Name: coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices at JoVE.com

Unterstützt von NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) und NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 und FRAXA (McCullagh). Die CARS-Bildgebung wurde im Advanced Light Microscopy Core-Teil des NeuroTechnology Center am Anschutz Medical Campus der University of Colorado durchgeführt, der teilweise von NIH P30 NS048154 und NIH P30 DK116073 unterstützt wurde.

Alle Experimente entsprachen allen geltenden Gesetzen, den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom University of Colorado Anschutz Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Tiere
<ol><li>Verwenden Sie C57BL / 6J (Stock # 000664) Mäuse (Mus musculus), die vom Jackson Laboratory stammen, oder mongolische Rennmäuse (Meriones unguiculatus), die ursprünglich aus Charles River stammen.</li>
</ol><stron...

<ol>
	<li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity.">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li><li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow.">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li><li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+computations.">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).</li><li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept.">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li><li>Waxman, S. 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L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination.">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li><li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+myelin.">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li><li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes+in+development,+myelin+generation+and+beyond.">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424 (2019).</li><li>Saab, A. S., Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+dynamics:+protecting+and+shaping+neuronal+functions.">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li><li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS?+A+theoretical+approach.">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).</li><li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing.">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073 (2015).</li><li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem.">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li><li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+NG2++glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer.">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li><li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li><li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+(ReBUILD):+a+randomised,+controlled,+double-blind,+crossover+trial.">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).</li><li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders.">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li><li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+deletion+of+Gtf2i,+associated+with+Williams+syndrome,+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug.">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li><li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder.">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li><li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues.">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li><li>Kim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids.">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains.">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).</li><li>. Fluorescence SpectraViewer Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022)</li><li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+centrale+geh&#246;rleitung.">Die centrale geh&#246;rleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li><li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis.">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825 (2019).</li><li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration.">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).</li><li>K&#250;tna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model.">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li><li>Ozsv&#225;r, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas.">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li><li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown.">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li><li>B&#233;gin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue.">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li></ol>

Eine wachsende Anzahl von Literatur betont die Rolle von Myelin in der Gehirnfunktion 13,16,21,28. Darüber hinaus wissen wir, dass sich die Myelinisierungsdicke und das Myelinisierungsmuster bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (überprüft in29), Alterung (überprüft in 30), Autismus20, <sup class="xre...

Aktionspotentiale sind die grundlegende Informationseinheit im Gehirn, und die Ausbreitung des Aktionspotentials durch Axone bildet eine Säule der Informationsverarbeitung 1,2,3. Neuronen erhalten typischerweise afferente Eingaben von mehreren anderen Neuronen und integrieren diese Eingaben innerhalb eines bestimmten engen Zeitfensters 4,5. Daher haben die Mechanismen der potenziellen Ausbreitung von Axonen eine signifikante Aufmerksamkeit von Forschern erhalten.
Bei der Ausbreitung durch ein Axon wird ein Aktionspotential wiederholt entlang des Axons regeneriert, um eine zuverlässige Ausbreitungzu gewährleisten 6. In den meisten Neuronen von Kieferwirbeltieren (Gnathostomen) sind die Axone von einer Hülle aus Myelin umgeben, einer lipidreichen Substanz, die von nahe gelegenen Oligodendrozyten oder Schwann-Zellen produziert wird, die Arten von Gliazellen sind (überprüft in 7,8). Diese Myelinhülle isoliert das Axon elektrisch, reduziert seine Kapazität und ermöglicht eine effiziente, schnelle und mit geringerem Energieverbrauch ausbreitende Ausbreitung des Aktionspotentials. Myelin bedeckt das Axon nicht gleichmäßig, aber es umhüllt das Axon in Segmente, die kurze Lücken zwischen ihnen haben, die sogenannten Knoten von Ranvier (überprüft in 9,10). Sowohl die Myelinisierungsdicke, die das Niveau der elektrischen Isolierung eines Axons steuert, als auch der Abstand der Knoten von Ranvier, die die Frequenz steuern, mit der Aktionspotentiale entlang eines Axons regeneriert werden, beeinflussen die Geschwindigkeit der Ausbreitung des Aktionspotentials (überprüft in11).
Es gibt eine große Menge an Literatur, die darauf hindeutet, dass die Myelinisierungsdicke die Geschwindigkeit der Aktionspotentialausbreitung in den Axonenbeeinflusst 12,13,14. Darüber hinaus können Veränderungen in der Axonmyelinisierung zu einer Reihe von ZNS-Defizitenführen 15,16,17,18,19,20,21. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Schwerpunkt vieler Forschungsbemühungen auf der Messung und Charakterisierung der Axonmyelinisierung liegt. Messungen der Myelindicke wurden am häufigsten mit Elektronenmikroskopie durchgeführt, einer Technik, die eine erhebliche Menge an Gewebevorbereitung erfordert und in Kombination mit Immunhistochemie schwierig zu verwenden ist. Es gibt jedoch auch eine schnellere und einfachere Technik zur Messung der Axonmyelinisierung, die auf der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) basiert. Ein CARS-Laser kann auf verschiedene Frequenzen abgestimmt werden, und wenn er auf Frequenzen abgestimmt ist, die geeignet sind, Lipide anzuregen, kann Myelin ohne zusätzliche Markierungen abgebildet werden22. Die Lipidbildgebung kann mit der Standard-Immunhistochemie kombiniert werden, so dass Lipide zusammen mit mehreren Fluoreszenzkanälen abgebildet werden können23. Die Bildgebung der Myelinisierung mit CARS ist signifikant schneller als die Elektronenmikroskopie und hat eine Auflösung, die, wenn auch niedriger als EM, ausreicht, um selbst kleine Unterschiede in der Myelinisierung in der gleichen Art von Axonen zu erkennen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthetic:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5&#34;</td>
			<td>Exel int</td>
			<td>260040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal +</td>
			<td>Vortech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors - 8mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF994 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip, 23 GA x 1&#34;</td>
			<td>BD precision glide</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pump with variable flow or equivalent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumphosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL vial with 4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>230331000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of fine (Graefe) tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shallow glass or plastic tray, approximately 10&#34; x 10&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, plant</td>
			<td>RPI</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>well plate</td>
			<td>Alkali Sci.</td>
			<td>TPN1048-NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1n 1,000 mL of Millipore H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered (PB):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosohate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma life science</td>
			<td>A2153-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>s271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>x100-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nissl 435/455</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARS:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APE&#160;picoemerald laser</td>
			<td>Angewandte Physik &#38; Elektronik&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (420-520 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ470/100m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filter (500-530 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ515/30m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bandpass filters (640-680 nm)</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>HQ660/40m-2P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Transfer pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 565 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>565dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic longpass 585 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>585dcxr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic shortpass 750 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>T750spxrxt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)</td>
			<td>Allen Scientific Glass Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton shortpass emission filter 680 nm</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>ET680sp-2p8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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coherent anti-stokes raman spectroscopy (cars) application for imaging myelination in brain slices

Die kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) ist eine Technik, die klassischerweise von Chemikern und Physikern eingesetzt wird, um ein kohärentes Signal von Signaturschwingungen von Molekülen zu erzeugen. Diese Schwingungssignaturen sind jedoch auch charakteristisch für Moleküle in anatomischem Gewebe wie dem Gehirn, was sie zunehmend nützlich und anwendbar für neurowissenschaftliche Anwendungen macht. Zum Beispiel kann CARS Lipide messen, indem es chemische Bindungen innerhalb dieser Moleküle spezifisch anregt, was die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Gewebes ermöglicht, wie Myelin, das an der Neurotransmission beteiligt ist. Darüber hinaus kann CARS im Vergleich zu anderen Techniken, die typischerweise zur Quantifizierung von Myelin verwendet werden, auch so eingerichtet werden, dass sie mit immunfluoreszierenden Techniken kompatibel sind, was eine Co-Markierung mit anderen Markern wie Natriumkanälen oder anderen Komponenten der synaptischen Übertragung ermöglicht. Myelinisierungsveränderungen sind ein inhärent wichtiger Mechanismus bei demyelinisierenden Krankheiten wie Multipler Sklerose oder anderen neurologischen Erkrankungen wie dem Fragile-X-Syndrom oder Autismus-Spektrum-Störungen ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CARS auf innovative Weise eingesetzt werden kann, um drängende Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten und Beweise für die zugrunde liegenden Mechanismen im Zusammenhang mit vielen verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu liefern.

Einer der größten Vorteile der CARS-Mikroskopie gegenüber anderen Techniken ist die Kompatibilität mit der Fluoreszenzbildgebung23. Abbildung 1 zeigt die CARS-Spektren im Vergleich zu Nissl, markiert mit Immunfluoreszenzmarker, die eine geringe / keine Überlappung der Spektren aufweisen. Abbildung 2 zeigt den Laseraufbau für CARS in Kombination mit konfokaler Mikroskopie. Abbildung 3 zeigt zwei repräse...

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Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Die Visualisierung der Myelinisierung ist ein wichtiges Ziel für viele Forscher, die das Nervensystem untersuchen. CARS ist eine Technik, die mit der Immunfluoreszenz kompatibel ist und nativ Lipide in Geweben wie dem Gehirn abbilden kann, die spezialisierte Strukturen wie Myelin beleuchten.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Diese Technik kann Myelin in Hirngewebeschnitten abbilden. Myelinisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Leitung von Aktionspotentialen und das Verständnis von Myelin wird uns helfen, die Gehirnfunktion zu verstehen. Der Hauptvorteil der CARS-Technik gegenüber beispielsweise der Elektronenmikroskopie besteht darin, dass CARS eine lichtmikroskopische Technik ist und leicht mit anderen Fluoreszenzbildgebungsverfahren, wie sie in der Immunhistochemie verwendet werden, kombiniert werden kann.Mehrere Erkrankungen sind auf Veränderungen der Myelinisierung zurückzuführen, zum Beispiel Multiple Sklerose, Alterung und Autismus. Das Verständnis dieser Veränderungen wird uns helfen, die zugrunde liegenden medizinischen Bedingungen zu verstehen. In diesem Fall ist der CARS-Laser darauf abgestimmt, Lipide oder insbesondere CH2-Bindungen abzubilden.Im Gehirn ist die größte Quelle von Lipiden Myelin. Dies ist also eine Technik, um Myelin im Hirngewebe abzubilden. Es sollte möglich sein, die gleiche Methode für andere Gewebearten zu verwenden, wenn die Bildgebung von Lipiden von Interesse ist.Das Tuning und Ausrichten des CARS-Lasers erfordert erhebliches Fachwissen und wird am besten von einem Laser- oder Lichtmikroskopie-Experten durchgeführt. Nachdem Sie die Gewebe wie im Manuskript beschrieben vorbereitet haben, färben Sie frei schwebende Abschnitte für Nisel- und Antikörpermedien, um Zellkörper sichtbar zu machen, und inkubieren Sie die Schnitte dann auf einem Standard-Laborschüttler für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bevor Sie die Proben zum Mikroskop bringen, schalten Sie den CARS-Laser ein und erwärmen ihn für mindestens eine Stunde, richten Sie dann den CARS-Laser aus, indem Sie die Pumpe räumlich überlappen und Laserstrahlen schüren, und passen Sie die Verzögerung zwischen den beiden Laserstrahlen an.Färben Sie die Kondensatoroptik und die Membran des Mikroskops für die vorwärts gerichtete CARS-Bildgebung und stellen Sie dann das externe Periskop so ein, dass die räumlich überlappenden zwei Laser auf die scannenden Kopfspiegel des Mikroskops zentriert werden. Für beste vorwärts gerichtete CARS nicht gescannte Erkennung. Stellen Sie sicher, dass der Kondensator farblich angelockt ist.Für Immunfluoreszenz, konfokale Bildgebung und CARS-Bildgebung können Sie den CARS-Laser sowohl mit nicht descannten Forward- als auch mit epi-CARS-Detektoren ausstatten, indem Sie ein konfokales Mikroskop mit sichtbaren Lasern für die Fluoreszenzbildgebung integrieren. Legen Sie nun die Abschnitte in eine Kulturschale mit einem Deckboden und PBS, um das Austrocknen des Gewebes zu vermeiden. Verwenden Sie auch ein Glasgewicht, um das Gewebe in der Nähe des Abdeckstreifens zu halten.Legen Sie über die grafische Benutzeroberfläche die Bilderfassungsparameter für die konfokale Bildgebung von Autos und Raketenfluoreszenz fest. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch, fokussieren Sie die Probe und nehmen Sie die Bilder auf. Die Spektren von CARS reichen von 640 bis 660 Nanometern und es scheint keine Überlappung der Spektren mit niselmarkierten Immunfluoreszenzmarkern zu geben, was darauf hindeutet, dass CARS-Signale mit immunfluoreszierenden Signalen verwendet werden können.Nisel wurde verwendet, um die Zellkörper mongolischer Rennmaus- und Mausgehirne zu visualisieren, und CARS-Bildgebung wurde verwendet, um die Myelinscheide zu visualisieren, was darauf hindeutet, dass diese Technik artenübergreifend verwendet werden könnte. Beide Bildgruppen zeigen einen Ausschnitt des medialen Kerns des Trapezkörpers im Hirnstamm. Die Auflösung von CARS ist geringer als beim Elektronenmikroskop und liegt in der Größenordnung von mehreren hundert Nanometern.Die Bilder können mit Standard-Bildanalysesoftware wie ImageJ analysiert werden, um die interessierenden Parameter zu quantifizieren, z. B. Myelindicke oder -länge.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...