Name: interlinked macroporous 3d scaffolds from microgel rods
Uploaded: 2022-06-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods at JoVE.com

אנו מביעים את תודתנו למחברים השותפים של עבודתנו הקודמת שמתודולוגיה זו מבוססת עליהם, סלין ממזר, לואיס פ. ב. גרזוני, יונקה קיטל, רוסטיסלב וינוקור, ניקולאי בורן ותמאס הרסטי. אנו מודים על מימון מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) במסגרת הפרויקט B5 ו- C3 SFB 985 "מיקרוג'לים פונקציונליים ומערכות מיקרוג'ל". אנו מכירים במימון מוועדת התחרות של הסנאט של לייבניץ (SAW) במסגרת תוכנית Professorinnenprogram (SAW-2017-PB62: BioMat). אנו מכירים בכנות במימון מהנציבות האירופית (EUSMI, 731019). עבודה זו בוצעה בחלקה במרכז לטכנולוגיית פולימרים כימיים (CPT), אשר נתמך על ידי האיחוד האירופי והמדינה הפדרלית של נורדריין-וסטפאליה (מענק EFRE 30 00 883 02).

1. חומר נדרש והכנות למיקרופלואידיקה
<ol><li>עבור ההליך microfluidic המתואר, להשתמש 1 מ"ל ו 5 מ"ל מזרקי זכוכית משאבות מזרק. היווצרות טיפות על השבב נצפתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה במהירות גבוהה.</li>
	<li>צור את תכנון השבב המיקרופלואידי (איור 1B) באמצעות תוכנת תכנון בעזר?...

<ol>
	<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications.">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks.">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li><li>Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+PEG+microgels+into+porous+cell-instructive+3D+scaffolds+via+thiol-ene+click+chemistry.">Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).</li><li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness,+void+space+size,+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation,+cell+spreading,+and+gene+transfer.">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).</li><li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads.">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li><li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds.">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).</li><li>Hsu, R. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptable+microporous+hydrogels+of+propagating+NGF-gradient+by+injectable+building+blocks+for+accelerated+axonal+outgrowth.">Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation.">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microfluidic+devices+for+fabricating+multi-structural+hydrogel+microsphere.">Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere.</a> Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).</li><li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion.">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).</li><li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture.">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).</li><li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation+in+soft,+anisometric+poly(ethylene)+glycol+microgels+using+a+novel+radical-free+microfluidic+system.">Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system.</a> Small. 15 (20), 1900692 (2019).</li><li>Kr&#252;ger, A. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+jet+polymerization+as+a+high-resolution+process+to+continuously+produce+anisometric+microgel+rods+with+adjustable+size+and+stiffness.">Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness.</a> Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).</li><li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+by+click+microporous+annealed+particle+(MAP)+scaffolds.">Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).</li><li>Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+overview+of+porous,+bioactive+scaffolds+as+instructive+biomaterials+for+tissue+regeneration+and+their+clinical+translation.">The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).</li><li>Dang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+dual+macro-,+microscale+porous+network+as+a+tissue+engineering+scaffold+with+drug+delivering+function.">3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function.</a> Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).</li><li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications.">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).</li></ol>

אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא האיכות של 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) המשמש כקומונומר לתפקוד אמין ראשוני. ה-AMA צריכה להיות אבקה עדינה ועדיף חסרת צבע המועברת במיכל זכוכית חום אטום לגז. יש להימנע משימוש בחומר ירקרק וגבשושי, שכן הוא פוגע באופן משמעותי בתגובת הג'לציה ומשפיע לרעה על יכולת השחזו...

כדי לחקור התנהגות מורכבת של תאים שיתופיים במבנים תלת-ממדיים, פלטפורמות פיגומים צריכות להראות ביצועים עקביים ביכולת השחזור, להיות בעלות גיאומטריה מתאימה לנדידת תאים, ובמקביל לאפשר גמישות מסוימת במונחים של שינוי פרמטרים כדי לחקור את השפעתם על הרקמה החיה1. בשנים האחרונות, הרעיון של חלקיקים מקרו-נקבוביים (MAP), שתואר לראשונה על ידי Segura et al., התפתח לפלטפורמה יעילה ורב-תכליתית לייצור פיגומים תלת-ממדיים2. ההרכב המותאם של המיקרו-ג'לים, שהם אבני הבניין של הפיגום התלת-ממדי הסופי, מגדיר מראש תכונות כגון קשיחות המבנה, התגובתיות הכימית הסלקטיבית של רשת הג'ל וגודל הנקבוביות הסופי של הפיגום 2,3,4,5,6. פפטידים דביקים של תאים כרמזים לאינטראקציות פיגומים-תאים משולבים ברשת הפולימרים של המיקרו-ג'לים כדי לאפשר חיבור של תאים, וניתן לגוון אותם כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות שלהם על תאים בתרבית. הפיגומים התלת-ממדיים מיוצבים על ידי קישור של המיקרו-ג'לים הניתנים להזרקה בחישול עקב קשרים קוולנטיים או סופראמולקולריים, וכתוצאה מכך מבנים חזקים ומוגדרים עבור תרבית תאים 2,3,5,7,8.
Microfluidics ביססה את עצמה כאחת השיטות המדויקות והניתנות להתאמה להכנת הידרוג'לים גרעיניים מוגדרים9. האפשרות לייצר כמויות גדולות יותר של אבני הבניין הנדרשות בתהליך מתמשך תוך שמירה על חד-פעמיותן הכימית, המכנית והפיזיקלית, תורמת רבות להתאמתו של תהליך זה. יתר על כן, ניתן לתפעל את הגודל והצורה של המיקרו-ג'לים המיוצרים בשיטות שונות כגון תחליבי אצווה, מיקרופלואידיקה, ליתוגרפיה, ריסוס אלקטרודינמי או פיצול מכני, הקובעים את הגיאומטריה של אבני הבניין, ולפיכך, את המבנה התלת-ממדי של הפיגום הסופי 1,10.
לאחרונהדווח על הרעיון של פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים המורכבים ממוטות מיקרוג'ל פונקציונליים המתחברים במהירות בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. האניזוטרופיה של מוטות מיקרוג'ל הביאה לנקבוביות גבוהות יותר ולהתפלגות נקבוביות עם גודל נקבוביות גדול יותר בהשוואה לשימוש במיקרו-ג'לים כדוריים במחקר זה11. באופן זה, פחות חומר יוצר נקבוביות גדולות יותר עם מגוון גיאומטריות נקבוביות שונות תוך שמירה על יציבות הפיגום התלת-ממדי. המערכת מורכבת משני סוגים של מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות פונקציונליות משלימות של אמין ראשוני ואפוקסי הנצרכים בתוך התגובה ההדדית כאשר באים במגע זה עם זה. הקבוצות הפונקציונליות שאינן משתתפות בתהליך הקישור נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן לבחירה לאחר שינוי עם פפטידים דביקים של תאים או גורמים ביו-אקטיביים אחרים. תאי פיברובלסטים מתחברים, מתפשטים ומתרבים כאשר הם מתרבים בתוך הפיגומים התלת-ממדיים, גדלים לראשונה על פני המיקרוג'ל וממלאים את רוב המקרופורים לאחר 5 ימים. מחקר ראשוני בתרבית משותפת של פיברובלסטים אנושיים ותאי אנדותל של ורידים בטבור אנושי (HUVECs) הראה תוצאות מבטיחות להיווצרות מבנים דמויי כלי דם בתוך הפיגומים התלת-ממדייםהמקושרים 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABIL EM 90</td>
			<td>Evonik</td>
			<td>144243-53-8</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>A3413</td>
			<td>&#62;98.0%(T)(HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Arm PEG-acrylate 20 kDa</td>
			<td>Biochempeg Scientific Inc.</td>
			<td>A88009-20K</td>
			<td>&#8805; 95 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2019</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter</td>
			<td><s>CHROMAFIL</s>Carl Roth GmbH+Co.KG</td>
			<td>XH49.1</td>
			<td>pore size 0.20 &#181;m; Cellulose Mixed Esters (MV)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td></td>
			<td>type No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td></td>
			<td>0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolut</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera</td>
			<td>FLIR Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresceinamine isomer I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G x 5/8&#8217;&#8217; 0,50 x 16 mm needles</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycidyl methacrylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>779342</td>
			<td>&#8805;97.0% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRGDS-PC</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td>FIBN-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 1000 Series Gastight syringes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10772361/10500052</td>
			<td>PFTE Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1,04,367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900889</td>
			<td>&#8805;95 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic AE2000 trinocular microscope</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>22443-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SHH0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24679320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pavone Nanoindenter Platform</td>
			<td>Optics11Life</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing 0.38&#215;1.09mm medical grade</td>
			<td>dropletex</td>
			<td></td>
			<td>ID 0.38 mm OD 1.09 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow SYLGARD</td>
			<td>634165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC LED sterilizing box</td>
			<td>UVLED Optical Technology Co., Ltd.</td>
			<td>9S SZH8-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interlinked macroporous 3d scaffolds from microgel rods

מערכת דו-רכיבית של מיקרוג'לים פונקציונליים ממיקרופלואידיקה מאפשרת קישור מהיר למבנים מקרו-נקבוביים תלת-ממדיים בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. ג'לציה רציפה על השבב מאפשרת וריאציה של יחס הגובה-רוחב של המיקרוג'ל, הקובע את תכונות אבני הבניין עבור המבנים המתקבלים. מונומרים של גליצידיל מתקרילט (GMA) או 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) עוברים קופולימריזציה לרשת המיקרו-ג'ל על בסיס פולימרים של פוליאתילן גליקול (PEG) כדי להשיג פונקציונליות של אפוקסי או אמין. זרימת שמן ממוקדת מוחדרת למבנה השקע המיקרופלואידי כדי להבטיח איסוף רציף של מוטות המיקרוג'ל הפונקציונליים. בהתבסס על פרסום שפורסם לאחרונה, מבנים מבוססי מוטות מיקרוג'ל גורמים לנקבוביות גדולות יותר של כמה מאות מיקרומטרים, ובמקביל מובילים ליציבות פיגומים גבוהה יותר באופן כללי בהשוואה למודל מבוסס כדוריות. בדרך זו, ניתן לייצר מבנים בנפח גבוה יותר עם נפח חופשי יותר תוך הפחתת כמות החומר הנדרשת. הפיגומים המקרו-נקבוביים המחוברים זה לזה ניתנים לאיסוף ולהובלה ללא נזק או התפוררות. קבוצות אמין ואפוקסי שאינן מעורבות בקישור הדדי נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן באופן עצמאי לאחר השינוי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לייצור מוטות מיקרוג'ל ליצירת פיגומים מקרו-נקבוביים מקושרים שיכולים לשמש לניסויים הבאים בתאים.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64010/64010fig02.jpg"> איור 2: מבנה פיגומים מקרו-נקבוביים מוצלבים . (A) הקרנה תלת-ממדית של ערימת Z של מיקרוסקופיה קונפוקלית בגודל 500 מיקרומטר של הפיגום המקרו-נקבובי המקושר. סרגל האבנית מייצג 500 מיקרומטר. (B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods at JoVE.com

Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods

מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.

פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל

A two-component system of functionalized microgels from microfluidics allows for fast interlinking into 3D macroporous constructs in aqueous solutions ...

פרוטוקול זה מתאר ייצור של מוטות מיקרו-ג'ל המתחברים לפיגומי מיקרו-נקבוביות. ניתן להשתמש בפיגומים אלה בשילוב עם תאים המספקים את המרחב הדרוש לאינטראקציה יעילה עם התא. שני הסוגים השונים של מוטות מיקרו ג'ל מתחברים זה לזה במגע.יחס גובה-רוחב גבוה מוביל לנקבוביות גדולות יותר תוך שמירה על יציבות הפיגום תוך שימוש בפחות חומר סינתטי בהשוואה למיקרו-ג'לים כדוריים. פיגומי מיקרו-נקבוביות ישפרו באופן משמעותי את החדירה והאינטראקציה של תאים אנדוגניים לתיקון רקמות פגומות. הנקבוביות הגדולות יקלו על היווצרות כלי הדם כדי להחליף חומרים מזינים לרקמה הגדלה.הפחתת החומר הפיגום מועילה ככל שיותר שטחים פתוחים מסופקים ליצירת רקמות, דבר החשוב הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo. היבט קריטי הוא המיקרופיטי על טכניקת השיפוע. כדי להבטיח ייצור רציף של מוטות מיקרו ג'ל, יש להעביר את המוצר ביעילות אל מחוץ לצינור ללא סתימה.כדי להתחיל, להכניס את המחטים לתוך צינורות פוליאתילן ולהסיר את הגז מן המזרק ואת הצינור. לאחר מכן הכנס צינור פוליאתילן נוסף לתוך השקע לאיסוף המוצר. לאחר מכן, מניחים את כל מזרקי הזכוכית ואת משאבות המזרק ומכניסים כל קצה צינור לכניסה המתאימה.לאחר מכן, מקד את המיקרוסקופ בחתך מי השמן. הפעל את משאבת מזרק השמן הראשונה כדי למלא את הערוץ בשמן תחילה, כדי למנוע הרטבת ערוץ על ידי השלב המפוזר. לאחר מכן, להקטין את קצב זרימת השמן הראשון ל 30 microliters לשעה ולהתחיל את משאבת מזרק טרום פולימר עד שלב מימי מפוזר ניתן לראות בחתך רוחב.לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הטרום פולימרית ל -30 מיקרוליטר לשעה ומקד את המיקרוסקופ בשקע. לאחר מכן, הפעל את משאבת מזרק השמן השנייה והמתן עד שמשטר הזרימה יהיה יציב. מניחים את צינור היציאה במיכל איסוף ומגדירים את מערכת קרינת ה- UV כך שההקרנה תהיה בטווח של 900 עד 1000 מילי וואט לסנטימטר בריבוע.ונקודת ההקרנה היא חלק הערוץ הישר לפני השקע. לפני הקרנת UV, התאם את קצבי הזרימה של הקדם-פולימר והשמן הראשון כדי להשיג את יחס הגובה-רוחב הרצוי בטווח של 3.0 עד 4.5, והגדר את זמן ההקרנה של הפאזה המפוזרת לכ-2.3 שניות, בהתאם לגודל נקודת ההקרנה. לאחר מכן התחל קרינת UV, ובמידת הצורך, התאם את קצבי הזרימה שוב בהתאם לסעיף הקודם.לאחר מכן, שנה את מיכל האיסוף וציין את זמן ההתחלה וקצב הזרימה של איסוף המוצרים. כדי לסיים את האיסוף, הסר את הגורם המכיל של האוסף המציין את השעה. לאחר מכן, להפסיק את ההקרנה ואת כל משאבות המזרק.לאחר מכן יש לשטוף את המוצר חמש פעמים כל אחת עם n-הקסאן, איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן הסר את supernatant לאחר שקיעת מוט. מעבירים את פיזור הרכיב הראשון לבקבוקון שקוף חרוטי של 1.5 או שני מיליליטר.לאחר מכן מוסיפים את הרכיב השני באופן מבוקר בפעולה רציפה עם פיפטה של 100 מיקרוליטר ומערבבים את התוכן ישירות באמצעות הפיפטה כדי לקחת נוזל ולהוסיף אותו שוב. לאחר מכן הוסיפו תמיסת G R G D S P C למבנה המקושר כדי לשנות את כל קבוצות האפוקסי הנותרות כאשר פפטיד דבק התא נושא אמין ותיאלי חופשיים ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את המולקולות שלא הגיבו על ידי שטיפה במים שעברו דה-יוניזציה והסר את הסופרנטנט.לאחר הפחתת מפלס המים, פתח את הבקבוקון ומחק עם אור UV באורך גל, 250 עד 300 ננומטר. לאחר מכן סגור את הבקבוקון והעבר את הבקבוקון לספסל נקי. לאחר מכן, יש לשטוף במים סטריליים.החליפו את המים בבקבוקון במדיה של תרבית תאים ואפשרו שיווי משקל למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הפיגום המאקרו-נקבובי לצלחת באר של תרבית תאים לצורך הניסוי על ידי מזיגה או שימוש במרית. מיקרוסקופיה קונפוקלית גילתה כי המבנה המאקרו נקבובי התלת-ממדי היה מורכב ממוטות מיקרו-ג'ל פונקציונליים של אמין ואפוקסי.המבנה מציג גיאומטריה קומפקטית של כ -10, 000 מוטות מיקרו ג'ל שנוצרו תוך שתיים או שלוש שניות. המודולוס של מוטות מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי מבית Effective Young יחד עם כדורי מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי נמדד על ידי כניסת ננו. כדי לזהות קבוצות פונקציונליות פעילות, ניתן להשתמש בפלואורסצין ISO thiocyanate כדי להמחיש קבוצות אמינו ראשוניות ואיזומר אמין פלואורסצין ניתן להשתמש כדי לסמן קבוצות אפוקסי.למוטות מיקרו ג'ל אמין יש ממדים עם אורך ממוצע של 553 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 193 מיקרומטר במים שעברו דה-יוניזציה, וכתוצאה מכך יחס גובה-רוחב של כ-3.0. הערכים הממוצעים של נקבוביות המאקרו והפיגומים המורכבים ממוטות מיקרו ג'ל הם 100 מיקרומטר, כאשר 90% מגודל הנקבוביות נע בין 30 מיקרומטר ליותר מ-150 מיקרומטר. הכדור, כמו מיקרו-ג'לים, יוצר אשכולות עם גודל נקבוביות בין 10 ל-55 מיקרומטר, עם ערך ממוצע של כ-22 מיקרומטר.מוטות המיקרו-ג'ל המתוארים נועדו לייצר פיגומי מיקרו-נקבוביות המקושרים זה לזה על ידי ערבוב אקראי. הליך ערבוב מבוקר עשוי לאפשר ייצור של גיאומטריות פיגומים מותאמות יותר בעתיד. ניתן לגוון את הנוקשות של המיקרו-ג'לים ואת הרמזים הביוכימיים בהתאם לדרישות המכירה.על ידי שילוב אבני בניין שונות ניתן להשיג מגוון רחב של גיאומטריות ותכונות בתוך פיגום אחד. בדרך זו אנו יכולים להתמקד בתאים ספציפיים ביעילות כדי ליצור רקמות רב-תאיות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

3D מודפס נקבובי תאית Nanocomposite הידרוג פיגומים

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

ייצור ושימוש בפיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים להתמרה נגיפית של תאי T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...