Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
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Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children's Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Agradecemos al Laboratorio de Investigación de Biología Molecular y Citometría de OUHSC por el uso de la Instalación Básica, que proporcionó imágenes confocales.

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Se obtuvieron muestras de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% de gestación, babuino olivo, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I).
1. Establecimiento del modelo enteroide apical-out NEC-in-...

El reciente desarrollo de modelos enteroides derivados de criptas epiteliales intestinales permite un tejido in vitro fisiológicamente más relevante en el que estudiar la patogénesis necrosante de la enterocolitis. A pesar de incluir todos los principales tipos de células diferenciadas del epitelio intestinal, los enteroides 3D todavía están sujetos a varias limitaciones significativas. Los enteroides convencionales basolaterales están suspendidos en domos de hidrogel 3D ECM, cuya composición y densidad ...

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad 1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes3. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barrera intestinal disfuncional, en el desarrollo de la enfermedad 2,4. A pesar de los esfuerzos significativos, se ha avanzado poco en la prevención o el tratamiento de la ECN en la última década5. Se requiere un nuevo método in vitro para estudiar la ECN y la disfunción de la barrera epitelial intestinal asociada para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad, ya que los hallazgos de modelos animales, hasta ahora, se han traducido mal a la cabecera6.
Se han utilizado varios modelos in vitro para investigar los mecanismos en juego durante la ECN. La línea celular epitelial intestinal humana, Caco-2, se encuentra entre los modelos in vitro más utilizados de NEC 7,8. Las células Caco-2 emulan las características morfológicas del borde en cepillo del intestino delgado, pero, como línea celular, no se diferencian en la amplia variedad de tipos de células in vivo, incluidas las células caliciformes productoras de moco, requeridas para un modelo altamente traducible. HT-29-MTX, células de adenocarcinoma de colon humano, incluyen un fenotipo mixto de enterocito y cáliz, pero aún carecen de tipos de células basadas en criptas del epitelio intestinal9. IEC-6 e IEC-18 son líneas celulares no transformadas con una morfología ileal inmadura similar a la cripta pero no se derivan de tejido humano, lo que limita su capacidad de traducción. Las líneas celulares intestinales FH 74-Int y H4 se derivan del tejido fetal humano y no forman uniones estrechas ni monocapas polarizadas10,11, y por lo tanto son inmaduras en comparación incluso con los bebés más prematuros susceptibles a la ECN. Por lo general, los modelos in vitro de NEC utilizan tratamientos de lipopolisacáridos (LPS) para inducir el receptor tipo toll 4 (TLR4), un receptor importante que inicia la inflamación intestinal en NEC12. El daño mediado por el tratamiento con especies reactivas de oxígeno (ROS), típicamente a través del peróxido de hidrógeno, se utiliza a menudo para inducir daño oxidativo similar al NEC y apoptosis13,14. Como principal impulsor de la inflamación intestinal, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), un componente posterior de la señalización inflamatoria TLR4, también se utiliza comúnmente en estos modelos in vitro para imitar la patogénesis in vivo 15.
Los organoides, generados a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs), han crecido en popularidad como modelo in vitro del intestino debido a su capacidad para recapitular la compleja arquitectura in vivo y la composición de tipo celular del tejido del que se derivan16,17. Un sistema in vitro relacionado, los enteroides, son organoides derivados de criptas intestinales resecadas que son más fáciles de establecer y mantener que los organoides derivados de iPSC. Los enteroides se cultivan típicamente en una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) con acceso experimental limitado a la superficie celular basolateral. Se han desarrollado métodos, como la microinyección18,19, para superar esta barrera a la superficie apical, pero la acumulación de desechos celulares desprendidos y moco dentro del lumen hace que la microinyección sea técnicamente difícil e inconsistente. Como las plataformas de microinyección robótica personalizadas no son ampliamente accesibles20, la variabilidad de laboratorio a laboratorio en la capacidad técnica y la técnica general se convierten en variables significativas para superar con los protocolos de microinyección. Las monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides 3D disociados, que aún comprenden todos los principales tipos celulares del epitelio intestinal, permiten el acceso a la superficie apical, pero tradicionalmente han sido difíciles de mantener sin una capa alimentadora de miofibroblastos mesenquimales21. Mientras que los soportes permeables al cultivo celular pueden ser utilizados para acceder tanto al lado apical como basolateral de monocapas enteroides sin el uso de miofibroblastos subyacentes, estos insertos requieren escisión y montaje de la membrana antes de su uso con modalidades como la microscopía confocal, lo que resulta en un proceso técnicamente más exigente y difícil cuando se utilizan métodos tradicionales de microscopía22. NEC se ha modelado in vitro utilizando enteroides 3D tradicionales 23,24,25 y soportes permeables 26,27, y la inflamación intestinal se ha replicado recientemente con modelos gut-on-a-chip28,29. Si bien los modelos gut-on-a-chip que incorporan microfluídica son, con mucho, los modelos más avanzados y traducibles, esta tecnología es costosa, compleja e inaccesible para la mayoría de los investigadores30.
Los avances recientes en las técnicas de enteroides apical-out han permitido un acceso más fácil a la superficie apical de enteroides 3D sin correr el riesgo de dañar la integridad estructural del epitelio in vitro 31,32,33. Los enteroides apicales comparten la composición del tipo celular y la función de barrera del epitelio intestinal in vivo, pero, a diferencia de los enteroides 3D típicos, las superficies apicales de estas células se enfrentan al medio de cultivo, lo que permite estudios fisiológicamente más relevantes sobre la absorción de nutrientes, la infección microbiana y la secreción luminal31. Una ventaja adicional de los enteroides apicales es la capacidad de distribuir homogéneamente agentes experimentales a enteroides. No se requiere variar los volúmenes de tratamiento según el tamaño enteroide, como ocurre con la microinyección, y la capacidad de mantener estos enteroides en cultivo en suspensión niega cualquier interferencia de la ECM en la difusión del agente experimental32.
La enterocolitis necrosante es una enfermedad multifactorial que involucra múltiples tipos de células epiteliales intestinales y una variedad de factores ambientales y fisiopatológicos34. La composición celular variada de los enteroides intestinales es una clara mejora sobre los monocultivos en el modelado de una enfermedad compleja como la ECN. Curiosamente, mientras que una sola exposición inflamatoria es a menudo suficiente para inducir daño en monocultivos in vitro , los enteroides, como con los modelos de ratón23, parecen requerir un mínimo de dos componentes inflamatorios para inducir un daño similar al NEC6. Aquí, presentamos un modelo apical-out NEC-in-a-dish, utilizando enteroides apical-out en combinación con hipoxia (una característica clínica importante de NEC6) y LPS o TNF-α, como un modelo in vitro mejorado y fisiológicamente más relevante para estudiar las respuestas epiteliales a la inflamación similar a la ECN y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos. Describimos un protocolo para invertir la polaridad de enteroides 3D del intestino delgado, así como un protocolo de tinción inmunofluorescente para identificar la interrupción de la barrera epitelial y las alteraciones de la expresión de proteínas de unión. Finalmente, demostramos además un ensayo de viabilidad enteroide simple para determinar el impacto de nuestro modelo NEC-in-a-a-dish de doble golpe y salida apical.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

El uso de enteroides para modelar la inflamación intestinal, incluso en el contexto de la enterocolitis necrosante, es ahora común. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados actualmente carecen de acceso a la superficie apical de los enteroides, negando la relevancia fisiológica de los compuestos destinados a su uso eventual como terapéutica oral, o son técnicamente difíciles y requieren mucho tiempo, como con las monocapas derivadas de enteroides. Para aumentar la utilidad de los modelos enteroides i...

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In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Este protocolo describe el primer modelo apical-out in-a-dish y es una mejora crítica sobre los modelos basales laterales enteroides en una placa al establecer el modelado in vitro de posibles terapias destinadas a la administración oral. Este método permite el acceso a la superficie apical de los enteroides. Los compuestos se pueden agregar a los medios celulares y los compuestos se absorben apicalmente como lo harían in vivo.Los investigadores interesados en establecer un sistema in vitro de inflamación intestinal para probar posibles terapias orales pueden encontrar esta técnica especialmente útil. El tejido procedente de diferentes edades y especies puede requerir una mayor estandarización. Por lo tanto, los pacientes pueden ser necesarios al establecer tiempos de inversión de polaridad.Para invertir la polaridad de los enteroides 3D, aspira medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos. Agregue 500 microlitros de cinco milimolares helados, EDTA o PBS a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal o la cúpula de la matriz extracelular pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces con una pipeta P 200. Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cronometrado de 15 mililitros.Luego agregue ocho mililitros de EDTA helado que cortan PBS al tubo. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera. Incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora en una plataforma giratoria o agitador a 330 RPM.Después de la incubación, centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante de cada tubo. Combine y lave los gránulos con cinco mililitros de DMEM F12. Luego centrifugar la suspensión celular y retirar el sobrenadante antes de añadir 12 mililitros de medio libre de antibióticos al tubo asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.Pipepet 500 microlitros de la suspensión enteroide en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cinco días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad. En el primer día de abstención, transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Repita para todos los pozos deseados con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos y resuspender el pellet en 300 microlitros de fijador de aldehído al 4% a temperatura ambiente. Después de 30 minutos lavar los pellets con 500 microlitros de PBS.Agregue 500 microlitros de 0.1% Triton X 100 a los tubos. Incubar los tubos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, coloque los tubos en un rotador o agitador a 200 RPM durante 15 minutos a dos a ocho grados centígrados.Después de la última incubación, agregue 500 microlitros de 10% NDS en PBS T e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante la incubación, prepare la solución primaria de anticuerpos. Al día siguiente, agregue de 250 a 500 microlitros PBS T a los tubos dependiendo del tamaño del pellet, y colóquelos en el rotador o agitador a 200 RPM durante una hora a dos a ocho grados centígrados.Agregue 200 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios e incube los tubos a dos a ocho grados centígrados en la oscuridad. Al día siguiente, proceda a montar enteroides apicales teñidos girando los tubos y retirando 100 microlitros de sobrenadante. Resuspender las células en los 100 microlitros restantes de sobrenadante y transferir la suspensión celular a tubos de 500 microlitros.Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 segundos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tinción de ácido nucleico rojo lejano a temperatura ambiente. Después de 20 minutos de incubación, centrifugar las células y resuspender los gránulos en 100 microlitros de PBS.Después del segundo lavado y centrifugación, retire 70 microlitros del sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en el volumen restante de PBS. Luego transfiera la suspensión celular a un cubreobjetos etiquetado de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microlitros de montante directamente sobre la muestra y elimine cualquier burbuja con una punta de pipeta.Después de curar durante la noche en la oscuridad, aplique una capa delgada de glicerol a los resbalones de la cubierta, luego monte los deslizamientos de la cubierta en el portaobjetos de vidrio y presiónelo suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre la cubierta y la corredera. Permita que la cubierta se fije a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas antes de obtener imágenes de los enteroides con un aumento de 20 veces con un microscopio confocal.Para los tratamientos enteroides, establecer una enterocolitis necrotizante apical en un modelo de plato durante 24 horas como se describe en el manuscrito de texto. Antes de realizar el ensayo, retire 100 microlitros de medios de cada pocillo dejando los 400 microlitros restantes. Agregue 400 microlitros de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.Mezcle vigorosamente el contenido en un agitador de placas durante cinco minutos a 200 RPM para inducir la lisis celular. A continuación, transfiera 200 microlitros a un solo pocillo de una placa de fondo transparente de 96 pozos. Repita para los 600 microlitros restantes creando cuatro réplicas técnicas por pozo.Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 milisegundos de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. La tinción de inmunofluorescencia representativa del control confirmó la localización apical de los núcleos hacia el lumen y la detección de villano en el borde exterior del epitelio. En comparación con el control, la exposición a lipopolisacáridos, necrosis tumoral alfa o hipoxia sola no indujo cambios manifiestos en la morfología de las células macroscópicas E-cadherina o localización de villanos o intensidad fluorescente.El tratamiento con lipopolisacárido o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia interrumpió la arquitectura epitelial y demostró una pérdida significativa de la unión de adherencia y la expresión de proteínas del borde en cepillo revelada por la pérdida de audición ECA y tinción de villanos. La viabilidad celular apical se determinó en condiciones normóxicas o hipóxicas. En condiciones normóxicas en comparación con el lipopolisacárido control o la necrosis tumoral alfa no afectó significativamente la viabilidad celular de los enteroides.Sin embargo, se observaron reducciones significativas en la viabilidad en lipopolisacáridos o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia en comparación con hipoxia sola. Mientras se establece el modelo apical en un plato. Recuerde mantener el EDTA en la suspensión celular helada.Esto mejorará la inversión de la polaridad y asegurará que toda la ECM se licúe y elimine correctamente. Otras aplicaciones posteriores como QPCR, RNA-seq, western blot o evaluaciones funcionales de la permeabilidad de la barrera se pueden realizar más para caracterizar la respuesta a la señalización inflamatoria en hipoxia.

Research

JoVE Journal

Medicine

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