 microliters de 0,1%Triton X 100 aos tubos. Incubar os tubos por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, coloque os tubos em um rotador ou agitador a 200 RPM por 15 minutos a dois a oito graus Celsius.Após a última incubação, adicione 500 microliters de 10% NDS em PBS T e incubar em temperatura ambiente por 45 minutos. Durante a incubação, prepare a solução primária de anticorpos. No dia seguinte, adicione 250 a 500 microliters PBS T aos tubos, dependendo do tamanho da pelota, e coloque-os no rotador ou shaker a 200 RPM por uma hora a dois a oito graus Celsius.Adicione 200 microliters da solução secundária de anticorpos e incubar os tubos a dois a oito graus Celsius no escuro. No dia seguinte, prossiga para a montagem de enteróides apical manchados girando os tubos e removendo 100 microliters de supernascer. Resuspenja as células nos 100 microlitadores restantes de supernadante e transfira a suspensão celular para tubos de 500 microliteres.Centrifugar os tubos em uma mini centrífuga por 20 segundos. Remova o supernatante e resuspenja as pelotas em 100 microliters de temperatura ambiente muito vermelha mancha de ácido nucleico. Após 20 minutos de incubação, centrifugar as células e resuspensar as pelotas em 100 microlitres de PBS.Após a segunda lavagem e centrifugação remova 70 microlitadores do supernatante e resuspenja as pelotas no volume restante de PBS. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um deslizamento de cobertura de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microliters de montagem diretamente na amostra e remova quaisquer bolhas com uma ponta de pipeta.Depois de curar durante a noite no escuro, aplique uma fina camada de glicerol nos deslizamentos da tampa, em seguida, monte os deslizes de cobertura sobre o slide de vidro e pressione-o suavemente no lugar. Toque para remover quaisquer bolhas entre o deslizamento da tampa e o slide. Deixe que o deslizamento da tampa se estafina à temperatura ambiente no escuro por duas horas antes de imaginar os enteróides em 20 vezes a ampliação com um microscópio confocal.Para tratamentos enteróides, estabeleça uma enterocolite necrosante apical em um modelo de prato por 24 horas, conforme descrito no manuscrito do texto. Antes de realizar o ensaio, remova 100 microliters de mídia de cada poço deixando os 400 microliters restantes. Adicione 400 microliters de reagente de ensaio de viabilidade celular a cada poço.Misture vigorosamente o conteúdo em um agitador de placas por cinco minutos a 200 RPM para induzir a lise celular. Em seguida, transfira 200 microliters para um único poço de uma placa de fundo 96 bem clara. Repita para os 600 microliters restantes criando quatro réplicas técnicas por poço.Utilizando um leitor de placas capaz de luminescência, registos de integração de 0,25 milissegundos e compare os valores relativos entre os tratamentos. A coloração representativa da imunofluorescência de controle confirmou a localização apical dos núcleos em direção ao lúmen e a detecção de vilão na borda externa do epitélio. Em comparação com o controle, a exposição à lipo polissacarídeo, necrose tumoral alfa, ou hipoxia por si só não induziu alterações expostas na morfologia celular bruta E-cadherina ou localização de vilão ou intensidade fluorescente.O tratamento com polissacarídeo lipo ou tumor necrose alfa em combinação com a arquitetura epitelial interrompida por hipóxia e demonstrou uma perda significativa de junção de adesão e expressão de proteína de borda de escova revelada pela perda da audição do ECA e da coloração do vilão. A viabilidade celular apical foi determinada sob condições normóxicas ou hipoxicas. Sob condições normóxicas em comparação com o controle lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa não afetou significativamente a viabilidade celular dos enteróides.No entanto, reduções significativas na viabilidade foram observadas em lipo polissacarídeo ou necrose tumoral alfa em combinação com hipóxia em comparação apenas com hipóxia. Ao mesmo tempo em que estabelece apical fora em um modelo de prato. Lembre-se de manter edta no gelo de suspensão celular frio.Isso aumentará a reversão da polaridade e garantirá que todo o ECM seja devidamente liquefeito e removido. Outras aplicações a jusante, como QPCR, RNA-seq, manchas ocidentais ou avaliações funcionais de permeabilidade de barreira podem ser realizadas ainda mais para caracterizar a resposta à sinalização inflamatória na hipóxia.

Research

JoVE Journal

Medicine

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