Name: in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. HC, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden P20GM134973 hibesi ile desteklenmektedir. KB, Çocuk Hastanesi Vakfı (CHF) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) hibesi ile desteklenmektedir. OUHSC'deki Moleküler Biyoloji ve Sitometri Araştırmaları Laboratuvarı'na, konfokal görüntüleme sağlayan Çekirdek Tesis'in kullanımı için teşekkür ederiz.

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben preterm insan olmayan primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) ince bağırsak kolaylık örnekleri elde edildi (Protokol # 101523-16-039-I).
1. Apikal-out enteroid NEC-in-a-dish modelinin kurulması
<ol><li>Medya ve enteroid tedavil...

İntestinal epitel kriptlerinden türetilen enteroid modellerin son zamanlarda geliştirilmesi, nekrotizan enterokolit patogenezinin inceleneceği fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro dokuya izin vermektedir. Bağırsak epitelinin tüm majör farklılaşmış hücre tiplerini içermesine rağmen, 3D enteroidler hala birkaç önemli sınırlamaya tabidir. Konvansiyonel, bazolateral çıkışlı enteroidler, bileşimi ve yoğunluğu doku kültürü ortamında normal difüzyonu sınırlayabilen 3D ECM hidroje...

Preterm bebeklerin %10'una varan oranda ince bağırsağın ciddi inflamatuar bir hastalığı olan nekrotizan enterokolit (NEK), genellikle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir 1,2. Cerrahi müdahale gerektiren çok düşük doğum ağırlıklı (<1500 g) bebeklerde %50'ye yaklaşan mortalite oranları nadir değildir3. NEC'nin kesin etiyolojisi şu anda anlaşılamamış olsa da, formül besleme gibi risk faktörlerinin, hastalığın gelişiminde dysbiosis, olgunlaşmamış bir bağırsak epiteli ve işlevsiz bir bağırsak bariyeri gibi fizyolojik anomalilerle birleştiği düşünülmektedir 2,4. Önemli çabalara rağmen, son on yılda NEC'nin önlenmesi veya tedavisinde çok az ilerleme kaydedilmiştir5. NEC ve ilişkili intestinal epitel bariyer disfonksiyonunu incelemek için yeni bir in vitro yöntem, hastalığın patogenezinin anlaşılmasını ilerletmek için gereklidir, çünkü hayvan modellerinden elde edilen bulgular şimdiye kadar yatak başına kötü bir şekilde çevrilmiştir6.
NEC sırasında oyundaki mekanizmaları araştırmak için bir dizi in vitro model kullanılmıştır. İnsan bağırsak epitel hücre hattı Caco-2, NEC 7,8'in in vitro modellerinde en yaygın kullanılanlar arasındadır. Kako-2 hücreleri, ince bağırsağın fırça sınırındaki morfolojik özelliklerini taklit eder, ancak bir hücre hattı olarak, yüksek oranda çevrilebilir bir model için gerekli olan mukus üreten kadeh hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli in vivo hücre tiplerine farklılaşmaz. HT-29-MTX, insan kolon adenokarsinom hücreleri, karışık bir enterosit ve kadeh hücresi fenotipi içerir, ancak yine de bağırsak epiteli9'un kript bazlı hücre tiplerinden yoksundur. IEC-6 ve IEC-18, olgunlaşmamış ileal kript benzeri bir morfolojiye sahip transforme edilmemiş hücre çizgileridir, ancak insan dokusundan türetilmezler ve translasyonel kapasitelerini sınırlarlar. FH'lar 74-Int ve H4 bağırsak hücre hatları insan fetal dokusundan türetilir ve sıkı kavşaklar veya polarize tek katmanlı10,11 oluşturmaz ve bu nedenle NEC'ye duyarlı en prematüre bebeklerle karşılaştırıldığında bile olgunlaşmamıştır. Tipik olarak, NEC in vitro modeller, NEC12'de bağırsak iltihabını başlatan majör bir reseptör olan toll-like reseptör 4'ü (TLR4) indüklemek için lipopolisakkarit (LPS) tedavilerini kullanır. Reaktif oksijen türleri (ROS) tedavisi yoluyla, tipik olarak hidrojen peroksit yoluyla aracılık edilen hasar, genellikle NEC benzeri oksidatif hasarı ve apoptozu indüklemek için kullanılır13,14. İntestinal inflamasyonun ana itici gücü olarak, inflamatuar TLR4 sinyallemesinin bir aşağı akış bileşeni olan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), in vivo patogenezi taklit etmek için bu in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır15.
İndüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilen organoidler, kompleks in vivo mimarisini ve türetildikleri dokunun hücre tipi kompozisyonunu özetleme yetenekleri nedeniyle bağırsağın in vitro bir modeli olarak popülerlik kazanmıştır16,17. İlgili bir in vitro sistem olan enteroidler, iPSC türevi organoidlerden daha kolay kurulan ve bakımı yapılan rezeke edilmiş bağırsak kriptlerinden türetilen organoidlerdir. Enteroidler tipik olarak bazolateral hücre yüzeyi ile sınırlı deneysel erişime sahip üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste (ECM) yetiştirilir. Apikal yüzeye olan bu engelin üstesinden gelmek için mikroenjeksiyon18,19 gibi yöntemler geliştirilmiştir, ancak lümen içinde dökülmüş hücresel enkaz ve mukus birikmesi, mikroenjeksiyonu hem teknik olarak zor hem de tutarsız hale getirmektedir. Özel robotik mikroenjeksiyon platformlarına yaygın olarak erişilemediğinden20, teknik yetenek ve genel teknikteki laboratuvardan laboratuvara değişkenlik, mikroenjeksiyon protokolleri ile üstesinden gelinmesi gereken önemli değişkenler haline gelmektedir. Ayrışmış 3D enteroidlerden türetilen ve hala bağırsak epitelinin tüm ana hücre tiplerini içeren iki boyutlu (2D) monokatmanlar, apikal yüzeye erişime izin verir, ancak geleneksel olarak mezenkimal miyofibroblastların besleyici tabakası olmadan sürdürülmesi zor olmuştur21. Hücre kültürü geçirgen destekleri, altta yatan miyofibroblastlar kullanılmadan enteroid monokatmanların hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişmek için kullanılabilirken, bu ekler konfokal mikroskopi gibi modalitelerle kullanılmadan önce eksizyon ve membranın monte edilmesini gerektirir, bu da geleneksel mikroskopi yöntemlerini kullanırken daha teknik olarak zorlu ve zor bir işlemle sonuçlanır22. NEC, geleneksel 3D enteroidler 23,24,25 ve geçirgen destekler 26,27 kullanılarak in vitro olarak modellenmiştir ve bağırsak iltihabı son zamanlarda çip üzerinde bağırsak modelleri28,29 ile çoğaltılmıştır. Mikroakışkanları içeren çip üzerinde bağırsak modelleri, şimdiye kadar, en gelişmiş ve çevrilebilir modeller olsa da, bu teknoloji pahalı, karmaşık ve çoğu araştırmacı için erişilemez30.
Apikal-out enteroid tekniklerindeki son gelişmeler, in vitro epitel31,32,33'ün yapısal bütünlüğüne zarar verme riski olmadan 3D enteroidlerin apikal yüzeyine daha kolay erişim sağlamıştır. Apikal-out enteroidler, in vivo bağırsak epitelinin hücre tipi kompozisyonunu ve bariyer fonksiyonunu paylaşır, ancak tipik 3D enteroidlerin aksine, bu hücrelerin apikal yüzeyleri kültür ortamına bakar ve besin emilimi, mikrobiyal enfeksiyon ve luminal sekresyon hakkında fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara izin verir31. Apikal-dışarı enteroidlerin ek bir avantajı, deneysel ajanları enteroidlere homojen olarak dağıtma yeteneğidir. Mikroenjeksiyonda olduğu gibi enteroid boyutuna göre değişen tedavi hacimleri gerekli değildir ve bu enteroidleri süspansiyon kültüründe tutma yeteneği, deneysel ajan difüzyonu32 üzerindeki herhangi bir ECM girişimini ortadan kaldırır.
Nekrotizan enterokolit, çoklu intestinal epitel hücre tiplerini ve çeşitli çevresel ve patofizyolojik faktörleri içeren multifaktöriyel bir hastalıktır34. Bağırsak enteroidlerinin çeşitli hücre bileşimi, NEC gibi karmaşık bir hastalığın modellenmesinde monokültürlere göre açık bir gelişmedir. İlginç bir şekilde, in vitro monokültürlerde hasarı indüklemek için tek bir enflamatuar maruziyet genellikle yeterli olsa da, enteroidler, fare modelleri23'te olduğu gibi, NEC benzeri hasarı indüklemek için en az iki enflamatuar bileşen gerektirmektedir6. Burada, hipoksi (NEC6'nın önemli bir klinik özelliği) ve LPS veya TNF-α ile kombinasyon halinde apikal-out enteroidleri kullanarak, NEC benzeri inflamasyona epitel yanıtlarını incelemek ve potansiyel olarak terapötik hedefleri tanımlamak için geliştirilmiş ve fizyolojik olarak daha alakalı bir in vitro model olarak apikal-out NEC-in-a-dish modelini sunuyoruz. İnce bağırsak 3D enteroidlerinin polaritesini tersine çevirmek için bir protokolün yanı sıra epitel bariyeri bozulmasını ve bileşke protein ekspresyon değişikliklerini tanımlamak için bir immünofloresan boyama protokolü tanımladık. Son olarak, çift vuruşlu, apikal çıkışlı NEC-in-a-dish modelimizin etkisini belirlemek için basit bir enteroid canlılık testi daha da gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>102460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AP182C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Ham&#39;s Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody (7H12)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-19051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1004960700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L3012-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>566460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab130751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945; protein 100 &#181;g</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>210-TA-100/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide (642/661)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro apical-out enteroid model of necrotizing enterocolitis

Nekrotizan enterokolit (NEC), preterm bebekleri etkileyen, intestinal inflamasyon ve nekroz ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Enteroidler son zamanlarda gastrointestinal patolojileri modellemek için umut verici bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, enteroid manipülasyon için şu anda kullanılan yöntemler ya epitelin apikal yüzeyine (üç boyutlu [3D]) erişimden yoksundur ya da zaman alıcı ve kaynak yoğundur (iki boyutlu [2D] tek katmanlılar). Bu yöntemler genellikle modelin fizyolojik olarak çevrilebilir hale gelmesi için mikroenjeksiyon gibi ek adımlar gerektirir. Burada, enteroid polariteyi tersine çevirerek in vitro NEC'yi incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve ucuz bir protokol tarif ediyoruz, bu da apikal yüzeyin dışa bakmasıyla sonuçlanıyor (apikal-dışarı). Norkoksi veya hipoksik koşullar altında tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) veya lipopolisakkarite (LPS) maruziyetini takiben enteroid bariyer bütünlüğünü ve bileşke protein ekspresyonunu incelemek için bir immünofloresan boyama protokolü de sağlanmaktadır. Normoksik veya hipoksik LPS veya TNF-α maruz kalan 3D apikal-out enteroidlerin 24 saat boyunca yaşayabilirliği de değerlendirilmektedir. LPS veya TNF-α maruz kalan enteroidler, hipoksi ile kombinasyon halinde, epitel mimarisinin bozulması, aderans birleşim proteini ekspresyonunun kaybı ve hücre canlılığında bir azalma sergiledi. Bu protokol, NEC tedavileri için potansiyel epitel hedeflerini belirlemek ve terapötiklere erken bağırsak yanıtını incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve uygun maliyetli bir platform sunan yeni bir apikal-out-out-NEC-in-a-dish modelini tanımlamaktadır.

Nekrotizan enterokolit bağlamında bile, bağırsak iltihabını modellemek için enteroidlerin kullanımı artık yaygındır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, enteroidlerin apikal yüzeyine erişimden yoksundur, oral terapötikler olarak nihai kullanım için amaçlanan bileşiklerin fizyolojik alaka düzeyini reddeder veya enteroid türevi tek katmanlarda olduğu gibi teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. NEC'nin akım in vitro enteroid modellerinin faydasını arttırmak için, ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis at JoVE.com

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Bu protokol, ilk apikal-out in-a-dish modelini tanımlar ve oral uygulama için amaçlanan potansiyel terapötiklerin in vitro modellemesini kurarken bazal lateral out enteroid in-a-dish modellerine göre kritik bir gelişmedir. Bu yöntem, enteroidlerin apikal yüzeyine erişim sağlar. Bileşikler hücre ortamına eklenebilir ve bileşikler in vivo oldukları gibi apikal olarak alınır.Potansiyel oral terapötikleri test etmek için in vitro bir bağırsak iltihabı sistemi kurmak isteyen araştırmacılar bu tekniği özellikle yararlı bulabilirler. Farklı yaş ve türlerden elde edilen dokular daha fazla standardizasyon gerektirebilir. Bu nedenle hastalarda polarite kurulurken ters dönme süreleri gerekebilir.3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirmek için, yerleşik 3D bazolateral enteroidlerin 24 kuyucuklu plakasının her bir kuyucuğundan ortamı aspire edin. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre beş milimolar buz soğuk, EDTA veya PBS ekleyin ve bir P 200 pipetle beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek bazal membran ekstraktını veya hücre dışı matris kubbesini yavaşça mekanik olarak bozun. Dört kuyucuğun içeriğini 15 mililitrelik kronik bir tüpe aktarın.Daha sonra tüpe sekiz mililitre buz gibi soğuk EDTA kesme PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın. Tüpleri dönen bir platformda bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin veya 330 RPM'de çalkalayın.Kuluçkadan sonra tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı her tüpten atın. Peletleri beş mililitre DMEM F12 ile birleştirin ve yıkayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlamak için tüpe 12 mililitre antibiyotiksiz ortam eklemeden önce süpernatantı çıkarın.Pippet 500 mikrolitre enteroid süspansiyon, 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna yerleştirilir. Plakayı iki ila beş gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Çekimser kaldığınız ilk günde, 24 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.İstenilen tüm kuyucuklar için ayrı bir tüpte her işlemle tekrarlayın. Tüpleri santrifüj edin ve peleti oda sıcaklığında aldehit fiksatifinden %4'lük 300 mikrolitre içinde yeniden askıya alın. 30 dakika sonra peletleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.Tüplere 500 mikrolitre% 0.1 Triton X 100 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpleri iki ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 200 RPM'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin.Son inkübasyondan sonra, PBS T'ye 500 mikrolitre% 10 NDS ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün, peletin boyutuna bağlı olarak tüplere 250 ila 500 mikrolitre PBS T ekleyin ve bunları iki ila sekiz santigrat derecede bir saat boyunca 200 RPM'de rotatöre veya çalkalayıcıya yerleştirin.İkincil antikor çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve tüpleri karanlıkta iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri döndürerek ve 100 mikrolitre süpernatan çıkararak lekeli apikal enteroidleri monte etmeye devam edin. Kalan 100 mikrolitre süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 500 mikrolitrelik tüplere aktarın.Tüpleri 20 saniye boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 100 mikrolitre oda sıcaklığında çok kırmızı nükleik asit lekesinde yeniden askıya alın. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüj edin ve peletleri 100 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.İkinci yıkama ve santrifüjlemeden sonra 70 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve peletleri kalan PBS hacminde yeniden askıya alın. Ardından hücre süspansiyonunu etiketli 24 x 60 milimetrelik bir kapak kapağına aktarın. 75 mikrolitre montaj aparatını doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın.Karanlıkta gece boyunca kürlendikten sonra, kapak fişlerine ince bir gliserol tabakası uygulayın, ardından kapak kapaklarını cam slaytın üzerine monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kayması ile slayt arasındaki kabarcıkları gidermek için dokunun. Enteroidleri konfokal mikroskopla 20 kat büyütmede görüntülemeden önce kapak kaymasının karanlıkta iki saat oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verin.Enteroid tedaviler için, metin makalesinde açıklandığı gibi 24 saat boyunca bir çanak modelinde apikal bir nekrotizan enterokolit oluşturun. Tahlili yapmadan önce, kalan 400 mikrolitreyi bırakarak her kuyudan 100 mikrolitre ortam çıkarın. Her bir kuyucuğa 400 mikrolitre hücre canlılığı testi reaktifi ekleyin.Hücre lizisini indüklemek için içeriği 200 RPM'de beş dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıda kuvvetlice karıştırın. Daha sonra, 200 mikrolitreyi 96 kuyu berraklığında tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 mikrolitre için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun.Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 milisaniye entegrasyonunda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Kontrolün temsili immünofloresan boyaması, çekirdeklerin lümene doğru apikal dışarı lokalizasyonunu ve epitelin dış kenarında kötü adamın tespitini doğruladı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, lipo polisakkarit, tümör nekroz alfa veya hipoksiye maruz kalmak, tek başına brüt hücre morfolojisi E-kadherin veya kötü adam lokalizasyonunda veya floresan yoğunluğunda açık değişikliklere neden olmamıştır.Hipoksi ile birlikte lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile tedavi, epitel mimarisini bozdu ve ECA işitme kaybı ve kötü adam boyama ile ortaya çıkan aderans kavşağı ve fırça sınır protein ekspresyonunda önemli bir kayıp gösterdi. Apikal çıkış hücresi canlılığı normoksik veya hipoksik koşullar altında belirlendi. Kontrol lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile karşılaştırıldığında normoksik koşullar altında enteroidlerin hücre canlılığını önemli ölçüde etkilemedi.Bununla birlikte, lipo polisakkarit veya tümör nekroz alfasında, hipoksi ile kombinasyon halinde, tek başına hipoksiye kıyasla canlılıkta önemli azalmalar gözlenmiştir. Apikal dışarı çanak içi modeli kurarken. EDTA'yı hücre süspansiyonunda buz gibi soğuk tutmayı unutmayın.Bu, polaritenin tersine çevrilmesini artıracak ve tüm ECM'nin uygun şekilde sıvılaştırılmasını ve çıkarılmasını sağlayacaktır. QPCR, RNA-seq, batı lekelenmesi veya bariyer geçirgenliğinin fonksiyonel değerlendirmeleri gibi diğer aşağı akış uygulamaları, hipokside inflamatuar sinyalleşmeye yanıtı karakterize etmek için daha fazla yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Nekrotizan Enterokolit'in Yenidoğan BALB/c Fare Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...