Name: coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

بدعم من NIH R01 DC 17924 و R01 DC 18401 (Klug) و NIH 1R15HD105231-01 و T32DC012280 و FRAXA (McCullagh). تم إجراء تصوير CARS في الجزء الأساسي من المجهر الضوئي المتقدم من مركز NeuroTechnology في الحرم الجامعي الطبي بجامعة كولورادو Anschutz المدعوم جزئيا من NIH P30 NS048154 و NIH P30 DK116073.

امتثلت جميع التجارب لجميع القوانين المعمول بها ، والمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة جامعة كولورادو أنشوتز المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. الحيوانات
<ol><li>استخدم C57BL/6J (المخزون رقم 000664) الفئران (Mus musculus ) التي تم ا...

<ol>
	<li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity.">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li><li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow.">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li><li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+computations.">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).</li><li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept.">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li><li>Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+and+design+principles+of+axons.">Integrative properties and design principles of axons.</a> International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).</li><li>Fitzhugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computation+of+impulse+initiation+and+saltatory+conduction+in+a+myelinated+nerve+fiber.">Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber.</a> Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).</li><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acquisition+of+myelin:+a+success+story.">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).</li><li>Salzer, J. L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination.">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li><li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+myelin.">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li><li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+in+development,+myelin+generation+and+beyond.">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424 (2019).</li><li>Saab, A. S., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+dynamics:+protecting+and+shaping+neuronal+functions.">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li><li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS?+A+theoretical+approach.">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).</li><li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing.">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073 (2015).</li><li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem.">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li><li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+NG2++glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer.">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li><li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li><li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+(ReBUILD):+a+randomised,+controlled,+double-blind,+crossover+trial.">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).</li><li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders.">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li><li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+deletion+of+Gtf2i,+associated+with+Williams+syndrome,+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug.">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li><li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder.">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li><li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues.">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li><li>Kim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains.">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li><li>. Fluorescence SpectraViewer Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022)</li><li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+centrale+geh&#246;rleitung.">Die centrale geh&#246;rleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis.">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825 (2019).</li><li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration.">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).</li><li>K&#250;tna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model.">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li><li>Ozsv&#225;r, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas.">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li><li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown.">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li><li>B&#233;gin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue.">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li></ol>

تؤكد مجموعة متزايدة من الأدبيات على دور المايلين في وظائف الدماغ13،16،21،28. علاوة على ذلك ، نحن نعلم أن سمك الميالين ونمط الميالين يمكن أن يتغير في العديد من الحالات العصبية مثل التصلب المتعدد (تمت مراجعته في29</su...

إمكانات العمل هي الوحدة الأساسية للمعلومات في الدماغ ، ويشكل الانتشار المحتمل للعمل من خلال المحاور العصبية أحد أعمدة معالجة المعلومات1،2،3. تتلقى الخلايا العصبية عادة مدخلات قريبة من خلايا عصبية أخرى متعددة وتدمج هذه المدخلات ضمن نافذة زمنية ضيقة معينة 4,5. لذلك ، تلقت آليات الانتشار المحتمل للعمل في المحاور العصبية قدرا كبيرا من الاهتمام من المحققين.
عند الانتشار من خلال محور عصبي ، يتم تجديد إمكانات العمل بشكل متكرر على طول المحور العصبي لضمان انتشار موثوق به6. في معظم الخلايا العصبية للفقاريات ذات الفكين (gnathostomes) ، تحيط المحاور العصبية بغمد من المايلين ، وهي مادة غنية بالدهون تنتجها الخلايا قليلة التغصن القريبة أو خلايا شوان ، وهي أنواع من الخلايا الدبقية (تمت مراجعتها في 7,8). يعزل غمد المايلين هذا المحور العصبي كهربائيا ، مما يقلل من سعته ويسمح بالانتشار المحتمل للعمل بكفاءة وسرعة واستهلاك أقل للطاقة. لا يغطي المايلين المحور العصبي بشكل موحد ، ولكنه يغمد المحور العصبي في أجزاء تحتوي على فجوات قصيرة بينهما ، تسمى عقد رانفييه (تمت مراجعتها في 9,10). يؤثر كل من سمك الميالين ، الذي يتحكم في مستوى العزل الكهربائي للمحور العصبي ، وتباعد عقد رانفييه ، التي تتحكم في التردد الذي يتم به تجديد إمكانات الفعل على طول محور عصبي ، على سرعة انتشار إمكانات العمل (تمت مراجعته في11).
هناك مجموعة كبيرة من الأدبيات التي تشير إلى أن سمك الميالين يؤثر على سرعة الانتشار المحتمل للعمل في المحاورالعصبية 12،13،14. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي التغييرات في الميالين المحوري إلى عدد من عجز CNS 15,16,17,18,19,20,21. لذلك ليس من المستغرب أن تركيز العديد من الجهود البحثية ينطوي على قياس وتوصيف الميالين المحوري. تم إجراء قياسات سمك المايلين بشكل شائع باستخدام المجهر الإلكتروني ، وهي تقنية تتطلب قدرا كبيرا من إعداد الأنسجة ويصعب استخدامها مع الكيمياء النسيجية المناعية. ومع ذلك ، هناك أيضا تقنية أسرع وأبسط لقياس الميالين المحوري الذي يعتمد على التحليل الطيفي المضاد لستوكس (CARS). يمكن ضبط ليزر CARS على ترددات مختلفة وعند ضبطه على ترددات مناسبة لإثارة الدهون ، يمكن تصوير المايلين دون الحاجة إلى أي ملصقات إضافية22. يمكن دمج تصوير الدهون مع الكيمياء النسيجية المناعية القياسية بحيث يمكن تصوير الدهون مع العديد من قنوات الفلورسنت23. التصوير الميالين باستخدام CARS أسرع بكثير من المجهر الإلكتروني وله دقة ، وإن كانت أقل من EM ، كافية للكشف عن الاختلافات الصغيرة في الميالين في نفس النوع من المحاور العصبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5&#34;</td>
			<td>Exel int</td>
			<td>260040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal +</td>
			<td>Vortech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - 8mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF994 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 23 GA x 1&#34;</td>
			<td>BD precision glide</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump with variable flow or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumphosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL vial with 4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>230331000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass or plastic tray, approximately 10&#34; x 10&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, plant</td>
			<td>RPI</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>well plate</td>
			<td>Alkali Sci.</td>
			<td>TPN1048-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1n 1,000 mL of Millipore H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered (PB):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosohate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>A2153-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>x100-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nissl 435/455</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE&#160;picoemerald laser</td>
			<td>Angewandte Physik &#38; Elektronik&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (420-520 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ470/100m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (500-530 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ515/30m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filters (640-680 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ660/40m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Transfer pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 565 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>565dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 585 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>585dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic shortpass 750 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T750spxrxt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)</td>
			<td>Allen Scientific Glass Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton shortpass emission filter 680 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET680sp-2p8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices

التحليل الطيفي المتماسك المضاد لستوكس رامان (CARS) هو تقنية يستخدمها الكيميائيون والفيزيائيون بشكل كلاسيكي لإنتاج إشارة متماسكة من الاهتزازات المميزة للجزيئات. ومع ذلك ، فإن هذه التوقيعات الاهتزازية هي أيضا سمة مميزة للجزيئات داخل الأنسجة التشريحية مثل الدماغ ، مما يجعلها مفيدة بشكل متزايد وقابلة للتطبيق على تطبيقات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن ل CARS قياس الدهون عن طريق الروابط الكيميائية المثيرة على وجه التحديد داخل هذه الجزيئات ، مما يسمح بتحديد الجوانب المختلفة للأنسجة ، مثل المايلين المشارك في النقل العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع التقنيات الأخرى المستخدمة عادة لتحديد كمية المايلين ، يمكن أيضا إعداد CARS لتكون متوافقة مع تقنيات الفلورسنت المناعي ، مما يسمح بوضع العلامات المشتركة مع علامات أخرى مثل قنوات الصوديوم أو المكونات الأخرى للانتقال المشبكي. تغيرات الميالين هي آلية مهمة بطبيعتها في إزالة الميالين من الأمراض مثل التصلب المتعدد أو الحالات العصبية الأخرى مثل متلازمة X الهشة أو اضطرابات طيف التوحد هي مجال ناشئ من مجالات البحث. في الختام ، يمكن استخدام CARS بطرق مبتكرة للإجابة على الأسئلة الملحة في علم الأعصاب وتقديم أدلة على الآليات الأساسية المتعلقة بالعديد من الحالات العصبية المختلفة.

واحدة من أكبر مزايا المجهر CARS على التقنيات الأخرى هي التوافق مع التصوير الفلوري23. ويبين الشكل 1 أطياف CARS مقارنة ب Nissl الموسومة بعلامة الفلورسنت المناعي التي تظهر تداخلا ضئيلا / معدوما في الأطياف. يوضح الشكل 2 الليزر الذي تم إعداده ل CARS بالاقتران ...

Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

يعد تصور الميالين هدفا مهما للعديد من الباحثين الذين يدرسون الجهاز العصبي. CARS هي تقنية متوافقة مع التألق المناعي الذي يمكنه تصوير الدهون داخل الأنسجة مثل الدماغ الذي يضيء الهياكل المتخصصة مثل المايلين.

تطبيق التحليل الطيفي رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS) لتصوير الميالين في شرائح الدماغ

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

يمكن لهذه التقنية تصوير المايلين في أقسام أنسجة المخ. يلعب الميالين دورا مهما في توصيل إمكانات العمل وفهم المايلين سيساعدنا على فهم وظائف الدماغ. الميزة الرئيسية لتقنية CARS على ، على سبيل المثال ، المجهر الإلكتروني هي أن CARS هي تقنية مجهرية خفيفة ، ويمكن دمجها بسهولة مع التصوير الفلوري الآخر ، مثل المستخدمة في الكيمياء النسيجية المناعية.العديد من الحالات الطبية ناتجة عن تغيرات في الميالين ، على سبيل المثال ، التصلب المتعدد والشيخوخة والتوحد. سيساعدنا فهم هذه التعديلات على فهم الحالات الطبية الأساسية. في هذه الحالة ، يتم ضبط ليزر CARS على صورة الدهون أو ، على وجه التحديد ، روابط CH2.في الدماغ ، أكبر مصدر للدهون هو المايلين. وبالتالي ، هذه تقنية لتصوير المايلين في أنسجة المخ. يجب أن يكون من الممكن استخدام نفس الطريقة لأنواع أخرى من الأنسجة عندما يكون تصوير الدهون موضع اهتمام.يتطلب ضبط ومحاذاة ليزر CARS خبرة كبيرة ، ويتم تنفيذه بشكل أفضل من قبل خبير الليزر أو المجهر الضوئي. بعد تحضير الأنسجة كما هو موضح في المخطوطة، قم بقص المقاطع العائمة الخالية من البقع لوسائط النسل والأجسام المضادة لتصور أجسام الخلايا، ثم احتضان الأقسام على شاكر مختبر قياسي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قبل إحضار العينات إلى المجهر ، قم بتشغيل وتسخين ليزر CARS لمدة ساعة واحدة على الأقل ، ثم قم بمحاذاة ليزر CARS عن طريق التداخل المكاني بين المضخة وأشعة الليزر ، وضبط التأخير بين شعاعي الليزر.قم بتلوين بصريات المكثف والحجاب الحاجز للمجهر للتصوير الأمامي CARS ، ثم اضبط المنظار الخارجي لتوسيط اثنين من أشعة الليزر المتداخلة مكانيا على مرايا رأس المسح الضوئي للمجهر. للحصول على أفضل كشف CARS غير منزوع الشكل. تأكد من أن المكثف مغري بالألوان.للتألق المناعي والتصوير البؤري وتصوير السيارات ، قم بملاءمة ليزر CARS مع كل من أجهزة الكشف الأمامية و epi CARS غير الممسكة من خلال دمج مجهر متحد البؤرة مجهز بأشعة ليزر مرئية للتصوير الفلوري. الآن ، ضع الأقسام في طبق ثقافي مع قاع انزلاق الغطاء ، و PBS لتجنب تجفيف الأنسجة. أيضا ، استخدم وزنا زجاجيا للحفاظ على الأنسجة بالقرب من انزلاق الغطاء.باستخدام واجهة المستخدم الرسومية ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصور للسيارات والتصوير البؤري الفلوري للصواريخ. ضع العينة على مرحلة المجهر ، وركز العينة ، والتقط الصور. تتراوح أطياف CARS's من 640 إلى 660 نانومتر ويبدو أنه لا يوجد تداخل في الأطياف مع علامة الفلورسنت المناعي الموسومة بالنسل ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام إشارات CARS مع إشارات الفلورسنت المناعي.تم استخدام Nisel لتصور الأجسام الخلوية لأدمغة الجربيل والفئران المنغولية ، وتم استخدام تصوير CARS's لتصور غمد المايلين ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه التقنية عبر الأنواع. تظهر كلتا المجموعتين من الصور قسما من النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف في جذع الدماغ. دقة CARS أقل من المجهر الإلكتروني وهي في حدود عدة مئات من النانومترات.يمكن تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور القياسي ، مثل ImageJ لتحديد المعلمات ذات الأهمية ، على سبيل المثال ، سمك أو طول المايلين.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

تطبيق أدوية المحلية لدراسة وظيفة مستقبلات أستيل النيكوتينيك في شرائح مخ الفأر

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

طرق تسجيل متعددة الوحدات لوصف النشاط العصبي في الجراد (<em&gt; الجراد الصحراوي أمريكانا</em&gt;) الدوائر الشم

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...